Сыновья экс-футболиста «Зенита» Мигеля Данни подписали контракты с «Маритиму». Они мечтают о «Зените»
Атакующий полузащитник Мигель Данни – один из сильнейших легионеров в истории «Зенита» и всего российского футбола. Португалец провел в России 12 лет (девять из них – в Санкт-Петербурге), забил больше полусотни мячей и завоевал восемь трофеев. Здесь же он воспитал двоих сыновей – Франсишку и Бернарду – которых некоторые фанаты «Зенита» помнят еще пухлощекими школьниками.
В 2021-м парням исполнилось по 17 лет, в августе они подписали первые профессиональные контракты. Талант близнецов приметили в «Маритиму», в академии которого они занимались почти весь период после отъезда Данни из России в 2017-м. «Для меня отец – кумир, надеюсь на карьеру и успехи, как у него», – отдал должное папе после подписания официальных документов Франсишку. Данни действительно очень много вложил в парней: для них он лучший друг, тренер и самый преданный фанат.
Чемпионат Португалии
17-летний сын Данни вызван в юношескую сборную Португалии
16/12/2021 В 09:13
Близнецы родились за год до переезда Данни в Россию и здесь сделали первые шаги к цели.
«Мы мечтаем быть профессиональными футболистами. Нападающими», – рассказывали они в 2013-м официальному сайту «Зенита». В те годы они уже были лидерами команды 2004 года рождения с задатками звезд: импровизировали в духе отца, крутили защитников и много забивали. Например, в 2015-м Бернарду с семью мячами стал лучшим бомбардиром турнира HJK CUP 2015 в Финляндии, а также забил больше всех в первенстве Петербурга. Все это под присмотром самого Данни, который, по словам директора Академии Владимира Казаченка, не пропускал ни одной игры сыновей.При такой любви и интересе Мигеля к футбольной судьбе детей, его соцсети превратились в алтарь для поклонения их успехам. Последние пять лет он выкладывает туда фото и видео самых ярких моментов с участием Бернарду и Франсишку. Хайлайты подтверждают: парни готовятся стать большими игроками в будущем. Возможно, даже в составе «Зенита» и сборной России.
Да, такой расклад вполне реален. В 2016-м близнецы, которые все сознательное детство провели в России и идеально знают русский язык, получили гражданство РФ.
«За какую команду хотели бы играть, когда станем взрослыми игроками? «Зенит», только «Зенит», – в шутку, а может быть и нет, отвечали ребята. Вероятно, ради будущего сыновей в составе сине-бело-голубых Данни цеплялся за продление контракта в последние годы перед уходом в «Славию»: португалец уже не тянул из-за возраста и травм, но оставался, чтобы Франсишку и Бернарду подольше обучались в академии «Зенита».
Русские португальцы всегда признавались в любви к России и вынужденно сменили клуб следом за отцом. Поэтому трансфер в Чехию не доставил им удовольствия, хотя это не мешало показывать высочайший уровень игры и взаимопонимания. Парни в лучших традициях большинства португальских футболистов обладают фантастической техникой.
После сезона в «Славии» близнецы уехали в Португалию и снова почувствовали себя дома, когда Данни подписал последний в карьере контракт – с «Маритиму». Там они тренировались в течение трех лет, пока в 2020-м не появилась информация о камбэке в «Зенит».
Боссы сине-бело-голубых спохватились и решили оформить две сделки в одной: пригласить Данни на должность в клубе (по данным «Совспорта», обсуждались позиции в академии и в менеджменте), с которым в клуб должны были вернуться его сыновья.
«Если я вернусь в клуб, то Бернанду и Франсишку тоже перейдут в «Зенит». Мы уже говорили об этом», – рассказывал сам Мигель. Получается, переговоры действительно велись, но в итоге этого не произошло.
Теперь же переход близнецов в «Зенит» невозможен. По крайней мере, в ближайшие годы. Несмотря на теплые воспоминания о России (несколько лет назад говорили, что в Северной столице им даже комфортнее, чем на родине), сейчас Франсишку и Бернарду сконцентрированы на «Маритиму». «Я очень рад возможности, которую дал мне клуб, и надеюсь, что однажды смогу помочь основной команде», – мечтает Бернарду.
Возможно, спустя время братья все же приедут в РПЛ и выйдут на поле в синей футболке, чтобы продолжить красивую историю семьи Данни в России.
Чемпионат России
Данни может пропустить 14 месяцев
09/05/2016 В 20:39
Чемпионат России
«Зенит» выпустил видео, на котором Данни стрижет людей
18/11/2015 В 20:07
Мигель Данни — биография и семья
Если ты готов сидеть на скамейке, ты не футболистМигель Данни и Бруну Алвеш с дружеским визитом посетили студию «Радио Зенит». Пока Алвеш разглядывал постеры на стенах, Данни отвечал на вопросы болельщиков и Федора Погорелова: о плевке в судью, мадере и Мадейре, махачкалинском беспределе и стоимости своих услуг в качестве парикмахера.
Хотелось бы услышать оценку того, в каком настроении «Зенит» вышел из мини-отпуска. Каково ваше самочувствие, не жарко ли вам?
— Команда уверена в себе, она усиленно работает, постепенно набирает силы.
Очень хорошо, что мы выиграли две последние игры. Что касается жары, то даже при такой погоде работа протекает в обычном ключе, и с каждым днем мы чувствуем себя все более надежно.
Мне сердце подсказывает, что и в первой части сезона сы чувствовали себя уверенно, но при этом команда все равно не добирала много очков, а в апреле вообще сыграли без побед. Изменилось ли что-то кардинально за эту месячную паузу?
— Да, это правда, в первых играх сезона нам не хватало удачи. Плюс сейчас на нас соперники настраиваются как на действующих чемпионов, поэтому нам приходится играть все матчи на высоком уровне интенсивности. Но я уверен в команде, скоро все нормализуется. Мы на пять очков отстаем от ЦСКА и следующий матч играем как раз с ними. Еще достаточно много времени до января, до плей-офф чемпионата, и я уверен, что мы сможем правильно настроиться и защитить свой титул. Это сложная задача, но я уверен, что у нас все получится.
Мигель, вы говорили, что были бы не против, если бы ваши сыновья играли за «Зенит».
Довольны ли вы их успехами? Какой турнир детского футбола в Португалии вы спонсировали, когда были в отпуске?
— Мои сыновья впервые принимали участие в детском турнире за пределами Мадейры, это была их первая поездка на соревнования с острова на материк. В итоге их команда заняла второе место, в финале проиграв соперникам в серии пенальти. Но я очень горд за всех ребят, игравших на этом турнире, он прошел очень достойно. Вскоре, когда Франсишку и Бернарду вернутся из Португалии в Петербург, они приступят к занятиям в Академии «Зенита». Я уже поговорил с тренерами, которые отвечают за детей 2002 года рождения и, несмотря на то, что мои сыновья родились в 2004-м, они будут играть за команду старшего возраста. Сами дети ждут с нетерпением начала занятий, они полны энтузиазма, хотят поскорее потренироваться с новыми друзьями и партнерами по команде.
А кто тренер 2002 года?
— Максим Мосин.
Жаль, что не Константин Коноплев: он бы научил жестко играть в кость.
Его болельщики «Зенита» таким запомнили. Слушатель нам пишет: «Остерегайтесь Березуцкого, он в последнее время крайне неадекватен».
— Когда я на поле, я никого не боюсь. Я выхожу играть в футбол, а не боксировать. Если против меня будут нарушать правила, то на поле есть судья, который даст свисток. Я уже играл против Березуцкого не раз, надеюсь, что и в субботу никаких дополнительных проблем такого характера у меня не возникнет.
(вопрос слушателя) Вы отличный парикмахер. Алвешу очень идет новый имидж. Сколько стоит прическа от Мигеля Данни?
— Для Бруну – бесплатно.
Мигель Данни в центре и Мигель Данни на фланге – два разных футболиста. Где вам играть комфортнее?
— Мне больше нравится играть в середине поля. Но в нашей команде очень много хороших футболистов, которые могут играть центральных хавбеков, поэтому тренер решает ставить меня на фланг. Я буду стараться делать на этой позиции все, на что я способен.
Много вопросов задают про русский язык, но вы понимаете, что если переводчик молчит, а Мигель уже начинает отвечать, то это значит, что мы говорим практически на одном языке.
После перерыва в чемпионате «Зенит» много забивает головой: Файзулин — два мяча, Вы — один. Специально тренировали?
— Наша команда старается играть в атакующий футбол, что-то изобретать впереди. Действительно, и я, и Файзулин достаточно редко забиваем головой, но я рад тому, что это случилось. Мы будем стараться продолжать в том же духе.
Насколько сказывалась в первом матче после перерыва – с «Химками» – физическая усталость?
— В первые двадцать минут я уже был мертвый. Было очень жарко, дождь, душновато. Но затем у нас получилось взять мяч под контроль, мы старались сохранить появившуюся разницу в счете и довести матч до победы. При постоянном контроле мяча нам не приходилось слишком много бегать, слава Богу, потому что на тот момент я был не в лучших своих кондициях.
Лично к вам вопросов по физической форме минимум. Но в первой части сезона – с февраля по июнь – болельщики пика формы у команды не увидели. Особенно когда пошли игры через два дня на третий: «Зенит» просто встал.
Насколько серьезно вы работали над физикой во время трехнедельного сбора в Петербурге?
— Мы увидели, что наша главная цель все больше удаляется от нас. Все игроки собрались, мы стали еще больше отдаваться работе, еще больше бегать, еще больше сконцентрировались, ведь именно из-за потери концентрации в конце матча мы потеряли несколько очков в чемпионате. Работу по физической подготовке мы проделываем ту же самую, что и в течение первой части первенства. Вопрос только в том, как все это интерпретируют игроки, сама же работа остается прежней.
Вы видели шарф «Зенита», оставленный болельщиками на Мадейре, в ресторане вашего папы?
— Да, папа мне уже рассказал про него.
Португалия и Россия попали в одну группу, но в Бразилию поедет кто-то один. С какими чувствами вы ждете матчей с участием Кержакова, Аршавина, Данни, Зырянова, Широкова, Алвеша, Анюкова и Малафеева?
— Сначала нужно попасть в состав. Может быть, к тому времени Данни уже не будет играть в сборной Португалии.
Я уверен, что именно Россия и Португалия разыграют первое место в группе. Думаю, обе эти команды попадут на чемпионат мира, пусть и через стыковые игры. Если я еще буду играть за Португалию, будет очень приятно приезжать в Россию и сражаться против вашей сборной, против многих моих партнеров по команде. Это точно будет интересно.
Вы видели матч, в котором Россия получила семь голов?
— Смотрел по телевизору. Это было лишь один раз и, хотя и выбивается из обычного хода вещей, уже в прошлом. В данный момент, думаю, такой результат невозможен. Сейчас и Россия, и Португалия – прекрасные команды, которые играют очень качественно, в которых собраны сильные исполнители. Многие футболисты этих сборных выступают за ведущие клубы Европы, и матчи между ними, мне кажется, будут очень упорными.
(вопрос слушателя) Дик Адвокат – тренер сборной Португалии. Это реально?
— Дик – тренер, которого я очень хорошо знаю. Именно он привел меня в «Зенит», с ним мне очень нравилось работать.
Я думаю, вряд ли Адвоката можно будет увидеть на тренерском мостике нашей сборной, потому что сейчас у нас очень хороший тренер Паулу Бенту, который принял команду в сложный период и сумел поставить ее на ноги. Бенту придал сборной новый импульс, и сейчас мы на первом месте в отборочной группе. В общем, дела идут хорошо, и он, надеюсь, еще долго будет работать главным тренером национальной сборной.
(вопрос слушателя) После матча с нальчикским «Спартаком» к команде накопилось много вопросов. «Зенит», играя такие матчи, экономит силы и пытается выиграть на классе или объективно не может сейчас показывать хорошую игру?
— Не забывайте, мы заработали три очка, это сейчас самое главное. Было очень много матчей, в которых мы играли лучше соперника, но не добивались результата. Например, игра против того же Нальчика на выезде, когда мы создали намного больше моментов, но не смогли довести матч до победы. Я не знаю, что лучше для болельщиков: чтобы мы играли хорошо, но были далеко от первого места, или чтобы мы выигрывали и были, как сейчас, чемпионами.
Болельщикам, естественно, хочется, чтобы каждый матч заканчивался со счетом 4:0.
— Это непросто, потому что все соперники играют против нас с повышенным настроем, это нужно понимать. Они выходят на матч против действующего чемпиона, поэтому играют закрыто, на контратаках, стараются сделать максимум для того, чтобы победить. Постоянно с крупным счетом выигрывать невозможно, но мы стараемся. Опять же: выигрываешь ты 4:0 или 1:0, за это все равно дают одинаковое количество очков.
Показалось, что вы очень близко к сердцу восприняли замену в матче против «Спартака-Нальчика». Со стадиона пахнуло Крижанацом.
— Это нормально, такое случается именно со мной. Думаю, это произойдет еще не раз, потому что я из тех футболистов, которым хочется играть, проводить на поле все 90 минут. Да, действительно, у меня многое не получалось в этой игре. Я старался исправиться, но тренер решил меня заменить. Это его право. Но разве можно называться футболистом, если ты готов оставаться на скамейке? Я всегда буду недоволен, если меня заменяют.
Вам показывают распечатки ТТД после игры? Мол, здесь брака в обводке многовато, надо над этим поработать.
— Я сам знаю, когда я играю хорошо, а когда матч мне не удается. Мне не нужно, чтобы тренеры показывали раскладку технико-тактических действий, считали, сколько мячей я потерял. Если я играю плохо, то сам об этом знаю. Я сам для себя главный критик.
(вопрос слушателя) Зачастую ваша магия заканчивается у штрафной, хотя в центре поля вы постоянно делаете из соперников клоунов.
— Бывают моменты, когда ты стараешься все сделать правильно, но не получается. Допустим, я обыгрываю соперника, прохожу в штрафную и не попадаю по воротам, но это не значит, что я заранее решил промазать. Конечно, я хотел забить, просто не удалось. Не может же получаться абсолютно все. Если бы я был идеальным футболистом, возможно, я бы уже играл не за «Зенит». Честное слово, я всегда играю на максимуме возможностей.
Тяга к передачам внешней стороной стопы – сознательное пижонство?
— Это всегда зависит от моей позиции на поле, от игрового эпизода.
Если я даю пас правой ногой внешней стороной стопы, это значит, что в тот момент именно такой способ выглядит наиболее удобный. Вместо того чтобы отдавать передачу левой ногой – а это мое слабое место – я лучше сделаю пас внешней стороной стопы и буду уверен в результате.
Слушатель спрашивает, какой портвейн везти из Португалии.
— К сожалению, я не пью портвейн и не знаю ни одной марки.
Сразу оговорюсь: наше радио за спортивный образ жизни. Слушатель предлагает вам бутылку мадеры, если забьете гол в ворота ЦСКА.
— Самое важное, чтобы я действительно забил и помог команде. Если и правда получится отличиться, я готов подарить бутылку болельщику. Сам я, как уже говорил, не пью. Тем более, живу на Мадейре, так что, сами понимаете…
Болельщики просят вас с Алвешем разучить какой-нибудь танец и исполнять его после забитых мячей. Бразильцев и африканцев у нас нет, вся надежда на вас.
— Празднование гола всегда зависит от конкретного момента, от того, как себя чувствует игрок.
Если вы хотите посмотреть такое зрелище, лучше сходить в театр. Когда футболист забивает гол, его переполняют эмоции, наружу вырывается то, что сидит у него внутри. Если он рассержен, скажем, он может вообще не праздновать, просто развернуться и пойти к центру поля.
Как Кришито показывает себя на тренировках? У всех нападающих уже отбиты ноги?
— Этот игрок нам очень поможет. Надеюсь на его дебют уже в матче с ЦСКА. Доменико – качественный мастеровитый футболист, он выступал в очень сложном итальянском чемпионате, его постоянно вызывают в национальную сборную. В общем, сейчас я о Кришито могу сказать только хорошие слова.
Получали ли вы когда-нибудь прямую красную карточку за грубую игру?
— Нет, я только один раз был удален с поля. Это было несколько лет назад: я тогда еще выступал за «Динамо» и во время матча плюнул в судью.
В Махачкале был прекрасный футбол, а после него состоялось возвращение в 90-е: ОМОН на секторе и прочие прекрасные вещи.
Показалось, что даже тертые российские игроки основательно удивились тому, что происходило на трибунах. Как вы восприняли эту ситуацию? Кстати, многие болельщики по ходу этого эфира прислали вам лично и всей команде слова благодарности за то, как вы повели себя в тот момент.
— С моей точки зрения, случившееся – ужасно. Мы пошли туда, чтобы постараться как-то повлиять на ситуацию, поговорить с полицейскими. Хотели, чтобы они прекратили эту глупость. На футболе бывает, что болельщики дерутся друг с другом, но там не было ничего подобного. Полиция, ОМОН просто били болельщиков, причем очень жестоко и сильно. К тому же там были женщины. Смотреть на это было очень больно, и нет ничего удивительного в том, что мы отреагировали. Таких ситуаций не должно происходить, это было за рамками разумного.
Сейчас пытаются вывести ОМОН за пределы стадиона. Правильное решение?
— Я думаю, что полиция должна присутствовать на стадионе. Но она должна охранять людей, а не бить их.
В Махачкале как раз случилось последнее, и это было большой ошибкой. Если дерутся болельщики, то полицейские должны помочь успокоить ситуацию, но им ни в коем случае нельзя применять силу и избивать людей.
Необходим ли закон о болельщиках? В Англии он есть, а у нас поведение на стадионе не регламентировано ничем. Именно поэтому и возникают ситуации, когда взводный в Махачкале закипает.
— Все говорят об английских хулиганах, но вы посмотрите, что происходит на их аренах! Всегда полный стадион, абсолютный порядок и ни одного полицейского, только стюарды. При этом сложно вспомнить какие-то случаи применения насилия. Думаю, нам всем нужно стремиться именно к этому.
Перевернем эту страницу. О чем вы так яростно спорили с Роберто Карлосом в Махачкале? Даже Лазовичу пришлось вмешаться.
— Ничего особенного не произошло. В тот момент каждый из нас занимался своим делом. Он капитан, поэтому пошел разговаривать с судьей, а я пытался его успокоить.
Вообще-то мы с Роберто большие друзья и прекрасно общаемся, но в игре случается всякое.
Пенальти был?
— Конечно.
Какую последнюю техническую новинку вы купили?
— Ничего особенного не покупаю, стандартный набор.
За то время, что вы играете в России, у вас ни разу не менялась прическа. Ким дон Чжин ходил в парикмахерскую только в Корее. Вы в России тоже не стрижетесь?
— На самом деле, я уже стригся в Питере. Просто это мой стиль, я стараюсь ему следовать. Может быть, когда-нибудь мне придет в голову идея побриться налысо, и я это сделаю. Но пока меня все устраивает.
Часто ли зенитовцы заключают пари?
— Нет, все, что касается денежных ставок, не для меня.
Как вы отдохнули во время летнего перерыва?
— (по-русски) Был в Португалии: ездил на остров Порто-Санто. Другой, не Мадейру.
ЦСКА – очень неприятная команда. Мы с ними сыграли очень хороший вязкий матч в чемпионате и по всем статьям проиграли в кубковой игре.
Расскажите о ваших ощущениях перед игрой за шесть очков.
— Я думаю, это будет матч, который хотят выиграть обе команды. И «Зенит», и ЦСКА покажут, что они из себя представляют. Обе команды сильны, но если мы выиграем, это приблизит нас к нашей цели. Если же победу одержит ЦСКА, это не станет крахом всех надежд, потому что впереди очень много матчей. Ощущения такие же, как перед всеми играми. Поедем в Химки сконцентрированными и будем работать.
(вопрос слушателя) Что у вас за часы? Вы их подбираете под настроение? Сколько их у вас?
— Мало у меня часов.
Мало – это две пары, три, десять?
М.Д. | Не считал, но их точно не много.
Понятно, дарите Данни часы. Следующий вопрос: Вагнер Лав или Думбия?
— Это очень классные игроки. Вагнера Лава я очень хорошо знаю. Это сильный и техничный футболист. Думбия быстр, он получает преимущество за счет своей скорости. Но у нас качественные игроки в обороне, я надеюсь, мы сможем с ними справиться.
Я говорил с Игнашевичем, он признался, что главная задача ЦСКА – доставить мяч до Думбия и Вагнера. Потому что как только мяч будет в фазе атаки, эти парни сделают свое черное дело.
— Согласен с Игнашевичем. Эти игроки, безусловно, способны влиять на результат матча. ЦСКА – хорошая команда, у них неплохая оборона, они здорово контролируют мяч, но и у нас есть свои сильныекачества, и мы готовы к этому противостоянию.
Удаление Набабкина в матче с «Краснодаром» – это хорошо для «Зенита»?
— Я думаю, что игра получится сложной, кто бы ни вышел у ЦСКА на этой позиции. Если Набабкин играл в основном составе, значит, он был лучшим. Сейчас игрок, который займет его место на поле, должен будет доказать, что он тоже может выступать в основе. И кто бы это ни был, я думаю, у этого футболиста будет желание продемонстрировать, что и он чего-то стоит.
(вопрос слушателя) На каком стадионе вам больше всего нравится в России?
— Помимо «Петровского» мне нравится играть на «Локомотиве» и в Химках.
Это стадионы европейского уровня.
Все отмечали, что до того ужаса, который начал творить ОМОН, в Махачкале была отличная футбольная атмосфера.
— Да, я уже говорил, что когда мы приехали играть в Махачкалу, это стало приятным сюрпризом: хороший стадион, атмосфера, болельщики.
Какую последнюю татуировку вы себе сделали? Какая на подходе?
— Сейчас я планирую доделать татуировку на правом плече.
Три золота и три травмы: Данни покинул «Зенит» — Спорт
«С глубокой грустью я вынужден сообщить о своем уходе из «Зенита», — написал Данни в Instagram. — Я провел девять невероятных лет в этой команде, я играл всегда с большим желанием, отдачей, любовью и страстью, носил с честью футболку клуба, но я уважаю решение клуба не продлевать со мной контракт. Я благодарю за ту любовь, которую всегда получал в Санкт-Петербурге, спасибо всем за это!»
На эту тему
За девять лет в клубе Данни три раза выигрывал чемпионат России и пережил три тяжелейшие травмы колена.
Как пояснил ТАСС спортивный директор «Зенита» Константин Сарсания, решение не продлевать контракт с Данни принял новый тренерский штаб клуба во главе с Роберто Манчини. «Все же игрок не молодеет, плюс были травмы. У нас был теплый разговор с Данни, я объяснил ему позицию тренеров. Данни отнесся к этому решению с пониманием», — сказал Сарсания.
Третье прощание
28 мая 2015 года на специальной пресс-конференции португалец заявил, что покидает «Зенит», поскольку не смог договориться о продлении контракта. Однако буквально через неделю клуб объявил о заключении нового двухлетнего соглашения с футболистом.
Данни получает травму в матче против «Спартака»
© Михаил Разуваев/»Зенит»16 апреля 2016 года во время матча со «Спартаком» Данни получил разрыв крестообразных связок колена. Одна из самых тяжелых травм в спорте свалилась на португальца уже в третий раз.
Разгромная победа над принципиальным соперником отошла на второй план на фоне плачущего на скамейке запасных Данни. Позже португалец признавался, что в тот момент земля уходила из-под его ног и он всерьез задумывался о завершении карьеры. Но все же Данни нашел в себе силы в третий раз пройти длительную реабилитацию и вернулся на поле.
Динамовская татуировка
В Россию Данни приехал в 2005 году. Его появление в «Динамо» прошло незаметно, потому что его затмили более именитые новички — Дерлей, Тьяго Силва, Нуну Фрешо и многие другие. Всего за два трансферных окна бело-голубые подписали десять португальских футболистов, однако настоящую пользу клубу принес только Данни. В первый же год голосованием болельщиков он был признан лучшим игроком команды, а через год португалец получил это звание вместе с Игорем Семшовым и Дмитрием Хохловым. Этот треугольник составлял одну из сильнейших средних линий в чемпионате России того времени.
За три с половиной года Данни провел за бело-голубых 113 матчей в чемпионате и Кубке России и забил 21 мяч.
Среди них много по-настоящему эстетских, как, например, в ворота «Ростова» в сезоне-2007.
‘fcdincom/YouTube’
Об отношении Данни к клубу можно судить по татуировке — на правом предплечье он набил фирменную динамовскую «Д». Летом 2008 года стало ясно, что удержать свою главную звезду руководство «Динамо» не сможет. «Зенит» вышел с предложением, от которого нельзя было отказаться — €30 млн, рекордная сумма для внутренних переходов в России. Позже Данни говорил, что татуировка символизирует не «Динамо», а просто первую буква его имени. Как бы то ни было, «Зениту» и Петербургу португалец отвел больше места на своем теле. Два года назад во время того самого преждевременного прощания он набил на левом бицепсе разводной мост, один из главных символов города.
Супергол в Суперкубке и травмы
Дебют Данни в «Зените» вышел фееричным. Не успев толком потренироваться в новой команде, он забил победный мяч в ворота «Манчестер Юнайтед» в матче за Суперкубок Европы.
В мае 2009 года случились первые «кресты». В безобидной ситуации во время выполнения беговых упражнений он почувствовал резкую боль в колене — разрыв передней крестообразной связки правого колена. Данни не играл до конца года.
‘donthavetv/YouTube’
2010 год — один из самых удачных в карьере Данни. Избежав травм, португалец стал чемпионом и обладателем Кубка России, забил 12 мячей за сезон, а также был признан лучшим игроком года по версии еженедельника «Футбол» и лучшим иностранцем по версии РФС.
Вторые «кресты» случились на тренировке на сборах 5 февраля 2012 года. Данни не играл восемь месяцев, в мае «Зенит» стал чемпионом, а португалец вернулся на поле лишь к ноябрю.
Непросто развивалась карьера Данни и в сборной Португалии. Изначально он стоял перед выбором, так как родился в Венесуэле и имел право играть за эту страну.
На крупных турнирах ему так и не довелось сыграть. Данни провел хороший сезон-2013/14 за «Зенит», но не попал в состав на чемпионат мира в Бразилию. В отборочных матчах на Евро-2016 он играл регулярно, но сыграть во Франции помешали третьи «кресты». Португальцы стали чемпионами Европы без Данни.
За девять лет в «Зените» Данни провел 256 матчей во всех турнирах и забил 72 мяча. В Петербурге он стал трехкратным чемпионом России (2010, 2012, 2015), двукратным обладателем Кубка страны (2010, 2016), двукратным обладателем Суперкубка России (2011, 2015) и обладателем Суперкубка УЕФА (2008).
Время думать о детях
В августе Данни исполнится 34 года. Возраст для футбола внушительный, но вполне позволяющий еще пару лет поиграть на хорошем уровне. Как сообщил Сарсания, у Данни есть предложения от ряда клубов, но вряд ли он продолжит карьеру в России.
На эту тему
Не так давно Данни рассуждал о возможности возвращения в родной «Маритиму». Но есть сдерживающий фактор — дети играют за «Зенит». На Мадейре, безуловно, красиво и тепло, но там 13-летние братья-близнецы Бернанду и Франсишку не смогут получить того будущего, которое для них хочет отец. Данни понимает, что сейчас время думать о них, а не о себе.
А пока нужно красиво проводить Данни. «Мы обязательно устроим хорошие проводы Данни, чтобы у него была возможность проститься с командой, с болельщиками. Мы подберем удобную дату и все это сделаем», — заверил Сарсания.
«Прощание — это не конец, наоборот, это начало нового приключения», — так многозначительно закончил свой прощальный пост Данни.
Мигель Данни: «Причина неудачи — не в отсутствии настроя»
Один из лидеров «Зенита» — полузащитник Данни, как и все игроки команды, был очень расстроен поражением в Томске.
Именно поэтому на обратном пути в Санкт-Петербург он хоть и согласился на интервью для «НЗ», но при этом попросил: пусть оно будет коротким.
— Как вы думаете, почему в Томске случилось именно то, что случилось?
— В какой-то степени нам не повезло. Ведь моменты для того, чтобы забить, у нас были. Причем гораздо более очевидные, чем у «Томи». Но соперник создал у наших ворот две голевые ситуации и обе реализовал, а мы отправили мяч в сетку лишь однажды.
— Согласитесь ли вы с тем, что «Томь» смогла выиграть за счет запредельного настроя? Ведь с тем, что класс «Зенита» выше, чем у сибиряков, наверняка не будет спорить никто…
— Если бы у нас не было желания победить, мы вряд ли создали бы те четыре-пять голевых моментов, что у нас были. И потом, думаю, вы не можете сказать, что мы бегали меньше, чем томичи.
Поэтому, на мой взгляд, причиной поражения стал тот факт, что в тех или иных эпизодах у нас что-то не получалось, а вовсе не отсутствие настроя или желания со стороны «Зенита». Уверен, мы будем продолжать работать над улучшением нашей игры и в итоге вновь станем чемпионами.
— Впереди — матч со «Спартаком», который всегда был для «Зенита» особым, а теперь приобретает еще большую значимость, так?
— Сейчас для нас все игры чрез вычайно важны, а ближайшая со «Спартаком» — одна из них. Нам нужны три очка. А в матче с каким клубом они будут добыты — в данном случае не так важно.
— Этот сезон изначально складывается для «Зенита» не так, как прошлый. Способны ли нынешние трудности закалить команду, сделать ее сильнее?
— Наш класс никуда не делся, и «Зенит» по-прежнему обладает очень качественными игроками. Да, счастье в последнее время не на нашей стороне. Но класс, повторюсь, остается классом. Мы должны продолжать работать дальше — для того, чтобы начать выигрывать и исправить нынешнюю ситуацию.
Для меня пример — Данни
25-летний португальский форвард «Динамо» не провёл в команде и года, но уже вошёл в её историю. Именно он забил первый гол на новом стадионе в Петровском парке. О своей семье, о жизни в Москве, о том, кто в «Динамо» больше всех шутит, о том, как он разминулся с Криштиану Роналду, и о многом другом Мигель Кардозу охотно рассказал Sportbox.ru.
— В наше время португалец в российском футболе — птица редкая. Вы себя чувствуете каким-то особенным?
— Нет. Насколько мне известно, сейчас в Российской Премьер-Лиге португальцев трое — Эдер в «Локомотиве», Рикарду Алвеш в «Оренбурге» и я. А были времена, когда в одном «Динамо» наших насчитывалось с десяток! Но для меня не имеет принципиального значения, сколько здесь земляков. Важно, что я выступаю в сильном чемпионате и в хорошем клубе.
— Вы уже дважды вошли в динамовскую историю. Забили первый гол на реконструированном стадионе клуба (26 мая «Арсеналу») и первый гол сезона-2019/20 в России (12 июля тому же «Арсеналу» в Туле).
Нос не задираете?
— Гордиться — горжусь, но нос не задираю. Такие моменты действительно надолго остаются в памяти и футболистов, и болельщиков. Особенно первый гол на новом стадионе. Благодарен своим партнёрам и, прежде всего, Жоаозинью, который сделал мне голевую передачу в самом начале матча с «Арсеналом». Оставалось только не промахнуться из выгодного положения.
— Кому посвятили этот гол?
— Как и все остальные, моей семье, моему сынишке.
Динамовский стадион внутри похож на «Драгау»
— Как вам новая арена «Динамо»?
— Очень красивая, удобная. Мне кажется, и команда, и болельщики уже успели почувствовать себя дома. У нового стадиона какая-то особая аура, которая придаёт всем нам уверенности. Надеюсь, «Динамо» ждёт много побед на этом поле.
— Можете сравнить динамовский стадион с каким-то другим в Европе?
— Снаружи лично я подобных не видел. Повторяю, он очень красив. Внутри же чем-то напоминает стадион «Драгау», на котором играет «Порту».
Наверное, потому, что у команды с севера Португалии тоже сине-белые цвета.
— Какой стадион из тех, где вам доводилось выходить на поле, очаровал вас больше всего?
— Хороший вопрос! (Задумывается.) В России — точно «Динамо»! А в Европе, скорее всего, «Камп Ноу», где играет «Барселона». Мало того что он огромный, так ещё и неизменно давит на приезжие команды. Конечно, в первую очередь это связано с могуществом каталонского клуба.
— В Лиссабоне на «Эштадиу да Луш», где принимает гостей «Бенфика», есть своя «фишка» — я имею в виду орла, который облетает трибуны перед началом матча и после каждого гола хозяев. У нового динамовского стадиона ещё не появилось какой-то своей традиции?
— Пока нет, но со временем, возможно, появится. А у «Бенфики» такой обычай связан с тем, что орёл — символ клуба, он красуется на его гербе.
— Как вы заметили, было время, когда цвета «Динамо» защищали сразу несколько португальцев. Самые известные из них — Манише, Коштинья, Нуну, Дерлей, Данни… Вы с кем-то из них пересекались на футбольном пути?
— Лично ни с кем из них не знаком, все же они постарше меня.
Но о том, где и как они играли, мне, конечно, известно. Судите сами, Манише после «Динамо» надевал футболки «Челси» и «Интера», Коштинья выступал за мадридский «Атлетико», Дерлей — за «Бенфику» и «Спортинг». И все они достаточно успешно играли за сборную Португалии. Так что любой из этих футболистов — ориентир для меня на футбольном поле.
Все знают, какую прекрасную карьеру в России сделал Данни — сначала в «Динамо», потом в «Зените». Его игра и профессионализм — пример для меня.
«Россия — это другой мир»
— А как вообще у вас возник вариант с продолжением карьеры в нашей стране?
— Год назад с таким предложением ко мне обратился мой агент. В то время я играл в Португалии за «Тонделу». Мы рассмотрели его, взвесили все «за» и «против» и согласились на условия «Динамо».
— Так значит, сомнения у вас всё-таки были? Ведь Россия — это другой мир…
— Нет, сомнений у меня почти не было, а последние исчезли тогда, когда я прилетел в Москву и увидел, что это за клуб, как в нём организовано дело.
А что касается «другого мира», тут вы правы. В России многое непривычно для европейца — и условия жизни, и климат, и язык. Да и вообще Россия огромная, по площади она больше, чем вся остальная Европа. Но после того как я сделал выбор, ни разу о нём не пожалел.
— С кем в «Динамо» вы больше всего общаетесь?
— С Жоаозинью, ведь он тоже говорит по-португальски. Поначалу он мне здорово помог обвыкнуться в новой обстановке. А вообще у нас в «Динамо» целый интернационал — мы общаемся и на испанском, и на английском, и на русском. Главное, что понимаем друг друга. И это совсем не трудно, когда коллектив дружный.
— Когда главный тренер Дмитрий Хохлов говорит по-испански, вам всё понятно?
— Конечно. Кстати, у его помощников тоже хороший испанский. Это во многом облегчает жизнь тем, кто понимает этот язык.
— По-русски хоть немного изъясняетесь?
— Во время игры почти весь подсказ партнёров мне понятен. Но говорить на вашем языке пока не могу.
Я стараюсь, учу отдельные слова, но вы не представляете, как это трудно.
— А как же выкручиваетесь, к примеру, на улице?
— Из того, что написано, не понимаю ничего! (Смеётся.) Помогает то, что я немного говорю по-английски. В большинстве случаев это срабатывает.
— Общаетесь с кем-то из соотечественников в Москве?
— Нет.
«Поджарить кусок мяса — не проблема»
— Вы женаты?
— Да. Но сейчас моя жена Катарина находится в Португалии с маленьким ребенком.
— Сколько ему?
— Четыре месяца.
— А как зовут?
— Сантиагу. Когда сынишке исполнится полгода, они приедут в Москву.
— Ваши родители живут в Португалии?
— Да, в Лиссабоне.
— Они работают?
— Отец на пенсии, а мать — бухгалтер.
— Они уже навещали вас в Москве?
— Приезжали на неделю в конце прошлого чемпионата.
Я попытался показать им весь город — не получилось, уж очень он большой, а народу здесь больше, чем во всей Португалии.
— Вы живёте далеко от центра?
— Да, недалеко от динамовской тренировочной базы, в Новогорске.
— Хорошо знаете нашу столицу?
— Основные туристические места — Красную площадь, Кремль, районы, где расположены хорошие рестораны. В Москве мне очень нравится, здесь много культурных и исторических достопримечательностей, много интересного. Я читал об этом ещё до переезда в Россию.
— По городу перемещаетесь на машине?
— Да, на своей или на такси.
— Лучшее место, где в Москве можно поесть?
— Затрудняюсь ответить. Когда я один, чаще всего готовлю еду сам.
— Любопытно, что можете приготовить, кроме яичницы?
— (Хохочет.) Такие же простые блюда — рис, макароны, поджарить кусок мяса… Между прочим, меню у футболистов не самое разнообразное — нужно следить за питанием.
«Криштиану в «Динамо» не представляю»
— Что вас привлекает, кроме футбола?
— Сколько себя помню, всегда был сосредоточен на футболе. И в школе, и после неё. Именно поэтому и выбрал эту профессию. Я амбициозный человек — хочу добиться как можно более высоких целей в выбранном направлении. И мне кажется, я пока на правильном пути.
— А чего больше всего не хватает из привычной жизни в Португалии?
— Наверное, моря. Без него мою родину представить трудно. Я с детства люблю бывать на пляже, купаться. Но, конечно, не настолько, чтобы без этого жизни не было.
— Будь у вас возможность пригласить в «Динамо» какого-нибудь португальского футболиста, кого бы выбрали?
— Не знаю, в Португалии столько хороших игроков…
— Неужели не Криштиану Роналду?
— А что, его можно? Криштиану неподражаем, он лучший футболист мира, но не думаю, что он поедет в «Динамо». По крайней мере пока клуб не вернётся на ведущие позиции в мировом футболе.
— Вам доводилось тренироваться или играть с ним? Ну, или против него?
— Такая возможность была несколько лет назад, когда я играл в Испании за «Депортиво». Но в заявку на матч с «Реалом» я не попал, поэтому, к великому сожалению, мне не посчастливилось встретиться с ним на поле.
— Понравилось в Испании?
— Очень. Там невероятно сильный, интересный чемпионат, все команды высшей лиги бьются до последнего даже с признанными лидерами. Я провёл в Испании два с половиной года, и у меня остались о ней самые яркие воспоминания.
— Там вам было легче, чем сейчас в России?
— Намного, поскольку Испания очень похожа на Португалию — и языком, и культурой, и кухней. По сути, в Ла-Корунье я даже не менял привычного образа жизни.
«Больше всех в команде шутил Самба Соу»
— Какой вопрос о Португалии вам чаще всего задают в нашей стране?
— О погоде, о морепродуктах, которые подают в португальских ресторанах…
— А в Португалии — о России?
— Однозначно — о русских морозах! (Смеётся.
) Хотя и у меня на родине есть места, где зимой довольно холодно. Но с Россией это не идёт ни в какое сравнение.
— Чем обычно занимаетесь в отпуске?
— Стараюсь как можно больше времени проводить дома с семьёй. В жизни профессионального футболиста не так много таких возможностей, тем более что я играю в далёкой стране.
— И под занавес несколько коротких вопросов о ваших партнёрах по «Динамо». Кто в команде самый надёжный?
— Нелегко выделить кого-то одного. Мы по-настоящему сплочённая команда. У нас на каждого можно положиться.
— Признаться, думал, назовёте капитана команды Антона Шунина…
— Вообще-то вы, наверное, правы. Причём он надёжен не только как хороший вратарь, но и как товарищ. Антон — наш лидер, главная фигура в «Динамо» на поле.
— А кто самый весёлый?
— Таких тоже несколько. К примеру, Самба Соу любил пошутить, поприкалываться.
— Кто всё свободное время «не вылезает» из мобильного или планшета?
— Если честно, не обращал особого внимания.
«Сегодня «Динамо» — мой дом родной»
— Какому клубу отдано ваше сердце?
— На этот вопрос я всегда отвечаю так: тому, который я сейчас представляю. Причём не важно, великий ли это клуб, как «Динамо», или скромный, как «Тондела», за которую я выступал в последнее время в Португалии. Так что сегодня мой родной дом — «Динамо».
— А хотя бы в мечтах у вас есть какой-нибудь более именитый клуб?
— Каждый мальчишка, задумывающийся о карьере футболиста, мечтает о «Реале», «Барселоне», «Манчестере Юнайтед» и других командах такого же высокого уровня. И я не исключение. Но мы же понимаем, что это обычные детские мечты. Сейчас я в «Динамо», в очень известном и сильном российском клубе, где вполне счастлив.
— Кто ваш самый преданный болельщик?
— Моя семья, естественно.
— Мигель, недавно вы отметили 25-летие. Это возраст для чего?
— Для самых больших достижений в карьере, потому что ты приближаешься к пику, к лучшим годам в профессии.
Я считаю, что самый подходящий возраст для этого — от 27 до 30 лет. Это время футбольной зрелости. Главное только — не останавливаться на достигнутом, постоянно стремиться идти вперёд и учиться новому. Причём не только в футболе.
«Чтобы Азмун ушел, «Зениту» должны предложить очень большие деньги» | Статьи
Португальский полузащитник Мигель Данни — один из лучших легионеров в истории петербургского «Зенита». Он выступал за клуб из Северной столицы с 2008 по 2017 год. За это время трижды выиграл чемпионат России (2010, 2012, 2015), по два раза Кубок (2010, 2016) и Суперкубок (2011, 2015) страны, а также Суперкубок УЕФА (2008). После того как его бывший клуб оформил досрочное чемпионство по итогам нынешнего розыгрыша национального первенства, Данни дал интервью «Известиям», в котором оценил доминирование сине-бело-голубых на внутренней арене, рассказал о дальнейших задачах питерцев и своем возможном возвращении в структуру клуба.
— Счастлив за «Зенит» и хочу поздравить с золотом всю команду.
Все ребята большие молодцы! Обязательно позвоню Дзюбе и остальным футболистам, с которыми я играл, чтобы лично их поздравить.
— Второе чемпионство подряд можно назвать началом гегемонии «Зенита» в России?
— Думаю, «Зенит» еще долго будет доминировать в России. Это объективно лучшая команда в стране. Еще много лет они будут завоевывать чемпионские титулы.
— Теперь главная цель — удачно выступить в Лиге чемпионов?
— Конечно, в следующем сезоне от «Зенита» будут ждать успеха не только на внутренней арене. Мы все прекрасно знаем, насколько сложно добиться результата в Лиге чемпионов — там много хороших игроков, сильных команд. В следующем еврокубковом сезоне точно нужно выступить лучше, чем в этом («Зенит» не смог выйти из группы и занял в ней последнее место. — «Известия»).
— Кто лучший игрок в нынешнем составе «Зенита»?
— Вся команда! Дзюба — бомбардир, Малком — отличный игрок, Азмун — тоже. Весь состав показал себя великолепно.
Оборона играет очень надежно, сильная группа футболистов в центре поля, и атакующие знают свое дело. Поэтому питерцы и чемпионы. Все трудятся на благо команды: тренеры, персонал, президент и генеральный директор. «Зенит» — одна большая и дружная команда.
— Было много разговоров, что €40 млн за Малкома — это дорого. Тем более у него большую часть сезона были проблемы со здоровьем. Как вы считаете, «Зенит» заплатил «Барселоне» адекватную цену за бразильца?
— Это нормальная сделка. Малком — прекрасный футболист. Он поиграл в «Бордо», затем в «Барселоне». После коронавирусной паузы блестяще выглядит на поле: забивает, отдает результативные передачи. Малком — сильный игрок и большой помощник для команды.
— Говорят, Сердаром Азмуном интересуются европейские клубы. Уже наступил момент, когда его пора продавать?
— Азмун — очень эффективный нападающий, он много забивает. Когда он только переходил в «Зенит», было понятно, что это качественное усиление, так как до этого он ярко проявил себя в «Рубине» и «Ростове».
Чтобы «Зенит» согласился продать Азмуна, те, кто на него претендует, должны предложить «Зениту» очень большие деньги.
— Как считаете, у Дзюбы (16 голов + 12 передач) есть шанс перегнать по результативности за сезон экс-форварда «Зенита» Халка, который в чемпионате-2015/16 забил 17 голов и сделал 16 голевых передач?
— Не знаю, успеет ли он. Если Артем будет так же эффективен, как сейчас, это вполне возможно. У него в запасе еще четыре матча. Дзюба прямо сейчас лучший игрок в России. Люблю его и как человека, и как футболиста.
— Генеральный директор «Зенита» Александр Медведев сказал, что цель клуба до 2025 года — заполучить вторую звезду над эмблемой (ее дают за пять чемпионств, сейчас у «Зенита» уже семь). Семак успеет это сделать?
— «Зенит» — хороший клуб, у них достаточно денег, и они могут позволить себе покупать сильных футболистов. Так что выиграть еще три чемпионата не проблема для команды. Медведев говорит, что хочет вторую звезду для «Зенита», так как знает, что команда может сделать это.
— Появилась информация, что вы можете вернуться в «Зенит» и начать работать в структуре клуба.
— Да, это правда. Две недели назад мне звонил Александр Медведев. Мы разговаривали о моем возвращении в «Зенит». Он хочет, чтобы я работал в Санкт-Петербурге и помогал академии и клубу. Мне бы тоже хотелось вернуться, но у моей дочери сейчас есть проблемы со здоровьем. В августе я буду знать результаты исследования. Мы договорились созвониться с Медведевым. Если всё будет хорошо, то я вернусь в «Зенит».
— То есть вам бы хотелось вернуться в Россию?
— Конечно, я сразу поблагодарил генерального директора за такое предложение. Вы же знаете, что «Зенит» — это мой клуб, а Санкт-Петербург — это мое сердце. Посмотрим, как всё сложится.
— А ваши сыновья, которые раньше занимались в академии «Зенита», тоже вернутся в Россию?
— Если я вернусь в клуб, то Бернанду и Франсишку тоже снова будут в «Зените». Мы уже говорили об этом.
Крест Мигеля. Как Данни дважды возвращался в большой футбол
Мигель Данни получил травму крестообразных связок, оставившую его без футбола почти на год. «Бомбардир» вспоминает, как капитан «Зенита» дважды восстанавливался после таких повреждений и вновь выходил на прежний уровень.
СПОЙЛЕРЫ
Данни получил уже третью серьезную травму в своей карьере. Оба раза до этого Данни возвращался триумфально. Эти повреждения сказались на его игре. Но для сегодняшнего «Зенита» Данни – настоящий капитан, помогающий команде побеждать. Есть риск, что травма больше не позволит Мигелю когда-нибудь выйти на поле в футболке «Зенита».
Первая травма
Подробно рассказывать о том, какой резонанс вызвал переход Данни в «Зенит», особого смысла нет. Да, трансфер Мигеля тогда стал самым дорогим в истории российского футбола, что не могло не привлечь к нему внимание.
Общественность негодовала, фанаты «Динамо» ругались, болельщики «Зенита» с подозрением смотрели на татуировку с литерой «Д» на предплечье новичка.
Все перевернулось уже спустя пару недель. Данни вышел в стартовом составе на матч Суперкубка УЕФА с «Манчестер Юнайтед» и затмил всех своих новых партнеров, тот Кубок УЕФА выигрывавших. И Домингес, и Аршавин, и Погребняк вместе с миллионами зрителей по всему миру смотрели, как португалец оставляет в дураках половину «Манчестер Юнайтед», в том числе Фердинанда с Видичем, считавшихся на тот момент одними из лучших игроков на своей позиции, и направляет мяч мимо Эдвина Ван дер Сара, принося «Зениту» победу.
Спустя ровно год после победы «Зенита» в Кубке УЕФА над «Глазго Рейнджерс» Данни получит свою первую серьезную травму в карьере. На тренировке во время беговых упражнений португалец почувствовал резкую боль в правом колене. Диагноз – разрыв крестообразных связок, оставивший Мигеля вне футбола на шесть месяцев. Лучано Спаллетти, обхватив безволосую голову, долго и упорно думал над тем, что ему делать.
Он только прибыл в Санкт-Петербург, только ознакомился с возможностями футболистов, только обустроил быт, и вот спустя пару месяцев лишился своего ключевого игрока, вокруг которого собирался строить игру команды. Период перед приходом Спаллетти был одним из самых трудных в новейшей истории «Зенита». Команда провалила групповой турнир Лиги Европы, плелась в середине турнирной таблицы РФПЛ.
Александр Дюков сменил Сергея Фурсенко на посту президента клуба, скаут Константин Сарсания решил попробовать себя в роли тренера, Алехандро Домингес резко сдал обороты и собрался в обратно в «Рубин», Анатолий Тимощук почти подписал контракт с «Баварией», а Андрей Аршавин уже зажигал в «Арсенале». В общем, перемены назревали, потому приход итальянского специалиста, сменившего Дика Адвоката, был очень важен. Как была важна и фигура Данни, на которого все смотрели как на нового лидера команды.
После невероятно сложного восстановления Мигель вернулся на поле и ожидания оправдал. Тот «Зенит» запомнился многим: Вячеслав Малафеев, наконец, обрел уверенность в себе, Роман Широков из защитника переквалифицировался в полузащитника и стал одним из лучших в России, Александр Кержаков нашел себя после возвращения в родную команду и также вышел на новый уровень.
А Данни обыгрывал один в один, забивал, отдавал голевые передачи, куражился и вел тот «Зенит» к новым высотам.
Вторая травма
В 2012 году Мигель был на пике своей карьеры – в Лиге чемпионов вместе с командой он добыл первый в истории сине-бело-голубых выход в плей-офф. Однако в нем ему сыграть не удалось – на одной из тренировок он получил болезненный удар в колено от игрока молодежки и с криком повалился на газон. Так Данни получил второй в карьере разрыв крестов. Восемь месяцев невероятно трудных упражнений на различных тренажерах, закачка колена, многочасовые занятия по три раза в день – и Мигель вновь сделал невозможное, в ноябре выйдя на поле.
С тех пор, как Данни «мочился» на угловой флажок после гола «Порту» на Петровском утекло много воды. С понурым видом смотревший на это действие Халк подписал контракт с «Зенитом», вместе с Акселем Витселем побив рекорд Мигеля по дороговизне трансфера, Игорь Денисов, возмущенный зарплатами новичков, устраивал один из грандиознейших скандалов в российском футболе, Лучано Спаллетти считал последние дни в Петербурге.
Вскоре всем стало понятно, что команда изжила себя, и, как и несколькими годами ранее, ей нужна перестройка. Таким образом, Данни вновь вернулся на поле в эпоху перемен. В Питер приехал Виллаш-Боаш, отказавшийся от услуг ряда футболистов, и вновь видоизменивший манеру игры. Мигелю вновь пришлось подстраиваться под новые требования тренера. Однако теперь он был не первой звездой в команде. Да, португалец сохранил место в основе, однако ставка делалась на других исполнителей, да и возраст давал о себе знать – после двух тяжелых травм Данни так и не вернулся на прежний уровень.
Третья травма
Зато Мигель стал идеальным капитаном, который сумел объединить на поле звездных легионеров и молодых российских футболистов. Прошлым летом он был на пороге ухода из «Зенита», однако, в конце концов, выбил новый двухлетний контракт. Теперь же, после очередной травмы крестообразных связок, полученных Данни накануне и выбившей его из игры еще на 8-9 месяцев, в голове сам собой назревает вопрос – а выйдет ли еще он на поле в футболке «Зенита» и выйдет ли вообще в любой другой.
На пороге новых перемен сине-бело-голубым вновь придется привыкать к жизни без своего капитана, который возможно никогда не вернется.
С уходом Данни мы прощаемся с целой эпохой. После отъезда родных Аршавина, Кержакова и Денисова олицетворением команды для болельщиков стал именно Мигель, верой и правдой служащий клубу вот уже почти семь лет. Фанаты как могут поддерживают своего любимца, по городу даже появляются вот такие граффити.
Данни также сохранил частичку России и Питера в сердце – татуировка с именами сыновей на русском и разводными мостами говорят сами за себя. Простым болельщикам, вне зависимости от клубных симпатий, остается только надеяться, что этот Профессионал с большой буквы еще не закончил своих выступлений, и его путь с «Зенитом» пока не подошел к концу.
Почему все ненавидят «Зенит»
Твит дня. «Зенит» ссорится с газетой
А как насчет ваших кастрюль?: Ванная комната для Мигеля
Мигель — сосед, ему около 60 лет, но он точно не уверен.
Он женат на Варваре, или, как здесь говорят, ее имя — Байбара и он Мигай. Пару месяцев назад он почувствовал одышку и проснулся ночью, не в силах дышать. Они отвезли его в больницу, где он пролежал пару дней, а затем был отправлен домой. То же самое повторилось в тот день, когда его отправили домой, поэтому он вернулся в больницу, и еще через несколько дней ему сделали рентген грудной клетки и ЭКГ.Его снова отправили домой. Я пошел к нему и проверил его пульс, который учащался, более 200 ударов в минуту. В конце концов он вернулся в больницу, где кардиолог диагностировал проблемы с сердцем, и его отправили в специализированную кардиологическую больницу в столице Санто-Доминго. В конце концов они прооперировали и заменили два сердечных клапана. Он живет у родственников в Санто-Доминго, пока его рана не заживет, и он должен вернуться сюда на следующей неделе. Пока он и Байбара отсутствовали, соседи периодически убирали их дом и приводили в порядок сад.Теперь они строят ему ванную. Мечта большинства жителей Кампо — иметь настоящую ванную комнату, и лишь немногие делают это.
Вместо этого у них есть туалет в нижней части сада. Что касается уборных, то она хороша, выкрашена в зеленый цвет и тоже с крышей. Они также используют его для хранения куриного корма.
У меня нет особых проблем с использованием уборных. Когда я рос, мы жили в доме на колесах, и у нас был химический туалет под названием «Эльсон». В отличие от здешних туалетов, где яма кажется довольно глубокой, «Элсон» был похож на большое ведро, и в него нужно было наливать синюю жидкость.Я помню, как ненавидел ходить в туалет, когда он наполнялся, как если бы вы сделали номер 2, как сказала бы мама, ваш зад был забрызган.
Человек Элсона приходил каждый четверг, чтобы опорожнить его, мы звали его Дэн Дэн, человек Элсона, и у него был маленький старый фургон с большим баком, и он просто сливал содержимое нашего Элсона в свой больший бак. В любом случае я отвлекся.
Помимо уборной, у Мигеля и Барбары есть душевая. Ну, это несколько кусков оцинкованного листа, наклеенных снаружи дома, с ведром внутри и жестяной банкой для черпания воды из ведра.
Так что теперь соседи строят Мигелю настоящую ванную, которая прилеплена к спальне сбоку. Он сделан из бетонных блоков, а не из дерева, как остальная часть дома. Я не уверен, почему это так, но все ванные комнаты, которые люди строят в городках, обычно на деньги своих детей, сделаны из бетонных блоков.
Помимо строительства ванной комнаты и установки туалета, душа, раковины и сантехники для воды, также должен быть септик. В большинстве домов они есть здесь, так как нет канализации.Как вы понимаете, она должна быть разумного размера, так что какой-то бедняга с Гаити копал яму последние пару дней. Однако его прогресс был замечательным.
После того, как отверстие будет готово, сверху будет уложена бетонная плита, которую никогда нельзя снимать. По-видимому, он никогда не наполнится, так как вещество, которое входит в него, биоразлагается через стенки ямы в сад.
Мне не терпится увидеть лицо Мигеля, когда он вернется и впервые в жизни увидит, что у него есть ванная.
границ | Конъюгативная плазмида pLS20 Bacillus subtilis кодирует два вспомогательных релаксосомных белка типа ленточная спираль-спираль, которые необходимы для конъюгации
Введение
Бактерии обмениваются генетическим материалом в больших масштабах, даже между отдаленно родственными видами, посредством различных путей, которые в совокупности называются горизонтальным переносом генов (HGT) (обзор см. в Ochman et al., 2000; Frost et al., 2005; Thomas and Nielsen, 2005). ; Бото, 2010). Горизонтальный обмен ДНК мгновенно обеспечивает бактерии новым набором генов и, следовательно, является важным фактором быстрой адаптации и эволюции бактерий.Среди генов, которые распространяются HGT, есть гены, ответственные за устойчивость к антибиотикам (AR), что представляет собой серьезную и все более тревожную проблему для экономики и здравоохранения в глобальном масштабе. За HGT ответственны три основных механизма: трансформация за счет естественной компетентности, трансдукция через бактериальный фаг и конъюгация (Ochman et al.
, 2000; Frost et al., 2005; Thomas and Nielsen, 2005). Из них конъюгация, по-видимому, является путем, который преимущественно отвечает за распространение генов AR (Mazel and Davies, 1999; Waters, 1999; Norman et al., 2009; Дэвис и Дэвис, 2010). Конъюгация — это процесс, при котором конъюгативный элемент (КЭ) переносится из клетки-донора в клетку-реципиент через специальную транспортную пору, соединяющую обе клетки. КЭ содержат все гены, необходимые для процессинга ДНК, установления контакта с реципиентной клеткой, гены, кодирующие структурные белки соединительной поры, а также гены для транспорта ДНК. КЭ могут быть интегрированы в бактериальную хромосому или присутствовать на плазмидах, которые называются интегративными и конъюгативными элементами (ИСЭ) и конъюгативными плазмидами соответственно.Из-за огромного количества и плотности микробов, а также постоянного пополнения количества бактерий при приеме пищи и жидкостей кишечник человека и животных представляет собой нишу, особенно подходящую для возникновения, накопления и распространения АР (Sommer et al.
, 2009, 2010; Форсберг и др., 2012; Пендерс и др., 2013).
Конъюгативные элементы обычно присутствуют в грамположительных (G+) и грамотрицательных (G-) бактериях, и основные концепции процесса переноса сохраняются (Alvarez-Martinez and Christie, 2009; De la Cruz et al., 2010; Смилли и др., 2010 г.; Гессвайнер-Мор и др., 2013). Однако в то время как в большинстве систем конъюгация включает перенос одной цепи ДНК (см. ниже), ДНК переносится в ее двухцепочечной форме во время конъюгации в G+ мицелиальных бактериях Streptomyces (Goessweiner-Mohr et al., 2013; Thoma and Muth, 2016), который здесь далее не рассматривается. Конъюгация начинается с процесса, называемого формированием пары спаривания (Mpf), в котором донорская клетка распознает и взаимодействует с подходящей клеткой-реципиентом.Вероятно, это запускает сигнал для процессинга ДНК КЭ и последующего переноса одной из его цепей, названной Т-цепью, в реципиентную клетку. Сложная многокомпонентная пора, соединяющая донорскую и реципиентную клетки, называется трансферосомой, которая представляет собой систему секреции IV типа (T4SS).
Фермент, ответственный за инициацию образования Т-цепи, представляет собой релаксазу, фосфодиэстеразу, которая расщепляет ДНК специфичным для цепи и сайта способом в определенном положении, называемом сайтом nic , который расположен в начале регион передачи ( или ).Опосредованное релаксазой расщепление генерирует гидроксильную группу на 3′-конце сайта nic , которая функционирует как праймер для удлинения ДНК; т. е. релаксаза инициирует репликацию ДНК по типу катящегося круга (также называемую репликацией переноса ДНК [Dtr]). После разрыва релаксаза остается ковалентно присоединенной к 5′-концу Т-цепи с надрезом, которая затем вместе с присоединенной Т-цепью переносится в реципиентную клетку. В большинстве случаев остаток активного центра, ковалентно присоединяющийся к Т-цепи, относится к тирозину.Однако совсем недавно было показано, что релаксазы семейства MOB V используют для разрыва ДНК остаток гистидина вместо остатка тирозина (Pluta et al., 2017).
Из-за своей решающей роли в конъюгации релаксазы привлекли значительное внимание, и некоторые из них были подробно охарактеризованы на биохимическом, функциональном и структурном уровнях. В некоторых случаях, например, ICE Bs1 из Bacillus subtilis и конъюгативной плазмиды широкого круга хозяев pIP501, релаксаза является единственным белком, который необходим для процессинга ДНК (Kopec et al., 2005; Ли и Гроссман, 2007 г.; Громанн и др., 2016). Однако в большинстве случаев дополнительный белок (белки), кодируемый CE или хозяином, связывается с или T и участвует в процессинге ДНК. Нуклеопротеиновый комплекс или , образованный релаксазой и дополнительными белками, называется релаксосомой, а дополнительные белки называются вспомогательными или вспомогательными белками. Хотя их название может указывать на то, что они играют второстепенную роль (роли) в реакции процессинга, было показано, что большинство, если не все изученные до сих пор вспомогательные белки необходимы для конъюгации.
Большинство исследований конъюгации основано на CE, присутствующем в G- бактериях, при этом знания об аспектах, связанных с конъюгацией, в G+ бактериях сильно отстают. Это особенно касается вспомогательных белков (см. Обсуждение). В нашей лаборатории мы изучаем конъюгативную плазмиду pLS20, которая первоначально была выделена из бактерии Gram+ Firmicute B. subtilis natto IFO3335 (Tanaka et al., 1977). Этот штамм используется для ферментации соевых бобов для производства «натто», популярного блюда в Южной Азии, и, следовательно, возможно, что pLS20 или родственники играют роль в опосредованном конъюгацией HGT в кишечнике людей и животных.Производное pLS20, содержащее ген устойчивости к хлорамфениколу, pLS20cat, было сконструировано (Itaya et al., 2006), и его последовательность была определена в нашей лаборатории и в лаборатории М. Итая (Mitsuhiro Itaya, Университет Кейо, Япония). . Все гены конъюгации расположены в одном большом опероне, охватывающем гены с 28 по 74 согласно нашей номенклатуре (Singh et al.
, 2013). Гены pLS20cat 25-27 участвуют в регуляции экспрессии генов конъюгации (Singh et al., 2013; Рамачандран и др., 2014). Недавно мы идентифицировали и охарактеризовали релаксазу (ген 58 ) и oriT pLS20cat, которые мы назвали Rel LS20 и oriT LS20 соответственно (Ramachandran et al., 2017). В отличие от многих других плазмид, ген релаксазы и oriT расположены внутри его большого оперона конъюгации, и Rel LS20 оказался членом-основателем нового семейства релаксаз, содержащего >800 членов.
Здесь мы рассмотрели вопрос, содержит ли pLS20cat вспомогательные релаксосомные гены. Мы демонстрируем, что гены 56 и 57 и 57 , расположенные между геном Relaxase Rel LS20 и 9002 и ORIT LS20 , являются двумя вспомогательными генами, которые необходимы для сопряжения и деноминированные их как AUX1 LS20 и aux2 LS20 соответственно.
Оба генных продукта были очищены, и биохимический анализ показал, что один из них образует в растворе тетрамеры, а другой — гексамеры.Мы также показываем, что белки связываются с различными мотивами ДНК, присутствующими в oriT LS20 . Анализы In silico показали, что большой части генов релаксазы, кодирующих семейство релаксаз MOB L , предшествуют гены, кодирующие гомологи Aux1 LS20 и/или Aux2 LS20 . Результаты, полученные для Aux1 LS20 и Aux2 LS20 , соотносятся с другими вспомогательными белками CE, присутствующими в G+ и G- организмах.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы, плазмиды, среды и олигонуклеотиды
Штаммы Escherichia coli и B. subtilis выращивали в жидкой среде Луриа-Бертани (LB) или на чашках с 1,5% агаром LB. При необходимости в среды добавляли следующие антибиотики: ампициллин (100 мкг/мл), эритромицин (1 и 150 мкг/мл в B. subtilis и E.
coli соответственно), хлорамфеникол (5 мкг/мл). , спектиномицин (100 мкг/мл) и канамицин (10 и 30 мкг/мл в B.subtilis и E. coli соответственно). Используемые штаммы B. subtilis были изогенными с штаммом 168 B. subtilis и перечислены в дополнительной таблице S1. Используемые плазмиды и олигонуклеотиды перечислены в дополнительных таблицах S2, S3 соответственно. Все олигонуклеотиды были приобретены у Isogen Life Science, Нидерланды.
Трансформация
Клетки Escherichia coli трансформировали с использованием стандартных методов (Sambrook et al., 1989).Получение компетентных клеток B. subtilis и трансформацию проводили, как описано ранее (Bron et al., 1989). Трансформанты отбирали на чашках с агаром LB с соответствующими антибиотиками. pLS20cat кодирует белок, Rok LS20 , который ингибирует развитие компетентности путем репрессии comK , ключевого транскрипционного активатора генов компетентности (Singh et al.
, 2012). Таким образом, для манипулирования генами на pLS20cat мы подготовили компетентные клетки штамма, несущего pLS20cat, который содержит хромосомный гибрид P xyl — comK (PKS56), используя стандартный протокол (Singh et al., 2012).
Конструирование плазмид и штаммов
Правильность последовательностей всех клонированных фрагментов ПЦР была подтверждена анализом последовательности. Амплификацию с помощью ПЦР областей pLS20cat проводили с использованием в качестве матрицы тотальной ДНК, выделенной из pLS20cat, несущего штамм PKS11. Подробная информация о конструировании интеграционных векторов на основе плазмид pDR110 (вектор интеграции amyE с IPTG-индуцируемым промотором P spank ) или pAX01 (вектор интеграции lacA с индуцируемым ксилозой P xyl приведены в дополнительной таблице S2.Таким образом, ген 56 был клонирован под контролем промотора P xyl или промотора P spank .
Кроме того, гены 56-57-58 , гены 57-58 или ген 58 были клонированы позади промотора P spank . Плазмидную ДНК сконструированных производных pAXO1 и pDR110 выделяли из клеток E. coli и затем использовали для трансформации компетентных клеток B. subtilis .Интеграцию двойного кроссинговера в хромосому проверяли с помощью ПЦР в случае pAXO1-производных. Когда производные pDR110 использовали для трансформации компетентных клеток B. subtilis , двойную кроссинговерную интеграцию тестировали по потере активности амилазы. Гены PLS20CAT 58 ( REL LS20 ), 57 ( AUX1 LS20 ) и 56 ( AUX2 LS20 ) были клонированы в E.coli Expression Expression Vector28b + для генов Fusion, содержащих C-терминал его (6) добавочный номер.Подробная информация об этих стратегиях клонирования приведена в дополнительной таблице S2. Полученные производные pET28b+ были сконструированы с использованием штамма E.
coli XL1-Blue. После проверки правильности плазмиды трансформировали в штамм E.coli BL21(DE3).
Анализы конъюгации
Конъюгацию проводили в жидкой среде, как описано ранее (Singh et al., 2013). Влияние эктопической экспрессии данного гена, находящегося под контролем индуцибельного промотора P spank и/или P xyl , на конъюгацию изучали путем добавления индуктора (1 мМ IPTG, 1% ксилозы) к предварительно нагретую среду LB, используемую для разбавления ночных культур донорских клеток.
Аналитические эксперименты по ультрацентрифугированию
Анализы скорости седиментации (SV), седиментационного равновесия (SE) и динамического светорассеяния (DLS) и обработка данных, включая оценки молярных масс релаксосомных белков из гидродинамических измерений, проводились в тех же условиях, что и те ранее использовался при анализе Rel LS20 (Ramachandran et al., 2017).
Сверхэкспрессия и очистка рекомбинантного Rel
LS20 , Aux1 LS20 и Aux2 LS20 , содержащих C-концевой His (6) Tag Рекомбинантные версии Rel LS20 , Aux1 LS20 и Aux2 LS20 были экспрессированы и очищены с использованием аналогичных протоколов.
Вкратце, клеток E. coli BL21(DE3), содержащих плазмиду pAND83 ( rel LS20 His (6) ), или pHJA56 ( aux1 LS20 His (6) ( aux2 LS20 His (6) ) инокулировали в свежую среду LB, дополненную 30 мкг/мл канамицина, и выращивали при 37°C при встряхивании (200 об/мин). При OD 600 около 0,6 добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ, чтобы индуцировать рекомбинантный белок, и рост продолжали в течение 2 часов.Затем клетки собирали центрифугированием и обрабатывали, как описано ранее (Singh et al., 2012). Белки, очищенные на колонке с никелем (чистота> 95%), окончательно подвергали диализу против буфера B (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1 мМ EDTA, 500 мМ NaCl, 10 мМ MgCl 2 , 7 мМ β-меркаптоэтанол, 50 %). об./об. глицерина) и хранят аликвотами при -80°С. Анализ Брэдфорда и определение OD 280 использовали для определения концентрации белка.
Анализы замедления гелеобразования
Анализы замедления гелеобразования в основном проводились, как описано ранее (Singh et al.
, 2012). Таким образом, различные фрагменты ДНК амплифицировали с помощью ПЦР с использованием pLS20cat в качестве матрицы. Полученные ПЦР-фрагменты очищали и 170 нг ДНК [200 или 362 п.н.] (с или без 220 нг контрольной ДНК [176 п.н.]) инкубировали на льду в буфере для связывания [20 мМ трис-HCl, рН 8, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ DTT, 100 мМ KCl, 10% (об./об.) глицерина, 0,05 мг мл -1 BSA] без или с очищенным Aux1 LS20 или Aux2 LS20 до фиксированного финала концентрация 90 нМ (дополнительная фигура S3) или с использованием двукратно увеличивающихся концентраций в диапазоне от 0.09 до 5,76 мкМ (рис. 3) в общем объеме 16 мкл. Отрицательный контроль, соответствующий номерам п.н. 63 774–63 950 инвентарного номера NC_015148.1, имеет содержание AT, которое очень похоже на содержание AT фрагмента или T (61,4 против 61,1%). Эта ДНК соответствует последовательностям, расположенным внутри гена (ген 24 ), что снижает вероятность того, что она обладает особыми свойствами для рекрутирования регулятора транскрипции или другого ДНК-связывающего белка.
Кроме того, прогнозируется отсутствие статического изгиба.После тщательного перемешивания образцы инкубировали в течение 20 мин при 30°С, снова помещали на лед на 10 мин, затем помещали на 2% агарозный гель в 0,5ХТВЕ. Электрофорез проводили в 0,5ХТВЕ при 50 В при 4°С. Наконец, гель окрашивали бромистым этидием, обесцвечивали в 0,5XTBE и фотографировали с УФ-освещением.
Идентификация мафии
L Члены Rel LS20 использовался в качестве последовательности запроса для выполнения пси-взрыва (версия 2.6.1+) поиск по базе данных белков NCBI nr (июль 2017 г.), позволяющий выполнить до 10 циклов повторения с порогом e -значения 1e-15 (Altschul et al., 1997, 2005; Schaffer et al., 2001), выпустив 1445 хитов. Затем была использована программа USEARCH (версия v10.0.240_i86linux32) для выявления и удаления избыточных последовательностей, демонстрирующих 100% идентичность (Edgar, 2010), в результате чего было получено 1249 уникальных совпадений, демонстрирующих высокое сходство с Rel LS20 .
Идентификация предполагаемых вспомогательных белков
Белковые последовательности Aux1 LS20 и Aux2 LS20 были использованы в качестве запроса к базе данных белков NCBI nr (июль 2017 г.) с использованием psi-blast (версия 2.6.1+) с порогом e-значения 1e-6 и 1e-7 соответственно, до тех пор, пока не будут получены новые совпадения. Идентификаторы последовательностей, полученные из пси-бласта, скрещивали с идентификаторами последовательностей, предшествующих членам семейства релаксаз MOB L , полученными из нуклеотидных записей, из которых они были транслированы.
Прогноз вторичной структуры для Aux1
LS20 и Aux2 LS20 ГомологиСоответствующие последовательности были отправлены на веб-сервер свойств RaptorX (Wang et al., 2016), а прогнозы для β-цепей и α-спиралей вдоль последовательностей были обозначены буквой «R») (R Core Team, 2017).
Результаты
Идентификация предполагаемых релаксосомных генов pLS20cat с помощью
in Silico Анализ Недавно мы показали, что ген pLS20cat 58 необходим для конъюгации и что он кодирует релаксазу, которую мы назвали Rel LS20 (Ramachandran et al.
, 2017). В этих исследованиях мы также идентифицировали сайт nic Rel LS20 и определили функциональный oriT , названный oriT LS20 , до области 362 п.н.Примечательно, что oriT LS20 и rel LS20 разделены областью 865 п.н., которая содержит два относительно небольших предполагаемых гена, обозначенных генами 56 и 57 90 , 2013, схематический вид этого региона см. на рис. 1). Часто, но не всегда, гены релаксазы, локализованные в конъюгативной плазмиде, сопровождаются небольшими вспомогательными генами релаксосомы, которые обычно располагаются выше гена релаксации.Это побудило нас исследовать, могут ли гены 56 и 57 кодировать вспомогательные релаксосомные гены pLS20cat. In silico анализ генов pLS20cat 56 и 57 показывает, что, во-первых, rel LS20 трансляционно связан с предшествующим геном 57 [т.е. генов 57 и rel LS20 соответственно перекрываются; см.
рис. 1], и только небольшая межгенная область в 183 п.н. отделяет ген 57 от предшествующего ему гена 56 .Во-вторых, гены 56 и 57 являются небольшими генами (79 и 147 кодонов соответственно). И в-третьих, белки, кодируемые этими генами, являются предполагаемыми ДНК-связывающими белками, которые, как предполагается, содержат мотив Ribbon-Helix-Helix (RHH) в своих N-концевых областях. Обзор предсказания вторичной структуры обоих белков и их гомологии с CopG, парадигмой белка, связывающего ДНК RHH (Gomis-Ruth et al., 1998; Del Solar et al., 2002), показан на дополнительном рисунке S1. На этом рисунке показано, что как Aux1 LS20 , так и Aux2 LS20 содержат несколько остатков лизина и аргинина вблизи конца их предсказанной спирали 1 и начала спирали 2.Было показано, что соответствующая область в известных структурах RHH близка к фосфатному остову ДНК (например, см. Schildbach et al., 1999). Таким образом, анализ in silico показал, что два небольших гена 56 и 57 , предшествующие гену релаксации rel LS20 , могут кодировать вспомогательные релаксосомные белки.
РИСУНОК 1. Релаксосомная область pLS20cat. (A) Генетическая организация генов pLS20cat 55–59 .Гены, их размеры и ориентация транскрипции указаны стрелками. Гены 55 и 59 окрашены в серый цвет. Гены 56, 57 и 58 ( rel LS20 ) окрашены в зеленый, оранжевый и желтый цвета соответственно. Тот же цветовой код используется в « B », а также на рисунке 4 (см. ниже). Область 362 п.н. oriT LS20 обозначена синей рамкой, помеченной oriT . Нумерация пар оснований указана сверху. (B) Последовательность ДНК генов 56 и 57 и их выведенные белковые последовательности. Стоп-кодоны отмечены звездочкой, а вероятные сайты связывания рибосом (RBS) выделены красной рамкой. Обратите внимание, что гены 57 и rel LS20 связаны трансляционно. Приведены только первые 11 кодонов гена rel LS20 .
Гены pLS20cat
56 и 57 Необходимы для конъюгации Ранее мы сконструировали производную pLS20cat, pLS20Δ56-58, в которой предполагаемые гены 56-57 вместе с геном релаксазы rel LS20 ( ген 58) были удалены, и продемонстрировали, что эта плазмида имел дефект спряжения.
Конъюгация pLS20Δ56-58 восстанавливалась, когда все три гена ( 56-58 ) эктопически экспрессировались с IPTG-индуцируемого промотора P spank в хромосомном локусе amyE , но не в отсутствие гена . 58 , показывая, что Rel LS20 необходим для конъюгации (Ramachandran et al., 2017). Мы использовали аналогичный подход для изучения того, являются ли гены 56 и/или 57 существенными для конъюгации. Таким образом, мы сконструировали штамм GR153, который содержит pLS20Δ56-58, а также содержит rel LS20 (ген 58 ), но не 56 и 57 , под контролем P 20 в локусе amyE .Затем мы использовали этот штамм в качестве донора для определения эффективности конъюгации с использованием стандартного протокола (см. Материалы и методы). Штаммы PKS11, GR149 и GR150 были включены в качестве контроля. Как показано в таблице 1, эффективность конъюгации, наблюдаемая для плазмиды дикого типа pLS20cat, находилась в диапазоне 10 -3 , что аналогично значениям, о которых сообщалось ранее в аналогичных условиях (Singh et al.
, 2013; Ramachandran et al. , 2014, 2017). Как сообщалось ранее (Ramachandran et al., 2017), конъюгация pLS20∆56-58 наблюдалась только тогда, когда гены 56-58 экспрессировались из хромосомы (табл. 1, штаммы GR149 и GR150).Важно отметить, что при использовании штамма GR153 ( amyE ::P spank — rel LS20 , pLS20Δ56-58) в качестве донора в экспериментах по конъюгации не было получено трансконъюгантов, независимо от того, выращивались ли они в присутствии или отсутствие IPTG. Эти результаты показали, что ген pLS20cat 56 и/или 57 необходим для конъюгации.
ТАБЛИЦА 1. pLS20cat Гены 56 и 57 необходимы для конъюгации.
Затем мы проверили, требуется ли для конъюгации только один или оба гена. Для этого мы сконструировали штаммы GR197 и GR200, несущие pLS20Δ56-58, в которых rel LS20 вместе с геном 57 (штамм GR197) или геном 56 (штамм GR200) могли быть индуцированы из бактериального генома.
. При использовании в качестве донора трансконъюганты не были получены для каждого штамма, независимо от того, выращивались ли они в отсутствие или в присутствии индуктора(ов) (см. Таблицу 1), демонстрируя, что оба гена необходимы для конъюгации.
В приведенных выше экспериментах по конъюгации один или комбинацию генов 56, 57, rel LS20 дополняли путем их экспрессии с IPTG-индуцируемого промотора P spank для всех штаммов, кроме штамма GR200. В этом штамме RUD LS20 контролируется на P 9002 SPANK на локусу AMYE и ген 56 на промоутере XyloSe-racucial P XYL на LACA Locus.Чтобы исключить возможность того, что трансконъюганты не были получены для донорного штамма GR200, поскольку гены экспрессировались с разных промоторов в другом локусе, мы сконструировали штамм GR225, в котором ген 56 был помещен под контроль P xyl . промотор lacA и гены 57 и 58 под контролем промотора P spank amyE .
Трансконъюганты были получены для этого штамма, когда клетки выращивали в присутствии обоих индукторов (таблица 1), демонстрируя, что все продукты генов, экспрессируемые с двух разных промоторов и хромосомных локусов, были функциональными.Таким образом, эти результаты демонстрируют, что помимо rel LS20 гены 56 и 57 также необходимы для конъюгации. Принимая во внимание эти результаты, а также структурную организацию этих генов по отношению к rel LS20 и oriT LS20 , анализ in silico , представленный выше, и дополнительные доказательства, представленные ниже, мы заключаем, что pLS20cat ген 56 и 57 кодирует вспомогательные релаксосомные белки, которые мы назвали Aux1 LS20 и Aux2 LS20 соответственно.
Состояние олигомеризации, определенное аналитическим ультрацентрифугированием и методами DLS
Чтобы охарактеризовать вспомогательные релаксосомные белки in vitro , мы очистили Aux1 LS20 (Mw 10 601 Da) и Aux2 LS20 (Mw 18 605 Da) из E. coli , каждый из которых слился с His 90 тег на его С-конце.Сначала мы определили состояние олигомеризации белков, а также исследовали предполагаемые взаимодействия между ними и с Rel LS20 , используя два дополнительных аналитических подхода к ультрацентрифугированию, т. е. SV и SE (рис. 2A-D), вместе с экспериментами DLS с использованием того же экспериментальные условия.
РИСУНОК 2. Определение состояния олигомеризации релаксосомных белков Aux1 LS20 и Aux2 LS20 . Очищенные белки в растворе с концентрацией 12 мкМ исследовали по скорости седиментации (СС) и седиментационному равновесию (СЭ).Участки (A , C) представляют собой профили распределения c(s) коэффициента седиментации, полученные методом SV, и соответствуют Aux1 LS20 и Aux2 LS20 соответственно. Градиенты концентрации, полученные с помощью анализов SE: (B) Данные, полученные с помощью Aux1 LS20 (пустые кружки) и анализа наилучшего соответствия, предполагающего модель белков тетрамер (черная линия), димер (пунктирная линия) и гексамер (пунктирная линия) ; (D) Данные, собранные с помощью Aux2 LS20 (пустые кружки) и наиболее подходящие для модели белковых гексамеров (черная линия), тетрамера (пунктирная линия) и октамера (пунктирная линия).
Нижняя часть на графиках SE представляет собой разницу между экспериментальными данными и оценочными значениями для наилучшего соответствия модели одного вида (остатки).
Профили седиментации, полученные с помощью анализа SV, показали, что Aux1 LS20 представляет собой отдельный вид с экспериментальным коэффициентом седиментации 2,5 S ( с 20,w = 2,9 S), совместимым с умеренно удлиненной тетрамерной формой белка ( f / f 0 = 1,5) (рис. 2А).Последующий анализ Aux1 LS20 дал значение D , равное 52,5 ± 0,3 мкм 2 /с. Полученные значения S- и D после введения в уравнение Сведберга дали кажущуюся молярную массу 46 290 Да. Данные SE, анализ наилучшего соответствия модели одного вида, дали среднюю молекулярную массу 42 200 Да ± 300 Да, подтверждая, что Aux1 LS20 является тетрамером в растворе (рис. 2B).
В случае Aux2 LS20 анализ границ седиментации показал профиль седиментации с основным пиком, соответствующим 90.
0% всех белков при 4,4 с ( с 20,w = 5,1 с), вместе со вторым пиком при 3,3 с ( с 20,w = 3,8 с), охватывающим 7% образца (Рисунок 2С). Значение S основного пика совместимо с теоретическим поведением сферического тетрамера Aux2 LS20 ( f / f 0 = 1,2), а также с умеренно вытянутым гексамером ( f / f 0 = 1,6). Анализ DLS Aux2 LS20 дал D из 38.2 ± 1,0 мкм 2 /с, что в сочетании с полученным значением S , равным 4,4 в формуле Сведберга, дает кажущуюся молярную массу 113 400 Да, что очень близко к молекулярной массе гексамеров Aux2 LS20 ( 111 630 Да). Эксперименты SE были решающими для установления состояния олигомеризации Aux2 LS20 , поскольку наилучшее соответствие данных SE дало среднюю молекулярную массу 111 300 ± 1200 Да, что недвусмысленно продемонстрировало, что Aux2 LS20 образует гексамеры в растворе (рис. 2D).Таким образом, результаты трех дополнительных экспериментальных подходов показали, что Aux1 LS20 и Aux2 LS20 образуют тетрамер и гексамеры в растворе соответственно.
Ранее мы определили, что очищенный Rel LS20 образует в растворе мономеры (Ramachandran et al., 2017). Для изучения возможных взаимодействий между релаксосомными белками в растворе мы использовали комбинации Aux1 LS20 , Aux2 LS20 и Rel LS20 и подвергли их экспериментам SV (дополнительная фигура S2).Никаких дополнительных пиков с повышенными значениями S , отражающих новые белковые гетерокомплексы, не было получено ни в одной из протестированных комбинаций, что означает, что релаксосомные белки pLS20cat не взаимодействуют в растворе, по крайней мере, в тестируемых условиях.
Aux1
LS20 и Aux2 LS20 Привязка специально к или LS20 Анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) были выполнены для изучения свойств связывания ДНК Aux1 LS20 и Aux2 LS20 .
Результаты, представленные на фиг. 3, показывают, что оба вспомогательных белка связывались с ДНК, причем оба предпочтительно связывались с или LS20 . Тем не менее, были явные различия в характеристиках связывания между двумя белками. Добавление Aux1 LS20 привело к появлению только одного замедленного вида oriT LS20 , и даже при самой высокой испытанной концентрации Aux1 LS20 не связывался с ДНК отрицательного контроля (рис. 3, левая панель). .Один отсталый вид oriT LS20 также наблюдался для Aux2 LS20 при низких концентрациях. Однако более высокие концентрации Aux2 LS20 привели к появлению дополнительных сдвинутых видов oriT LS20 . Кроме того, при более высоких концентрациях Aux2 LS20 связывался также с ДНК отрицательного контроля, а при самой высокой испытанной концентрации наблюдалось пятно отставших видов (рис. 3, правая панель). Эти результаты показывают, что оба белка связываются преимущественно с oriT LS20 , но Aux1 LS20 , по-видимому, связывается с oriT LS20 с более высокой специфичностью, чем Aux2 LS20 .
РИСУНОК 3. Вспомогательный белок Aux1 LS20 и Aux2 LS20 представляют собой ДНК-связывающие белки, которые предпочтительно связываются с oriT LS20 . ДНК-связывающую активность Aux1 LS20 и Aux2 LS20 анализировали с помощью EMSA. Каждая дорожка содержала два фрагмента ДНК; один, соответствующий oriT LS20 (OriT LS20 , 362 п.н., 170 нг), и контрольный фрагмент (отрицательный контроль, 176 п.н., 220 нг, соответствующий позициям pLS20 63,774–63,950 инвентарного номера NC_0151488)1). – Загруженный без белка. Возрастающие концентрации Aux1 LS20 или Aux2 LS20 были получены с использованием стадий двойного разведения и варьировались от 0,09 (дорожки «а») до 5,76 мкМ (дорожки «g»). Указаны положения несвязанной контрольной ДНК (отрицательный контроль) и oriT LS20 (oriT LS20 ). Одиночный смещенный вид oriT LS20 , наблюдаемый для Aux1 LS20 , указан слева синей стрелкой.
Различные смещенные виды oriT LS20 , наблюдаемые для Aux2 LS20 , указаны справа фиолетовыми стрелками, а смещенные виды контрольного фрагмента ДНК отмечены звездочкой.
Для дальнейшего определения сайтов связывания Aux1 LS20 и Aux2 LS20 мы создали тринадцать перекрывающихся фрагментов ДНК длиной 200 п.н. (F21–F33), покрывающих область oriT LS20 со скользящим окном в 25 п.н., и использовали их в ЭМСА. Результаты, представленные на дополнительной фигуре S3, показывают, что Aux1 LS20 связан с фрагментами F22-F29, которые имеют общую последовательность из 25 п.н.Эта последовательность содержит инвертированный повтор 5′-TGGTACCA-3′, который может быть сайтом связывания Aux1 LS20 . В случае Aux2 LS20 замедленные виды oriT LS20 с сильной и слабой интенсивностью наблюдались для фрагментов F21–F25 и F26–F28 соответственно. Для фрагментов F29–F33 сдвигов при использованной концентрации белка не наблюдалось.
Это показывает, что Aux2 LS20 связывается с 5′-полуобластью oriT LS20 выше Aux1 LS20 .Мотив последовательности 5′-TGTGCAT-3′ присутствует трижды в направленной повторяющейся ориентации в 5′-половине или T LS20 . В то время как фрагменты F21–F25 содержат по три мотива 5′-TGTGCAT-3′, фрагмент F26 содержит только два, а мотив присутствует только один раз на фрагментах F27 и F28. Это предполагает, что мотив 5′-TGTGCAT-3′ может быть предпочтительным сайтом связывания для Aux2 LS20 . Стоит отметить, что два мотива 5′-TGTGCAT-3′ встроены в более крупный мотив (5′-TTTATGTGCATT-3′).
Более 400 членов MOB
L Семейство генов релаксаз содержит вышестоящие гены, кодирующие гомологи Aux1 LS20 и/или Aux2 LS20 Ранее мы сообщали, что Rel LS20 , кодируемый pLS20cat, является членом-основателем нового большого семейства релаксаз, которое мы назвали MOB L , которое содержит 817 членов, которые почти исключительно кодируются бактериями, принадлежащими к типу Firmicutes.
(Рамачандран и др., 2017). Мы хотели знать, предшествовали ли другим генам релаксазы MOB L гены, кодирующие предполагаемые гомологи Aux1 LS20 и/или Aux2 LS20 . Чтобы изучить это, мы сначала определили текущее количество генов релаксазы MOB L , применяя тот же метод, что и в нашем предыдущем исследовании; т. е. мы выполнили поиск psi-blastp в базе данных NCBI nr, используя Rel LS20 в качестве запроса. После удаления избыточных последовательностей этот поиск привел к 1453 совпадениям, которые показали высокое сходство с Rel LS20 (пороговое значение P = 1e-15).Затем был извлечен соответствующий инвентарный номер ДНК каждой идентифицированной релаксазы MOB L , который впоследствии использовался для создания базы данных, содержащей инвентарный номер каждого члена MOB L вместе с номером белка, кодируемого геном, расположенным выше по течению. и ниже гена релаксации. Затем мы выполнили те же процедуры для Aux1 LS20 и Aux2 LS20 ; т.
е. мы идентифицировали белки, имеющие высокий уровень сходства с Aux1 LS20 и Aux2 LS20 , и создали базы данных, которые содержали эти номера доступа вместе с номерами белков, кодируемых фланкирующими генами.Наконец, три базы данных были скрещены для идентификации тех членов MOB L , которым предшествует ген, кодирующий предполагаемый гомолог Aux1 LS20 и/или Aux2 LS20 . Этот подход выявил 387 генов релаксазы MOB L , которым предшествовал ген, кодирующий предполагаемый гомолог Aux2 LS20 ; и из них 87 содержали дополнительный ген, кодирующий гомолог Aux1 LS20 выше по течению. Все без исключения идентифицированные гены релаксазы MOB L , имеющие расположенные выше гены, кодирующие предполагаемые гомологи Aux1 LS20 и/или Aux2 LS20 , присутствуют в бактериях, принадлежащих к типу Firmicutes.Хотя для идентификации белков, обладающих высоким сходством с Aux1 LS20 или Aux2 LS20 , использовались строгие настройки, это не означает автоматически, что идентифицированные белки будут содержать мотив Ribbon-Helix-Helix в их N-концевой области, который является характерная особенность как Aux1 LS20 , так и Aux2 LS20 (см.
выше). Поэтому мы провели предсказание вторичной структуры для всех предполагаемых идентифицированных гомологов Aux1 LS20 и Aux2 LS20 (см. Материалы и методы).Результаты этих анализов, представленные в дополнительной таблице S4, показывают, что 86 из 87 (98,9%) и 384 из 387 (99,2%) предполагаемых гомологов Aux1 LS20 и Aux2 LS20 соответственно содержат типичную сигнатуру Ribbon-Helix-Helix в их N-концевой области и тем самым подтверждают точку зрения, что они являются вспомогательными белками соответствующей релаксазы. Таким образом, эти анализы дают убедительные доказательства того, что почти 400 генам релаксазы MOB L предшествует ген, кодирующий гомолог Aux2 LS20 , и что в 87 из этих случаев этому предполагаемому вспомогательному гену предшествует другой вспомогательный ген, кодирующий Aux1. LS20 гомолог.Следовательно, кодируемые pLS20 Aux1 LS20 и Aux2 LS20 являются членами-основателями двух семейств вспомогательных белков типа Ribbon-Helix-Helix, которые кодируются бактериями Firmicutes.
Обсуждение
В этом исследовании мы показали, что гены pLS20cat 56 ( aux1 LS20 ) и 57 ( aux2 LS20 ) кодируют вспомогательные белки релаксосом pLS20cat. В сочетании с нашими ранее опубликованными результатами (Ramachandran et al., 2017), мы определили релаксосомный модуль pLS20cat, который включает oriT LS20 и нижестоящие гены aux1 LS20 , aux2 LS20 и rel Этот модуль встроен в большой оперон конъюгации pLS20cat (Singh et al., 2013). Кроме того, мы предоставили убедительные доказательства того, что Aux1 LS20 и Aux2 LS20 составляют членов-основателей соответствующих семейств вспомогательных белков типа Ribbon-Helix-Helix, гены которых предшествуют большой части генов релаксазы типа MOB L .Таким образом, наши результаты обеспечивают лучшее понимание релаксосомных компонентов, присутствующих на мобильных элементах Gram+ в целом и, в частности, тех, которые принадлежат к типу Firmicutes.
Представленные здесь результаты вместе с результатами, полученными ранее (Ramachandran et al., 2017), показывают, что aux1 LS20 и aux2 LS20 кодируют трансактивные белки, необходимые для конъюгации. Мы также показали, что Aux1 LS20 и Aux2 LS20 образуют тетрамеры и гексамеры в растворе соответственно, и мы не обнаружили взаимодействия между тремя релаксосомными белками pLS20 в тестируемых условиях.Мы не можем исключить возможность их взаимодействия при образовании нуклеопротеинового комплекса при или LS20 . Aux1 LS20 связывался с высокой специфичностью с участком размером 25 п.н., расположенным примерно на 100 п.н. выше сайта nic , который содержит инвертированную повторяющуюся последовательность 5′-TGGTACCA-3′. Предпочтительным сайтом связывания Aux2 LS20 оказался фрагмент из 140 п.н., расположенный в 5′-половине oriT LS20 , который содержит три раза последовательность 5′-TGTGCAT-3′.
В нашем предыдущем исследовании (Ramachandran et al., 2017) мы показали, что производное oriT LS20 , которое включает сайт nic и сайт связывания для Aux1 LS20 , но лишено 5′-расположенного 100 п.н., содержащие два из трех мотивов 5′-TGTGCAT-3′, не были функциональными in vivo . Топология ДНК может оказывать большое влияние на характеристики связывания ДНК-связывающих белков, что, в свою очередь, может влиять на их функцию (Gimenes et al., 2008; Fogg et al., 2012). Области oriT нескольких конъюгативных плазмид содержат внутренний изгиб, который считается важным для оптимального связывания и функциональности релаксосомных белков (для обзора см. De la Cruz et al., 2010). Мы продемонстрировали, что область oriT LS20 также искривлена и что изгиб расположен в 5′-половине области oriT LS20 (Ramachandran et al., 2017), что, как мы показываем здесь, соответствует область, где связываются Aux1 LS20 и Aux2 LS20 (предпочтительно).
Когда мы объединяем результаты, полученные здесь и в нашем предыдущем исследовании, возникает картина, которая схематически представлена на рисунке 4. Aux1 LS20 и Aux2 LS20 связываются с левой половиной или T LS20 , которая внутренне изогнута, и мы предполагают, что образование этого нуклеопротеинового комплекса способствует оптимальному функционированию Rel LS20 . В других системах было описано, что вспомогательные белки стимулируют опосредованное релаксазой никирование в oriT путем вовлечения релаксазы в oriT , вероятно, путем облегчения доступа релаксазы к сайту nic и/или путем действия в качестве молекулярных клиньев для расплавить двухцепочечную ДНК (рассмотрено в Alvarez-Martinez and Christie, 2009).Таким образом, возможно, что вспомогательные белки pLS20 выполняют аналогичную(ые) функцию(и).
РИСУНОК 4. Схематическая модель нуклеопротеинового комплекса, образованного при или LS20 . ДНК показана красной двойной спиралью. Тетрамерная единица Aux1 LS20 , гексамерная единица Aux2 LS20 и мономерная единица Rel LS20 изображены зеленым, оранжевым и желтым рисунками соответственно. Вполне возможно, что связывание одного или нескольких вспомогательных белков с oriT LS20 изменяет топологию ДНК.В данной упрощенной модели это не учитывается.
Большая часть наших знаний о вспомогательных белках связана с белками, кодируемыми конъюгативными плазмидами, реплицирующимися в G-бактериях; в частности, вспомогательные белки F и родственных плазмид подробно изучены на функциональном, биохимическом и структурном уровнях (обзор см. в Alvarez-Martinez and Christie, 2009; De la Cruz et al., 2010; Wong et al. , 2012). После связывания TraY и TraM плазмиды F изгибают ДНК и, таким образом, играют важную роль в организации релаксосомного комплекса в или T и влиянии на реакцию разрыва релаксазы.Кроме того, они оба играют роль в экспрессии генов, регулируя активность своих собственных промоторов.
TraM также играет ключевую роль в доставке релаксосомы в конъюгативную пору за счет взаимодействия с ее родственным T4CP (Wong et al., 2011; Peng et al., 2014). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, выполняют ли вспомогательные белки pLS20 сходные функции с таковыми у F, хотя сомнительно, что Aux1 LS20 и Aux2 LS20 играют роль в регуляции генов из-за различной генетической организации.В случае F моноцистронный ген traM расположен непосредственно ниже его oriT . За TraM следует другой моноцистронный ген, traJ , за которым, в свою очередь, следует большой мультицистронный оперон, в котором traY является первым геном (Zatyka and Thomas, 1998). Однако в случае pLS20 релаксосомные гены встроены в большой оперон конъюгации и находятся под контролем основного промотора конъюгации P c , расположенного почти на 26 т.п.н. выше aux1 LS20 (Singh et al. ., 2013; Рамачандран и др., 2014).
В настоящее время мы не можем полностью исключить возможность того, что релаксосомные гены pLS20cat контролируются дополнительным промотором, который регулируется Aux1 LS20 или Aux2 LS20 . Данные RNAseq показали, однако, что репрессия основного промотора конъюгации приводит к молчанию генов релаксосом, а также др. генов в опероне конъюгации pLS20cat (Singh et al., 2013).
Гораздо меньше известно о вспомогательных белках, кодируемых конъюгативными плазмидами грам+ происхождения.Мономерный белок Helix-Turn-Helix TraN конъюгативной плазмиды pIP501 Enterococcus faecalis связывается со своей областью oriT , что позволяет предположить, что он может быть вспомогательным белком pIP501. Однако недавние результаты показали, что traN не является существенным для конъюгации, и в настоящее время считается, что он может быть репрессором конъюгации, регулируя либо экспрессию оперона конъюгации, либо активность релаксазы TraA (Goessweiner-Mohr et al.
, 2014; Grohmann et al., 2016).
Вспомогательные белки PcfF, кодируемые плазмидой pCF10 E.nterococcus faecalis , и LtrF плазмиды Lactococcus lactis pRS01 имеют 47% идентичности последовательности. Насколько нам известно, это единственные достаточно подробно изученные вспомогательные белки, кодируемые конъюгативными плазмидами грам+ происхождения (Chen et al., 2007, 2008). Гены pcfF и ltrF необходимы для конъюгации, и очищенные гены PcfF и LtrF связывают родственные им oriT s.Более того, данные подтверждают модель, в которой PcfF привлекает релаксазу PcfG к или T и что PcfF, вероятно, в сочетании с релактазой PcfG, взаимодействует с родственным ему T4CP и, следовательно, играет важную роль в доставке релаксосомы в конъюгативную пору.
Описано, что несколько вспомогательных белков конъюгативных плазмид Gram-происхождения содержат мотив RHH. К ним относятся TraY и TraM плазмиды F, TrwA R388, VirC2 Agrobacterium tumefaciens , NikA R64, TraJ RP4, MobC RSF1010, MbeC ColE1, MobC RA3 (Bowie and Sauer, 1990; Zhang and Meyer).
, 1997; Moncalian and De la Cruz, 2004; Ragonese et al., 2007; Йошида и др., 2008 г.; Лу и др., 2009 г.; Варсаки и др., 2009 г.; Годзишевска и др., 2016). Для некоторых из них мутационный анализ на основе структуры продемонстрировал важность мотива RHH в связывании oriT , а также рекрутировании релаксазы (Yoshida et al., 2008; Lu et al., 2009). Интересно, что Aux1 LS20 и Aux2 LS20 , как предполагается, также содержат ДНК-связывающий домен RHH в их N-концевой области (дополнительная фигура S1). Кроме того, наши анализы in silico предсказывают, что вспомогательные белки PcfF и LtrF Gram+ E.faecalis pCF10 и L. lactis pRS01 плазмиды, соответственно, также содержат мотив RHH в их N-концевой области (наши неопубликованные результаты). Присутствие вероятного мотива RHH в Aux1 LS20 и Aux2 LS20 , таким образом, согласуется с выводом, что они являются вспомогательными белками. Что еще более важно, наблюдение, что все вспомогательные белки, кодируемые плазмидами pLS20, pRS01 и pCF10, реплицирующиеся в бактериях Gram+, содержат предсказанный мотив RHH, указывает на то, что это консервативный мотив во вспомогательных белках, кодируемых CEs как Gram-, так и Gram+ происхождения.
и предполагает, что вспомогательные белки имеют общего предка.Мы использовали эту особенность в сочетании с генетической организацией для идентификации предполагаемых вспомогательных генов, расположенных выше генов релаксазы типа MOB L , которые кодируют гомологи Aux1 LS20 и Aux2 LS20 . Эта стратегия привела к идентификации около 400 и 90 генов, кодирующих гомологи Aux2 LS20 и Aux1 LS20 соответственно; Было предсказано, что 99,2% (Aux2 LS20 ) и 98,9% (Aux1 LS20 ) этих гомологов содержат мотив Лента-Спираль-Спираль в их N-концевой области.Таким образом, эти результаты подтверждают точку зрения, что мотив связывания ДНК с N-концевой лентой-спиралью-спиралью является характерным признаком вспомогательных релаксосомных белков. Кроме того, эти данные показали, что Aux1 LS20 и Aux2 LS20 являются членами-основателями двух семейств вспомогательных белков, гены которых генетически связаны с геном релаксазы типа MOB L .
Таким образом, мы продемонстрировали, что гены pLS20cat 56 ( aux1 LS20 ) и 57 ( aux2 LS20 ) кодируют вспомогательные белки pLS20, которые необходимы для pLS20 члены семейств вспомогательных релаксосомных белков, которые кодируются бактериями Firmicutes.
Вклад авторов
Все перечисленные авторы внесли существенный, прямой экспериментальный и/или интеллектуальный вклад в работу. AM-A, J-AH, GR, CG-C, DG-A и JV-C создали все плазмиды и штаммы, очистили белки и выполнили все эксперименты, кроме исследований ультрацентрифугирования, которые были выполнены JL-O и CA. DA выполнил in silico анализов, внесших свой вклад в общий дизайн и анализ результатов. LW и WM разработали план эксперимента и несли основную ответственность за анализ результатов и написание статьи.WM руководил AM-A, J-AH, GR, CG-C, DG-A и JV-C.
Финансирование
Работа в лаборатории Мейера финансировалась за счет грантов Bio2013-41489-P и BIO2016-77883-C2-1-P Министерства экономики и конкурентоспособности правительства Испании для WM, которые также финансировали AM-A, CG-C, и СП-С.
Часть экономической поддержки двух вышеупомянутых грантов была предоставлена «Agencia Estatal de Investigación (AEI)» и «Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER)». Это исследование также было поддержано институциональными грантами от «Fundación Ramón Areces» и «Banco de Santander» для Centro de Biologia Molecular «Severo Ochoa».Работа LW была поддержана грантом Wellcome Trust WT098374AIA для Джеффа Эррингтона. JL-O и CA были поддержаны грантом BFU2014-52070-C2-2-P Министерства науки и инноваций CA. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. J-AH получил Государственный стипендиальный фонд от Совета по стипендиям Китая.
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Обрабатывающий редактор объявил об общей принадлежности, хотя и не о сотрудничестве, с несколькими авторами JL-O и CA.
Благодарности
Мы благодарим Хосе Белио за помощь в подготовке рисунков, а также Маргариту Салас и Джеффа Эррингтона за их поддержку в нашей работе. Мы также хотим отметить полезное обсуждение с другими членами лаборатории и особенно хотим упомянуть Правина К. Сингха.
Дополнительный материал
Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2017.02138/full#supplementary-material
Сноски
- https://www.R-project.org/
Каталожные номера
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., et al. (1997). Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска белковых баз данных. Рез. нуклеиновых кислот. 25, 3389–3402.
Реферат PubMed | Академия Google
Альтшул, С.F., Wootton, J.C., Gertz, E.M., Agarwala, R., Morgulis, A., Schäffer, A.A., et al. (2005). Поиск в базе данных белков с использованием композиционно скорректированных матриц замещения.
FEBS J. 272, 5101–5109. doi: 10.1111/j.1742-4658.2005.04945.x
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Альварес-Мартинес, CE, и Кристи, PJ (2009). Биологическое разнообразие прокариотических систем секреции IV типа. Микробиолог. Мол. биол. Ред. 73, 775–808.doi: 10.1128/MMBR.00023-09
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Боуи, Дж. У., и Зауэр, Р. Т. (1990). Белки TraY F и родственные эписомы являются членами семейства репрессоров Arc и Mnt. Дж. Мол. биол. 211, 5–6.
Реферат PubMed | Академия Google
Брон С., Пейненбург А., Петерс Б.П.Х., Хайма П. и Венема Г. (1989). «Клонирование и (не)стабильность плазмиды в Bacillus subtilis », в Genetic Transformation and Expression , eds L.О. Батлер, Ч. Р. Харвуд и Б. Е. Б. Мозли (Андовер: Intercept Ltd.), 205–219.
Академия Google
Чен, Ю., Стаддон, Дж. Х., и Данни, Г.
М. (2007). Детерминанты специфичности конъюгативного процессинга ДНК в плазмиде pCF10 Enterococcus faecalis и плазмиде pRS01 Lactococcus lactis. Мол. микробиол. 63, 1549–1564.
Реферат PubMed | Академия Google
Чен Ю., Чжан X., Маниас Д., Йео Х. Дж., Данни Г. М. и Кристи П.Дж. (2008). Enterococcus faecalis PcfC, пространственно локализованный субстратный рецептор для секреции IV типа промежуточного переноса pCF10. J. Бактериол. 190, 3632–3645. doi: 10.1128/JB.01999-07
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Де ла Круз Ф., Фрост Л. С., Мейер Р. Дж. и Зехнер Э. Л. (2010). Метаболизм конъюгативной ДНК у грамотрицательных бактерий. FEMS микробиол. Ред. 34, 18–40. doi: 10.1111/j.1574-6976.2009.00195.x
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Дель Солар, Г., Эрнандес-Арриага, А. М., Гомис-Рут, Ф. X., Колл, М., и Эспиноса, М. (2002).
Генетически экономичное семейство кодируемых плазмидами репрессоров транскрипции, участвующих в контроле числа копий плазмиды. J. Бактериол. 184, 4943–4951.
Реферат PubMed | Академия Google
Фогг, Дж. М., Рэндалл, Г. Л., Петтит, Б. М., Самнерс де, В. Л., Харрис, С. А., и Зехидрич, Л.(2012). Больше не запугивают: когда и как ДНК расталкивает белки. Q. Rev. Biophys. 45, 257–299. дои: 10.1017/S0033583512000054
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Форсберг, К. Дж., Рейес, А., Ван, Б., Селлек, Э. М., Соммер, М. О., и Дантас, Г. (2012). Общий антибиотический резистом почвенных бактерий и патогенов человека. Наука 337, 1107–1111. doi: 10.1126/science.1220761
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Фрост, Л.С., Лепла Р., Саммерс А.О. и Туссен А. (2005). Мобильные генетические элементы: агенты эволюции с открытым исходным кодом. Нац. Преподобный Микобиол.
3, 722–732.
Академия Google
Хименес, Ф., Такеда, К.И., Фиорини, А., Гувейя, Ф.С., и Фернандес, М.А. (2008). Внутренне изогнутая ДНК в точках начала репликации и промоутерах генов. Жен. Мол. Рез. 7, 549–558.
Реферат PubMed | Академия Google
Годзишевска Ю., Монкалян Г., Кабезас, М., Бартосик, А.А., Де ла Круз, Ф., и Ягура-Бурдзи, Г. (2016). Согласованное действие релаксазы NIC и вспомогательного белка MobC в конъюгации с плазмидой RA3. Мол. микробиол. 101, 439–456. doi: 10.1111/mmi.13401
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Гессвайнер-Мор, Н., Арендс, К., Келлер, В., и Грохманн, Э. (2013). Конъюгативные системы секреции IV типа у грамположительных бактерий. Плазмида 70, 289–302. doi: 10.1016/j.плазмида.2013.09.005
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Goessweiner-Mohr, N., Eder, M., Hofer, G., Fercher, C., Arends, K.
, Birner-Gruenberger, R., et al. (2014). Структура двухцепочечного ДНК-связывающего белка секреции IV типа TraN из Enterococcus . Акта Кристаллогр. Д. биол. Кристаллогр. 70, 2376–2389. дои: 10.1107/S13914014187
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Гомис-Рут, Ф.X., Сола М., Асебо П., Паррага А., Гуаш А., Эритжа Р. и соавт. (1998). Структура кодируемого плазмидой репрессора транскрипции CopG не имеет лиганда и связана со своим оператором. EMBO J. 17, 7404–7415.
Реферат PubMed | Академия Google
Итая М., Сакая Н., Мацунага С., Фудзита К. и Канеко С. (2006). Кинетика конъюгационного переноса pLS20 между Bacillus subtilis в жидкой среде. Бионауч. Биотехнолог. Биохим. 70, 740–742.
Реферат PubMed | Академия Google
Копек Дж., Бергманн А., Фриц Г., Громанн Э. и Келлер В. (2005). TraA и его N-концевой релаксационный домен грамположительной плазмиды pIP501 обнаруживают специфическое связывание или T и ведут себя как димеры в растворе.
Биохим. J. 387, 401–409.
Реферат PubMed | Академия Google
Ли, Калифорния, и Гроссман, А. Д. (2007). Идентификация источника переноса (oriT) и ДНК-релаксазы, необходимой для конъюгации интегративного и конъюгативного элемента ICEBs1 Bacillus subtilis . J. Бактериол. 189, 7254–7261.
Реферат PubMed | Академия Google
Лу, Дж., Ден Дулк-Рас, А., Хойкаас, П.Дж., и Гловер, Дж.Н. (2009). Agrobacterium tumefaciens VirC2 усиливает перенос Т-ДНК и вирулентность благодаря своей С-концевой ДНК-связывающей складке лента-спираль-спираль. Проц. Натл. акад. науч. США 106, 9643–9648. doi: 10.1073/pnas.0812199106
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Мазель, Д.и Дэвис, Дж. (1999). Антибиотикорезистентность микробов. Клеточная мол. Жизнь наук. 56, 742–754.
Академия Google
Монкалян, Г., и Де ла Круз, Ф. (2004). ДНК-связывающие свойства белка TrwA, возможного структурного варианта надсемейства репрессоров Arc.
Биохим. Биофиз. Acta 1701, 15–23.
Реферат PubMed | Академия Google
Норман А., Хансен Л. Х. и Соренсен С. Дж. (2009). Конъюгативные плазмиды: сосуды общего генофонда. Филос. Транс. Р. Соц. Лонд Б Биол. науч. 364, 2275–2289. doi: 10.1098/rstb.2009.0037
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Охман Х., Лоуренс Дж. Г. и Гройсман Э. А. (2000). Боковой перенос генов и природа бактериальных инноваций. Природа 405, 299–304.
Академия Google
Пендерс, Дж., Стобберинг, Э. Э., Савелкул, П. Х., и Вольфс, П. Ф. (2013). Микробиом человека как резервуар устойчивости к противомикробным препаратам. Фронт. микробиол. 4:87. doi: 10.3389/fmicb.2013.00087
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Пэн, Ю., Лу, Дж., Вонг, Дж. Дж., Эдвардс, Р. А., Фрост, Л. С., и Марк Гловер, Дж. Н. (2014). Механистическая основа связывания плазмид-специфической ДНК с регуляторным белком плазмиды F, TraM.
Дж. Мол. биол. 426, 3783–3795. doi: 10.1016/j.jmb.2014.09.018
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Плута, р., Бур Д.Р., Лоренцо-Диас Ф., Русси С., Гомес Х., Фернандес-Лопес С. и соавт. (2017). Структурная основа механизма разрыва/соединения гистидин-ДНК для переноса генов и беспорядочного распространения устойчивости к антибиотикам. Проц. Натл. акад. науч. США 114, E6526–E6535. doi: 10.1073/pnas.1702971114
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Основная группаR (2017 г.). R: язык и среда для статистических вычислений. Вена: Фонд статистических вычислений R.
Академия Google
Ragonese, H., Haisch, D., Villareal, E., Choi, JH, и Matson, SW (2007). Белок TraM, кодируемый плазмидой F, стимулирует опосредованное релаксосомами расщепление oriT посредством взаимодействия с TraI. Мол. микробиол. 63, 1173–1184.
Реферат PubMed | Академия Google
Рамачандран Г.
, Мигель-Аррибас А., Абиа Д., Сингх П.К., Креспо И., Гаго-Кордоба К. и др. (2017). Открытие нового семейства релаксаций у бактерий Firmicutes. ПЛОС Жен. 13:e1006586. doi: 10.1371/journal.pgen.1006586
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Ramachandran, G., Singh, P.K., Luque-Ortega, J.R., Yuste, L., Alfonso, C., Rojo, F., et al. (2014). Сложный генетический переключатель, включающий перекрывающиеся дивергентные промоторы и образование петель ДНК, регулирует экспрессию генов конъюгации грамположительной плазмиды. ПЛОС Жен. 10:e1004733. doi: 10.1371/journal.pgen.1004733
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Самбрук, Дж., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор.
Академия Google
Шеффер, А. А., Аравинд, Л., Мэдден, Т.
Л., Шавирин, С., Спудж, Дж. Л., Вольф, Ю. И., и соавт. (2001). Повышение точности поиска в базе данных белков PSI-BLAST с помощью статистики на основе состава и других усовершенствований. Рез. нуклеиновых кислот. 29, 2994–3005.
Реферат PubMed | Академия Google
Шильдбах, Дж.Ф., Карзай А.В., Рауманн Б.Е. и Зауэр Р.Т. (1999). Происхождение специфичности связывания ДНК: роль белковых контактов с остовом ДНК. Проц. Натл. акад. науч. США 96, 811–817.
Реферат PubMed | Академия Google
Сингх П.К., Рамачандран Г., Дюран-Алькальде Л., Алонсо К., Ву Л.Дж. и Мейер В.Дж. (2012). Ингибирование естественной компетентности Bacillus subtilis нативным кодируемым конъюгативной плазмидой белком-репрессором comK. Окружающая среда.микробиол. 14, 2812–2825. doi: 10.1111/j.1462-2920.2012.02819.x
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Сингх П.К., Рамачандран Г., Рамос-Руис Р., Пейро-Пастор Р.
, Абиа Д., Ву Л.Дж. и др. (2013). Подвижность нативной Bacillus subtilis конъюгативной плазмиды pLS20 регулируется межклеточной передачей сигналов. ПЛОС Жен. 9:e1003892. doi: 10.1371/journal.pgen.1003892
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Смайли, К., Garcillán-Barcia, M.P., Francia, M.V., Rocha, E.P.C., and De la Cruz, F. (2010). Подвижность плазмид. Микробиолог. Мол. биол. Ред. 74, 434–452.
Академия Google
Соммер, М. О., Черч, Г. М., и Дантас, Г. (2010). Микробиом человека содержит разнообразный резервуар генов устойчивости к антибиотикам. Вирулентность 1, 299–303. doi: 10.4161/viru.1.4.12010
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Соммер, М. О., Дантас, Г., и Черч, Г.М. (2009). Функциональная характеристика резервуара антибиотикорезистентности микрофлоры человека. Наука 325, 1128–1131. doi: 10.1126/science.1176950
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Танака Т.
, Курода М. и Сакагучи К. (1977). Выделение и характеристика четырех плазмид из Bacillus subtilis . J. Бактериол. 129, 1487–1494.
Академия Google
Томас, К.М. и Нильсен, К.М. (2005). Механизмы и барьеры горизонтального переноса генов между бактериями. Нац. Преподобный Микробиолог. 3, 711–721.
Академия Google
Варсаки, А., Монкалян, Г., Гарсиллан-Барсия, М.П., Дренас, К., и Де ла Круз, Ф. (2009). Анализ ColE1 MbeC раскрывает расширенное семейство ленточной-спирали-спирали дополнительных белков, обеспечивающих надрезы. J. Бактериол. 191, 1446–1455. doi: 10.1128/JB.01342-08
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Уотерс, В.Л. (1999). Конъюгативный перенос при распространении резистентности к бета-лактамам и аминогликозидам. Фронт. Бионауч. 4:D433–D456.
Академия Google
Вонг, Дж. Дж., Лу, Дж., Эдвардс, Р. А., Фрост, Л. С., и Гловер, Дж.
Н. (2011). Структурные основы кооперативного распознавания ДНК фактором конъюгации плазмиды TraM. Рез. нуклеиновых кислот. 39, 6775–6788. doi: 10.1093/nar/gkr296
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Вонг, Дж.Дж., Лу, Дж., и Гловер, Дж. Н. (2012). Функция релаксосомы и регуляция конъюгации в F-подобных плазмидах — перспектива структурной биологии. Мол. микробиол. 85, 602–617. doi: 10.1111/j.1365-2958.2012.08131.x
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Йошида Х., Фуруя Н., Лин Ю. Дж., Гюнтер П., Комано Т. и Кайносё М. (2008). Структурная основа роли домена лента-спираль-спираль NikA в инициации бактериальной конъюгации. Дж.Мол. биол. 384, 690–701. doi: 10.1016/j.jmb.2008.09.067
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Затыка, М., и Томас, К.М. (1998). Контроль генов конъюгативного переноса плазмид и других мобильных элементов.
FEMS микробиол. Ред. 21, 291–319.
Академия Google
Чжан С. и Мейер Р. (1997). Релаксосомный белок MobC способствует мобилизации конъюгальных плазмид за счет удлинения разделения нитей ДНК до nick-сайта в начале переноса. Мол. микробиол. 25, 509–516.
Реферат PubMed | Академия Google
Что случилось с Дебби Даннинг?
Если вы понятия не имеете, кто такая Дебби Даннинг, справедливо будет сказать, что за последние несколько десятилетий вы мало смотрели телевизор. В течение долгого времени и даже сейчас она была известна как Девушка-инструмент из «Обустройства дома», поскольку именно здесь у нее действительно был шанс проявить себя с тех пор, как она открыла шоу, и ее взаимодействие с Тимом и Алом время от времени продолжалось, поскольку она была интегрирована в показать немного больше.Кроме того, она была приглашенной звездой в других шоу, снималась в кино и довольно долгое время появлялась то здесь, то там, хотя похоже, что она не была такой активной с 2017 года.
Обычно для этого есть причина. актер отходит на некоторое время в сторону, и это может быть что угодно, от личных причин до идеи, что они просто не занимаются бизнесом в данный момент, а это означает, что им нужен перерыв по той или иной причине. Похоже, что ее карьера продвигается вперед, даже если она не кажется полностью стабильной, поскольку она взяла на себя гораздо больше ролей в качестве гостя, чем в качестве фактической части любого проекта, хотя справедливо предположить, что она могла бы иметь другие проекты идут на стороне и не уделяют столько времени своей карьере.Даже это не кажется точным, но есть так много причин, по которым кто-то может не завоевать популярность как большая звезда, что иногда трудно перечислить их все.
Что можно сказать о Деббе, так это то, что ее, скорее всего, запомнят больше за «Обустройство дома», так как она действительно претерпела переход от простого симпатичного лица, которое представило ведущих шоу, к развитому персонажу, которому была дана сюжетная линия о ней.
своего рода, и был полностью интегрирован в шоу. Это имело смысл, учитывая, как долго она существует, и тот факт, что ее персонаж был довольно интересным, когда людям позволили узнать ее поближе.Слишком многие люди становятся красивыми лицами, которые иногда привыкают к бизнесу, потому что им не дано ничего делать, кроме как хорошо выглядеть, что в некотором смысле является талантом, но в конечном итоге они могут состариться и изнашиваться, поскольку, если человек не может действовать но он постоянно используется как аттракцион, чтобы заставить людей смотреть, придет время, когда люди придут к осознанию того, что они не стоят так много, и пойдут в другое место, чтобы развлечься. Много вспышек и отсутствие содержания обычно в конечном итоге вредит шоу или фильму, поскольку без чего-либо, скрывающегося за впечатляющим внешним видом, на самом деле нет смысла ни в программе, ни в фильме.Тем не менее, с Деббе было приятно наблюдать медленную, но постепенную интеграцию ее персонажа в сериал, поскольку это давало ей больше работы и относилось к ней не как к объекту, а как к реальному человеку.
Во многих отношениях это был положительный шаг для улучшения дома.
Тот факт, что она не была первой девушкой Tool Time, довольно интересен, поскольку, если кто-то помнит, Памела Андерсон была там до Деббе, но, очевидно, ее заменили. Забавно, однако, что Эшли Джадд рассматривалась на эту роль, пока не посчитали, что она слишком талантлива для этой роли.Это указывает на то, что, возможно, Деббе была просто кем-то, кого продюсеры решили назвать хорошими, но факт в том, что, как только Деббе взяла на себя роль, она стала девушкой Времени Инструментов, так как она взяла на себя роль и вроде как слился с Тимом Алленом и Ричардом Карном, по крайней мере, на экране, и заставил его работать очень эффективно. Что касается остальной части ее карьеры, у нее действительно было несколько интересных ролей то здесь, то там, которые держали ее на плаву на протяжении многих лет, и справедливо сказать, что она могла бы легко вернуться и быть гостьей в другом шоу, чтобы сделать ясно, что она по-прежнему запоминающееся лицо и убедительная актриса, но будем ли мы часто видеть ее в ближайшие дни и месяцы, трудно сказать с какой-либо точностью, поскольку на самом деле бывают моменты, когда актеры доходят до просто исчезнуть ненадолго и заняться своей жизнью.
Это другая концепция, чтобы быть уверенным, и некоторые люди почему-то думают, что это странно, но есть люди в индустрии, которые любят время от времени отступать от игры, чтобы заняться своей собственной жизнью и заняться другими интересами.
Что касается доказательства того, что она может действовать, Деббе это уже сделала, но с точки зрения того, где она может появиться в следующий раз, остается только гадать. Но она все равно будет желанным зрелищем.
Приключение; In Hot Pursuit — The New York Times
Мы погрузились в любимую рутину: вставать на рассвете под крики кукабарр и веселое пение Криса, стаскивать бидоны с огня для горячего чая, хватать лошадей за нос. , едим от души — да, тосты Vegemite всегда были доступны — и, наконец, разбиваем палатки перед тем, как упаковать обед и оседлать седла.Наши скакуны варьировались от чистокровных арабов до полуупряжных и получистокровных. Большинство из них были маленькими, с чистыми ногами, холодными твердыми связками и выдержали испытание временем.
Обычно мы проходили в среднем 20 миль в день и не форсировали темп.
Мы ехали группами или гуськом вдоль утесов с той скоростью, которая казалась подходящей. Никто не баловал нас и не учил нас, как ездить, но любой, кто пытался поставить свою лошадь «в раму» или «в повод», получал мягкое напоминание о том, что поездка была долгой и трудной, и, как Банджо Патерсон написал в «Человеке со снежной реки»: «Сейчас бесполезно пытаться ездить верхом.«Мы ездили в стандартных или военных седлах времен Первой мировой войны и тщательно осматривали спины наших лошадей в конце дня, когда мыли их. Если казалось, что седло начинает болеть, всадник на время переключался на запасную лошадь.
Почти всегда машины прибывали в лагерь раньше нас. После установки палаток и выкатывания спальных мешков или мешков, мы протягивали руку помощи во всем, что нужно было сделать, хотя добровольцев, как правило, было мало, когда дело доходило до возведения данни (уборной).Затем было пиво, охлажденное в ближайшей реке, коряги (колбаски) и бифштексы на огне, куча овощей, сладкий липкий пудинг (присланный бабушкой Криса), шутки, декламации и песни, все под Южным Крестом и бесчисленное множество незнакомых созвездий.
Через несколько дней мы увидели нашего первого брамби на маленьком несезонном горнолыжном курорте под названием Dinner Plain. Это был жеребенок-отъемыша, потерявшийся из стаи, который последовал за местным торговцем экипировкой. У него были большие добрые глаза, красиво покатый плечевой пояс и куча паразитов, но хорошая доза лекарства от глистов не могла вылечить.
В Омео была вечеринка в пабе Hilltop, чтобы попрощаться с теми, кто должен был уйти, и поприветствовать некоторых австралийцев, жаждущих погоняться за грубиянами. Мы выкрикивали пиво (купили кружек) всем и каждому, танцевали вокруг музыкального автомата под мелодии 60-х и шумную музыку кустов, и вскоре встретили рассвет. Мытарь снисходительно проводил нас к нашим лошадям, сочувствуя похмелью, пока мыл пол. Выносливая и выносливая порода!
У нас было 10 дней пути, и мы размяли наших лошадей, промчавшись через высохшее озеро в Бенамбре.Дин Бахман и его друг Расти Конолли приехали, чтобы отвезти нас в Известняковую страну и на равнину Дэвис.
На следующий день мы были там. Трехфутовые кучи шершавого помета — часть конского ритуала — и хорошо вылизанные естественные соляные ямы были характерными признаками. За обедом Дин и Расти проинформировали нас, пока некоторые надевали наколенники, а другие практиковались в связывании культей. Три вещи, которые нужно помнить: во-первых, всегда точно следуйте за брамби, потому что он знает путь через коварные, бездонные скрытые болота; во-вторых, если вы обнаружите, что вас оставили одного, не идите дальше — кто-нибудь вернется за вами, — но страна густа и обширна и может поглотить вас; в-третьих, если вы обнаружите, что летите головой вперед в дерево, поднимите голову лошади так, чтобы она врезалась в дерево раньше вас.Отрезвление!
Мы сели спокойно и толкались друг с другом за первые места в гуське — те, у кого были ловчие веревки, сбрасывали их с плеч. Поскольку у стандартных седел нет рогов, идея состоит в том, чтобы найти дерево, как только брамби будет привязан веревкой, сначала привязать его к нему, а затем заменить лассо на недоуздок и веревку, привязанные к передней части седла.
Мы заглянули в подлесок; видимость была около 50 футов. Несколько раз мы останавливались, увидев мелькнувшее движение, которое всегда оказывалось герефордским.Затем полная остановка, и Дин прошептал: «Лошади!» Мы двинулись раньше них, но только те из нас, кто был впереди, видели мелькающие хвосты, когда толпа улетала через подлесок. Прочная оленьая кожа Дина знала свое дело и мчалась за ними по пятам, проворная, как пони для игры в поло, перепрыгивая упавшие бревна, как чистокровная лошадь. В считанные секунды мы потеряли его. Мы перегруппировались и стали ждать, все больше убеждаясь, что Дин поймал брамби.
Вспоминая гандбол Тьерри Анри в 2009 году в матче Ирландии против Франции
Спустя почти семь лет после одного из самых трудных моментов в истории ирландского футбола Уэс Хулахан находится в смешанной зоне Лилля и говорит об этом довольно просто.«Мы в долгу перед Францией», — сказал полузащитник ESPN FC с понимающей улыбкой.
То, что это за «единица» в преддверии воскресной встречи 1/8 финала Евро-2016 между Ирландией и хозяевами, связано с одним из самых громких инцидентов в современном футболе.
На «Стад де Франс» в ответном матче плей-офф чемпионата мира 18 ноября 2009 года ирландцы, проиграв домашнюю игру со счетом 1:0, блестяще сравняли счет благодаря Робби Кину. Команда Джованни Трапаттони была лучшей командой перед выходом в дополнительное время, пока Тьерри Анри не впал в такое отчаяние, что ему не пришлось делать что-то еще самому.Он явно использовал свою руку, чтобы настроить Уильяма Галласа на победный гол, в момент, который с тех пор навис над всем наследием великого форварда. Теперь это висит над игрой 1/8 финала на стадионе «Стад де Жерлан» в Лионе.
Кевин Килбейн играл в той игре, и фактически забил Кину гол. Шведский рефери Мартин Ханссон и его официальные лица полностью пропустили акт мошенничества, но Килбейн этого не сделал.
«Я сразу понял, — говорит Килбейн ESPN FC. «В тот вечер я играл левым защитником, поэтому смотрел прямо через линию.Я видел это ясно. Моей первой реакцией было оглянуться назад, потому что я знал, что лайнсмен был на дальней стороне, думая, что он будет хорошо видеть поле, но он, очевидно, этого не видел».
в перерыве дополнительного времени, и именно тогда его и Айрленда изумление начало трансформироваться в гнев. Здесь очень неправильно. И он сказал: «Я прав на 100 процентов», и я сказал: «Я говорю вам сейчас, когда вы посмотрите это назад, вы будете поражены тем, как вы и ваши чиновники пропустили это». и он сказал, по сути, «отойди от меня сейчас, уходи, я прав на 100 процентов», и он снова повторил это мне.Я сказал «хорошо», ушел, но, честно говоря, когда кто-то так дерзок, а кто-то так высокомерен по отношению к нам, с этим ничего не поделаешь.
«Возвращаясь в раздевалку, это была почти такая же ярость, которая возникла. Просто случилось то, что было настолько плохим решением, что мы не могли его отменить. Это была основная эмоция от этого. Я не Не думаю, что это было даже по отношению к Генри Лично для меня это было больше по отношению к рефери, потому что он сказал это мне.
«Это тоже было в моей голове.»
Кевин Килбейн (слева) умоляет шведского судью Мартина Ханссона объявить игру рукой против Тьерри Анри в матче плей-офф чемпионата мира 2009 года.
Getty Images Что-то еще засело в голове Килбейна той ночью, и то же самое почти у каждого ирландца, который был на стадионе.
«Да, ‘I Gotta Feeling’ от Black Eyed Peas. Я всегда помню, как эта песня звучала в течение всего рабочего дня, и, дело в том, что они почти также включили ее в чертовски суперсилу.
«Раньше мы играли в нее и в процессе подготовки к играм. Пол МакШейн раньше запускал музыку, так что мы как бы отошли от всех лет исполнения песен U2. У Пола она была на iPod, так что это была песня, которую мы играли в раздевалке. Теперь, каждый раз, когда я слышу эту песню, я не думаю о том, чтобы посмеяться в раздевалке. Я думаю о том, как ее играют на «Стад де Франс». мою голову, когда я это слышу».
Пока все это происходило — а will.i.am и Fergie трели — Генри действительно сел рядом с ирландским центральным защитником Ричардом Данном, в другую часть ночи, которая только добавила ему дурной славы.
«В то время он говорил Данни, что это было инстинктивно, он не хотел, чтобы это произошло», — объясняет Килбейн.
«Я полагаю, это было сообщение, которое он хотел, чтобы Данни передал нам обратно, но, хотя мы его видели, вы все равно не могли его по-настоящему почувствовать, пока не просмотрели его на видео.
» Очевидно, его не показывали на большом экране стадиона, поэтому нам пришлось подождать, пока мы не вернемся в раздевалку, прежде чем мы смогли увидеть его ясно, и вы знаете, что это был один из них, очевидно, он действительно имел это в виду!»
К тому времени, когда игроки покинули ошеломленную раздевалку, ирландская команда менеджеров Трапаттони и его помощники Лиам Брэди и Марко Тарделли уже высказывались в СМИ и обсуждали темные теории.
«Вы видели гол, и этого достаточно», сказал Брейди. «Это плохой день для футбола. Когда дело доходит до критической ситуации, кажется, что крупные команды всегда выживают».
Это превратилось во что-то другое, как объясняет Килбейн.
«Я думаю, что это был первоначальный гнев, который начал проявляться, но со временем, когда он начал перевариваться, это была настоящая печаль.
Возможно, мы все еще выходили на пенальти, но у нас никогда не было такого шанса забить второй гол. себя в игре, чтобы выиграть галстук.»
Это еще один аспект игры, и он может иметь большее отношение к этому современному матчу-реваншу. Несправедливость была не просто в решении; Ирландия заслужила победу в еще одном чрезвычайно энергичном выступлении, которое стало почти уникальным для них. Команда Трапаттони доминировала над Францией, продолжая тенденцию в больших играх против больших команд, которая последовала за их Роем Кином. вдохновил на победу со счетом 1:0 над Нидерландами в 2001 году и получил новую жизнь благодаря победе со счетом 1:0 в октябре над чемпионом мира Германией и неожиданному поражению Италии в среду.
В Ирландии редко были люди мирового класса, но они почти всегда обладали стойкостью, превосходящей другие стороны. В этом смысле они могут быть именно той стороной, за которую Франция не хочет играть по большему количеству причин, чем тень руки Анри.
Они боевые.
«Это просто характер стороны», — говорит Килбейн, и Мартин О’Нил еще больше отточил его. Будет ли О’Нил использовать память о Генри, чтобы еще больше уволить команду?
Только пять игроков, участвовавших в той игре 2009 года, на самом деле входят в состав ирландской сборной на Евро-2016, и публично многие в лагере преуменьшают отсылки к истории.Помощник менеджера Кин сказал в пятницу, что «до мести дело не доходит». Однако в частном порядке источники говорят, что дело обстоит иначе. Килбейн соглашается.
«Это будет упомянуто. Что бы ни было сказано, это будет упомянуто. Это не будет одним из тех решающих факторов, но он будет использоваться как инструмент, всего один или два комментария, и они не будут можно сказать в общих чертах. Это будет «послушайте, ребята, мы должны этим парням один»».
Это тоже уже было сказано. Настало время для Ирландии действовать в соответствии с памятью.
Вентура, Калифорния – Местная погода на сегодня, прогнозы на 10 дней – Порты США
Метеорологический радар для Вентуры, Калифорния См.
радар* Воспроизведение показывает погоду за последние 6 часов.
Морской прогноз погоды NOAA для Вентуры, Калифорния
Сегодня днем
Высокая температура: 58ºF
Переменный ветер 5 узлов или менее. Солнечно. W набухает на 3 фута за 10 секунд. Ветровые волны высотой около 1 фута.
Сегодня вечером
Низкая температура: 45ºF
Ветер с востока от 5 до 10 узлов.В большей степени ясно. W набухает на 3 фута за 15 секунд. Волны ветра 1 фут или менее.
Воскресенье
Высокий : 63ºF
Ветер с востока-северо-восток 10-15 узлов во второй половине дня становится юго-восточным. Солнечно. W набухает от 2 до 3 футов за 14 секунд. Волны ветра от 1 до 2 футов.
Воскресенье, ночь
Низкая температура: 49ºF
Переменный ветер 5 узлов или меньше. Возможен небольшой дождь после 4 утра.
W зыбь 2 фута. Ветровые волны 1 фут или меньше.
Понедельник
Высота: 61ºF
ССВ ветер около 10 узлов.Возможен небольшой дождь до 10 утра. З зыбь 2 фута. Ветер волны около 1 фута.
Понедельник, ночь
Низкая температура: 48ºF
ССВ ветер от 5 до 10 узлов. Частично облачно. З зыбь 2 фута. Ветер волны около 1 фута.
Вторник
Высота: 63ºF
ССВ ветер около 10 узлов. Солнечно. Зыбь 4 фута. Ветер волны около 1 фута.
Вторник, ночь
Низкая температура: 50ºF
ССВ ветер от 5 до 10 узлов. В большей степени ясно.Зыбь 5 футов. Ветер волны около 1 фута.
Среда
Высокий: 63ºF
Переменный ветер 5 узлов или меньше. В основном солнечная. Высота волны 5 футов (5 футов). Ветровые волны около 1 фута.
Данные буя NOAA рядом с Вентурой, Калифорния См.
картуЗагрузка карты…
См. другие буи поблизости…
Прогноз скорости ветра для Вентуры, Калифорния
| субботу | воскресенье | понедельник | ||||||||||||||
| Скорость ветра (миль в час) | 9 | 3 | 2 | 5 | 8 | 15 | 14 | 7 | 9 | 8 | 6 | 6 | ||||
| 2 вечера | 6 вечера | 10 вечера | 2 утра | 6 утра | 10 утра | 2 вечера | 6 вечера | 10 вечера | 2 утра | 6 утра | 10 утра | |||||
| МРН | 9 | 3 | 3 | 2 | 5 | 8 | 15 | 14 | 7 | 9 | 8 | 6 | 6 | |||
| DIR | WSW | WNW | NE | NE | NE | NE | NNE | NE | NE | |||||||
Текущие погодные условия в Вентуре, CA
по сравнению с: 1 минуту назад 1 минуту назад
- Температура: 59ºF
- Чувствуется: 58ºF
- Скорость ветра: 9mph
- Направление: 0º (WSW)
- Порыва: 9mph
- Облачная крышка: солнечный
- Видимость: 10 миль
- Давление: 30.
03″ - Влажность: 69%
- Точка росы: 0ºF
03″Сейчас в Вентуре, Калифорния, солнечная погода. 2022 года: 61 ° высокая температура и 49 °F низкая температура. В настоящее время ветер дует со скоростью 9 миль в час и дует с запада-юго-запада. Порывы ветра достигают 9 миль в час. С ветром и атмосферой температура ощущается как 58° по Фаренгейту Ожидаемое количество осадков 1 процент, текущая влажность 69 процентов, атмосферное давление 30.03 дюйма. Видимость 10 морских миль. Текущих предупреждений о погоде нет.
Эминем и Мэрайя Кэри: Хронология каждого дисса, который они сделали
Некоторые распри просто никогда не заканчиваются. Мэрайя Кэри и Эминем были в ожесточенной битве за свои предполагаемые прошлые отношения с начала нулевых. Поп-дива отрицала, что это когда-либо происходило, в то время как рэпер постоянно настаивал на том, что это было.
Мэрайя решила опровергнуть слухи в своем сингле 2009 года «Obsessed», который стал чрезвычайно успешным треком и заставил Эминема выглядеть влюбленным парнем.
Для большинства фанатов история началась и закончилась на этом, но на самом деле было гораздо больше, от мелких подколов друг друга во время тура до угроз Эминема опубликовать интимные фотографии и голосовые сообщения.
Бывший муж Мими Ник Кэннон даже был втянут в драку, и более десяти лет спустя их вражда все еще жива и здорова. Хотя два рэпера якобы оставили свои разногласия позади, Слим Шейди выпустил дисс-трек в декабре 2019 года, который доказал обратное.
«Я знаю, что я и Мэрайя не закончили на высокой ноте / Но этого другого чувака выпороли — эта киска заставила его кастрировать», — сказал Эм в песне Fat Joe «Lord Above» 2019 года в качестве признанного исполнителя. . «Пытался сказать ему, что эта цыпочка чокнутая, пока он не подстриг себе драгоценности/ Чуть не получил пинок по заднице/ Дурак, брось/ Ты не собираешься делать дерьмо/ Я позволил ей отрубить мне яйца, прежде чем я проиграю тебе, Ник ».
Бывший ведущий Wild n’ Out отреагировал на песню, поздравив Fat Joe, бросив вызов своему заклятому врагу в рэп-баттле в Instagram, а позже высмеял возраст Эминема в своем радиошоу.