Педро фонсека биография: Pedro luís da fonseca — Wikipedia

Деодору да Фонсека — Первый Президент Бразилии (1891)

Бразильский государственный и военный деятель. Первый Президент Бразилии (1891).

---

Мануэл Деодору да Фонсека родился 5 августа 1827 года в городе Марешал-Деодору, Бразилия. Рос в семье военных и уже в молодости начал военную карьеру. Окончив в 1847 году военное училище в Рио-де-Жанейро, быстро продвигался по службе, в 1856 году произведен в капитаны. 

С 1848 по 1952 год Фонсека принимал участие в подавлении Прайэйрской революции в Пернамбуку. Затем участвовал в Парагвайской войне 1864-1870 годов, которую закончил полковником. К 1884 году дослужился до фельдмаршала, а вскоре получил звание маршала.

Возглавив в 1886 году провинцию Риу-Гранди-ду-Сул, Деодору да Фонсека сблизился с республиканцами Бенджамином Констаном и Руи Барбозой. Получив предупреждение о том, что императорское правительство распорядилось арестовать выдающихся республиканцев, отправился в Рио-де-Жанейро и возглавил аболиционистское движение в армии.

Император Педро II выступал за отмену рабства в течение десятилетий, освободил своих собственных рабов в 1840 году, но полагал, что с рабством надо покончить медленно, чтобы не повредить экономике Бразилии. Правительство, номинально возглавляемое его дочерью принцессой Изабель полностью отменило рабство в 1888 году, во время ее третьего регентства. Это привело к ухудшению экономической ситуации в стране.

 Разъяренные олигархи сыграли свою роль в последующем государственном перевороте. Престиж Фонсека поставил его во главе военного переворота, который сверг императора 15 ноября 1889 года. Возглавив временное правительство, маршал в первую очередь созвал Конституционную ассамблею, которая разработала Конституцию Объединенных штатов Бразилии.

Деодору да Фонсека, человек по-военному прямой и бескомпромиссный, вступил в конфликт с гражданскими лидерами республиканцев, поэтому его избрание президентом состоялось только после военного давления на Конгресс. В итоге, 26 февраля 1891 года, все-таки избран первым президентом Бразилии.

Фонсека не имел конкретной программы развития страны, из-за чего владельцы крупных кофейных плантаций и другие деловые круги начали критиковать его правительство. Особое неудовольствие республиканцев на юге страны вызвал декрет о передаче порта Торрис в руки частной компании. В итоге, такое недовольство политикой вынудило его ограничить свободу слова и сделать ряд шагов для укрепления военного диктаторского режима.

    Однако Конгресс Бразилии, находившийся в конфликте с правительством Фонсеки, отказался утвердить закон об увеличении армии и принял решение о процедуре импичмента. В ответ на это 3 ноября 1891 года президент распустил Конгресс и объявил чрезвычайное положение.

    В результате, Конгресс, объединившись с командованием флота, оказал Деодору да Фонсеке сопротивление, и последний, во избежание кровопролития и гражданской войны, 23 ноября вынужден уйти в отставку, передав свои полномочия вице-президенту Флориану Пейшоту.

Мануэл Деодору да Фонсека умер 23 августа 1892 года в возрасте шестидесяти пяти лет.

Семья Деодору да Фонсеки

Отец — Мануэль Мендес да Фонсека Гальвана (1785–1859)  

Мать — Роза Мария Паулина де Баррос Кавальканти (1802–1873)

Старший брат — Северино Мартинс да Фонсека, первый барон Алагоаса

Жена — Мариана да Фонсека

15.11.2019

Педро Карвальо (Pedro Carvalho) статистика, биография, фото, видео боев

Поражение	Джей Джей Уилсон 8-0 -0 Событие: Bellator 257 Nemkov vs. Davis 2 Дата: 16.04.2021 Судья: Kevin MacDonald Метод: TKO (Punches) Раунд: 2 Время: 0:53	Bellator 257 Nemkov vs. Davis 2 16.04.2021	TKO (Punches)	2	0:53
нет данных	Патрисио Фрейре 32-4 -0 Событие: Bellator 252 Pitbull vs. Carvalho Дата: 12.11.2020	Bellator 252 Pitbull vs. Carvalho 12.11.2020		0	0:00
Победа	Сэм Сицилия 17-11 -0 Событие: Bellator 226 Bader vs. Kongo Дата: 07.09.2019 Судья: Josh Rosenthal Метод: Submission (Face Crank) Раунд: 2 Время: 1:56	Bellator 226 Bader vs. Kongo 07.09.2019	Submission (Face Crank)	2	1:56
Победа	Дерек Кампос 20-11 -0 Событие: Bellator Birmingham Primus vs. Wilde Дата: 04.05.2019 Судья: Leon Roberts Метод: TKO (Punches) Раунд: 1 Время: 2:02	Bellator Birmingham Primus vs. Wilde 04.05.2019	TKO (Punches)	1	2:02
Победа	Лука Витали 10-6 -0 Событие: Bellator 211 Sakara vs. Kauppinen Дата: 01.12.2018 Метод: Submission (Guillotine Choke) Раунд: 1 Время: 0:43	Bellator 211 Sakara vs. Kauppinen 01.12.2018	Submission (Guillotine Choke)	1	0:43
Победа	Дэниел Кроуфорд 10-3 -0 Событие: Bellator 200 Carvalho vs. Mousasi Дата: 25.05.2018 Судья: Bryan Miner Метод: Decision (Split) Раунд: 3 Время: 5:00	Bellator 200 Carvalho vs. Mousasi 25.05.2018	Decision (Split)	3	5:00
Победа	Ибрагим Кантаев 8-1 -0 Событие: CLFC Cage Legacy 7 Дата: 10.03.2018 Метод: Decision (Unanimous) Раунд: 3 Время: 5:00	CLFC Cage Legacy 7 10.03.2018	Decision (Unanimous)	3	5:00
Победа	Jeanderson Castro 1-3 -0 Событие: CLFC Cage Legacy 4: Halloween Havoc Дата: 29.10.2017 Метод: Submission (Armbar) Раунд: 1	CLFC Cage Legacy 4: Halloween Havoc 29.10.2017	Submission (Armbar)	1	0:00
Поражение	Adenir Araujo 8-2 -0 Событие: IPC 8 International Pro Combat 8 Дата: 16.11.2015 Метод: Decision (Unanimous) Раунд: 3 Время: 5:00	IPC 8 International Pro Combat 8 16.11.2015	Decision (Unanimous)	3	5:00
Поражение	Wisma Lima 2-1 -0 Событие: Invictus Pro MMA League 3 Дата: 20.06.2015 Метод: DQ (Knee to Head of Grounded Fighter)	Invictus Pro MMA League 3 20.06.2015	DQ (Knee to Head of Grounded Fighter)	0	0:00
Победа	Paulo Fonseca 1-1 -0 Событие: Cage Fighters Cage Fighters Challengers 3 Дата: 31.01.2015 Судья: Rodrigo Pereira Метод: Submission Раунд: 1 Время: 1:36	Cage Fighters Cage Fighters Challengers 3 31.01.2015	Submission	1	1:36
Победа	Patrick Fernandes 0-2 -0 Событие: MMA Maranus MMA Maranus 2014 Дата: 08.11.2014 Метод: TKO (Head Kick and Punches) Раунд: 1 Время: 1:42	MMA Maranus MMA Maranus 2014 08.11.2014	TKO (Head Kick and Punches)	1	1:42
Победа	Бруно Борхес 5-4 -0 Событие: Invictus Pro MMA League 1 Дата: 27.07.2014 Метод: Decision (Split) Раунд: 3 Время: 5:00	Invictus Pro MMA League 1 27.07.2014	Decision (Split)	3	5:00
Поражение	Артур Лемос 9-4 -0 Событие: CF Cage Fighters 3 Дата: 28.07.2013 Метод: Submission (Rear-Naked Choke) Раунд: 1 Время: 3:25	CF Cage Fighters 3 28.07.2013	Submission (Rear-Naked Choke)	1	3:25
Победа	Luis Veracruz 0-1 -0 Событие: SF Showfight 14 Дата: 01.06.2013 Судья: Helio Fidelis Метод: Submission (Triangle Choke) Раунд: 1 Время: 2:59	SF Showfight 14 01.06.2013	Submission (Triangle Choke)	1	2:59
Победа	Deiby Lima 1-2 -0 Событие: Cage Fighters Challengers Norte 2 Дата: 03.02.2013 Метод: Decision (Unanimous) Раунд: 3 Время: 3:00	Cage Fighters Challengers Norte 2 03.02.2013	Decision (Unanimous)	3	3:00
Победа	Carlos Silva (Bertinho) 0-0 -0 Событие: Cage Fighters Challengers Norte 1 Дата: 04.11.2012 Метод: Submission (Rear-Naked Choke) Раунд: 1 Время: 1:37	Cage Fighters Challengers Norte 1 04.11.2012	Submission (Rear-Naked Choke)	1	1:37
Победа	Edi Vicente 0-2 -0 Событие: WUFC 2012 Second Round Дата: 15.09.2012 Метод: Submission (Rear-Naked Choke) Раунд: 1	WUFC 2012 Second Round 15.09.2012	Submission (Rear-Naked Choke)	1	0:00

Круговорот португальцев в КПЛ: Эуженио, Фонсека и Бриджидо. Кто останется в плюсе?

В течение нескольких дней в Olimpbet-чемпионате Казахстана произошло интересное событие — все трое португальцев, выступающих в командах КПЛ, сменили клубную прописку. Остаток сезона в новых для себя коллективах проведут Педро Эуженио, Рубен Бриджидо и Карлос Фонсека. Корреспондент Vesti.kz сопоставил эти переходы и определил перспективы каждого из соотечественников Криштиану Роналду.

31-летний лидер «Тараза»

Эуженио перешел в «Астану», 33-летний Фонсека ушел из «Тобола», где не чувствовал себя своим, и присоединился к «Кызыл-Жару». Заменить его в Костанае призван 30-летний Бриджидо, который ушел из «Ордабасы» из-за финансовых проблем.

Интересно, что за всю историю КПЛ в чемпионате играли восемь португальцев. И вот эта троица лидирует по количеству матчей и забитых мячей. Ранее в Казахстан приезжали такие игроки, как Карлитос («Кайсар», 2019), Уго Секу («Иртыш», 2018), Яго Фернандес («Шахтер», 2014), Фаусто Лоуренсо («Атырау», 2013) и Мануэль Курто («Тараз», 2013).

Говоря об Эуженио, все сразу становится понятно. «Астане» нужно усиление перед стартом еврокубковой кампании, а Педро и так дает достаточно «Таразу», но одноклубники не могут демонстрировать тот же уровень игры, что и португалец.

В 18 матчах за жамбылцев в этом сезоне Эуженио забил семь мячей и сделал четыре ассиста. Он был ярким лидером команды, но «Таразу» было сложно сохранить атакующего полузащитника у себя. Предложить действительно нечего, а в столице — и борьба за чемпионство, и еврокубки.

О Фонсеке мы писали отдельно. Проведя более 20 матчей за «Тобол», Карлос так и не стал в команде своим. Он не набрал ни единого очка по системе «гол+пас», но вряд ли кто-то поверит в то, что этот игрок настолько плох. Скорее всего, «Тобол» — это просто-напросто не его команда. В «Кызыл-Жаре» он может почувствовать себя лидером и вернуть игровой голод, которым сверкали глаза полузащитника в «Иртыше».

У Бриджидо в плане статистики дела не сильно отличаются. В текущей кампании он провел 17 матчей. Но за 1176 минут на поле Рубен забил лишь один мяч. Пока сложно сказать, изменится ли что-то у Бриджидо в «Тоболе» и станет ли он для болельщиков из Костаная кем-то большим, чем просто равноценная замена Фонсеке.

Самый выигрышный трансфер, разумеется, случился у Эуженио. Бриджидо и Фонсека тоже довольны. Один остался со стабильной заработной платой и имеет шансы бороться за чемпионство, играть в еврокубках. Второй же почти наверняка вернет себе игровые минуты и почувствует себя частью коллектива.

Окончательные выводы можно будет делать уже после окончания сезона, но пока все выглядит для португальского трио вполне симпатично и позитивно.

Отметим, что Фонсека провел в КПЛ 132 матча за семь сезонов, забив 13 мячей и отдав 14 результативных передач. У Эуженио за два сезона в Казахстане 35 матчей в КПЛ, в которых он забил 12 голов и восемь раз ассистировал партнерам. Бриджидо за такой же срок провел 37 матчей в премьер-лиге, набрав статистику 4+2.

Ранее стало известно, что стан «Ордабасы» покинул еще один легионер.

Фото: ФК «Тараз» (1), ФК «Кызыл-Жар» (2), ФК «Тобол» (3)©️

Все самое актуальное о спорте в вашем телефоне — подписывайтесь на наш Instagram!

gaz.wiki — gaz.wiki

Navigation

• Main page

Languages

• Deutsch
• Français
• Nederlands
• Русский
• Italiano
• Español
• Polski
• Português
• Norsk
• Suomen kieli
• Magyar
• Čeština
• Türkçe
• Dansk
• Română
• Svenska

Жозе Майер

В Википедии есть статьи о других людях с фамилией Майер.

Жозе Майер (порт. José Mayer, род. 3 октября 1949) — бразильский актёр.

Биография

Карьера

Родился в семье медбрата и парикмахерши. Поступил на философский факультет университета г. Белу-Оризонти, но в 1972 году решил стать актёром. и вскоре поступает на работу в театр «Сенак». В течение семи лет он был продюсером, режиссёром, актёром и художником этого театра. Помимо театральной работы, он успевает в 1975 году сняться в двух кинолентах режиссёра Карлоса Уго Кристенсена. В 1979 году он переезжает в Рио-де-Жанейро.

Известность среди бразильского телезрителя и признание критиками его способностей приходит в 1983 г. после исполнения ролей Жоржи Фернанду в минисериале «Бандиты из Фаланже» и Улисеса в популярном комедийном телесериале «Война полов».
За Жозе Майером закрепляется амплуа героя-любовника.

В 1989 г. за исполнение главной роли в минисериале «Исполнитель обещаний» он получает премию ассоциации критиков искусства г. Сан-Паулу (APCA trophy) как лучший актёр. В этом же году он исполняет роль, которую сам особенно ценит в своей карьере — деревенского донжуана Оснара в телесериале Агиналду Силвы по роману Жоржи Амаду «Тиета».

В 1990 году он играет главную роль в сериале «Моя любовь, моя печаль», одном из первых бразильских сериалов, продемонстрированных в России.
Жозе Майер — желанный актёр для каждого сценариста бразильских сериалов. Начиная с середины 1990-х годов он предпочитает работать в сериалах Мануэля Карлоса (История любви,Семейные узы,Присутствие Аниты, Женщины в любви,Страницы жизни, Прожить жизнь).
Он предпочитает исполнять «трудные» роли. Особенно он отмечает одну из таких ролей — комиссара Маттоса из минисериала «Август».

Личная жизнь

Жозе Майер с 1975 г. по настоящее время женат на Вере Фажарду, актрисе. Их единственная дочь Жулия продолжила дело родителей, став театральной актрисой.

Фильмография

• (2016) Закон любви — Тьяу
• (2014) Империя — Клаудио

Ссылки

Фонсека (Колумбия)

Город расположен в юго-восточной части Гуахиры, на правом берегу реки Ранчерия, на расстоянии приблизительно 70 километров к югу от Риоачи, административного центра департамента. Абсолютная высота — 167 метров над уровнем моря. Площадь муниципалитета составляет 719 км².

1. Население
По данным Национального административного департамента статистики Колумбии, совокупная численность населения города и муниципалитета в 2012 году составляла 31 514 человек. Динамика численности населения города по годам:
Согласно данным переписи 2005 года мужчины составляли 49.2 % от населения города, женщины — соответственно 50.8 %. В расовом отношении белые и метисы составляли 70 % от населения города; негры, мулаты и райсальцы — 3.8 %; индейцы — 2.8 %. Уровень грамотности среди всего населения составлял 89.7 %.

2. Экономика
Основу экономики города составляет сельскохозяйственное производство. 55.4 % от общего числа городских и муниципальных предприятий составляют предприятия торговой сферы, 29.3 % — предприятия сферы обслуживания, 14.1 % — промышленные предприятия, 1.1 % — предприятия иных отраслей экономики.

Дата публикации:

05-16-2020

Дата последнего обновления:

05-16-2020

Биография Adriana Fonseca / Адриана Фонсека – Telenovelas com amor ♥

Биография:

Мексиканская актриса родилась 16 марта 1979 в Веракрусе, Мексике. Она была избалованной девочкой в доме, пока не родилась её сестра Жаклин: “Мне было 4 года, когда она появилась, и я начала ревновать. Потом родился мой брат Уго“.

В школе она всегда выделялась хорошими оценками и общением: “Я любила физику, и всегда помогала друзьям её учить”. Но больше всего ей нравилась актерская сфера. Драматические кружки в школе.

Хотя после школы она решила пойти на стоматолога и следовать семейным традициям, но училась она без охоты: “Я пришла на Televisa вместе с подругой и встретилась случайно с вице-президентом, который, заметив меня,  предложил мне роль в сериале “Ад в маленьком городке“‘”.

На съемках у нее завязался роман с Солером, но они быстро расстались: “Мы много работали и у нас не было времени быть вместе”. Она сильно переживала это расставание.

Актриса продолжала сниматься и ей повезло, она получила роль в сериале “Узурпаторша“: “Поклонники смотрели на меня как на кого-то божественного и заставляли меня чувствовать себя особенной”.

Когда она снималась в сериале “Друзья навеки“, ее уволили по причине  опоздания на съёмки, хотя по уверениям самой актрисы, она просто не успела на самолёт.

В 1999 года актриса снялась в сериале “Росалинда“. “Я играла Люси, благородную и чувствительную  девушку, которая живёт и борется за свою семью. Её единственная ошибка заключается в том, что она влюбляется в парня, который любит её сестру”. И во время съемок в сериале она начала встречаться с актером Фернандо Каррильо, но позже они расстались.

Также актриса встречалась с Хорхе Ван Ранкин, но их роман тоже распался. На съёмках сериала “Наперекор судьбе” она начала встречаться с Армандо Араиза, который по сюжету играл её жениха в самом начале новеллы. Актриса даже встречалась с Хуаном Феррара.

Но счастье к ней пришло в лице Икера Кальдерона, который на девять лет моложе её.

Хотя актриса давно уже не снимается в сериалах, она не отвернулась от своих поклонников, с которыми  делится в социальных сетях тем, чем она занимается по сей день.

С 2017 года у нее свой канал на  YouTube , где она делиться анекдотами, советами по актерскому мастерству, упражнениями и советами по здоровью, чтобы её последователи выглядели такими же лучезарными, как и она.

Перевод: Татьяна

 

Педро де Фонсека | Португальский философ

В аристотелизме: от Возрождения до 18 века

… комментарии и подробное толкование; Педро де Фонсека, «португальский Аристотель» в 16 веке, и Сильвестр Маурус, автор коротких, но содержательных комментариев ко всем произведениям Аристотеля, в Риме в 17 веке являются достойными внимания примерами. Однако, поскольку различные схоластики были живыми и интересными философскими движениями,…

Подробнее »,« url »:« Introduction »,« wordCount »: 0,« sequence »: 1},« imarsData »: {« INFINITE_SCROLL »: «», «HAS_REVERTED_TIMELINE»: «false»}, «npsAdditionalContents»: {}, «templateHandler»: {«name»: «INDEX», «metered»: false}, «paginationInfo»: {«previousPage»: null, «nextPage»: null, «totalPages»: 1}, «seoTemplateName»: «PAGINATED INDEX», «infiniteScrollList»: [{«p»: 1, «t»: 212436}], «familyPanel»: {«topicLink» : {«title»: «Педро де Фонсека», «url»: «/ биография / Педро-де-Фонсека»}, «tocPanel»: {«title»: «Каталог», «itemTitle»: «Ссылки», » toc «: null},» groups «: [],» fastFactsItems «: null},» byline «: {» ContributorsUrl «: null,» allContributorsUrl «: null,» lastModificationDate «: null,» contentHistoryUrl «: null,» warningMessage «: null,» warningDescription «: null},» citationInfo «: {» участники «: null,» title «:» Педро де Фонсека «,» lastModification «: null,» url «:» https: // www.britannica.com/biography/Pedro-de-Fonseca»},»websites»:null,»lastArticle»:false}

Узнайте об этой теме в этих статьях:

Вклад в аристотелизм и схоластику

• В аристотелизме: от Возрождения до 18 века

  … комментарии и подробные интерпретации; Педро де Фонсека, «португальский Аристотель» в 16 веке, и Сильвестр Маурус, автор коротких, но содержательных комментариев ко всем произведениям Аристотеля, в Риме в 17 веке являются достойными внимания примерами.Однако поскольку различные схоластики были живыми и интересными философскими движениями,…

  Подробнее

Университет Пердью — факультет компьютерных наук

Доцент кафедры компьютерных наук

Поступил в отдел: осень 2018

Исследования Педро Фонсека сосредоточены на создании систем, которые одновременно являются надежными и безопасными .В течение последних лет он разработал методы и методологии, которые особенно подходят для решения этой проблемы в контексте основных программных систем — строительных блоков в современных вычислениях, на которые критически полагаются другие программные уровни, такие как операционные системы , , гипервизоры . и распределенные системы . Он решает эту проблему с трех сторон:

• Сбор информации о влиянии возникающих тенденций на надежность и безопасность путем проведения реальных эмпирических исследований
• Создание инструментов систематического тестирования, масштабируемых до современных сложных систем
• Проектирование и перепроектирование систем для обеспечения надежности и безопасности

Избранные публикации

MultiNyx: многоуровневая структура абстракции для систематического анализа гипервизоров [pdf].Педро Фонсека, Си Ван, Арвинд Кришнамурти. На 13-й конференции USENIX EuroSys (EuroSys 2018).

Эмпирическое исследование правильности официально проверенных распределенных систем [pdf]. Педро Фонсека, Кайюань Чжан, Си Ван и Арвинд Кришнамурти. На 12-й конференции USENIX EuroSys (EuroSys 2017).

SKI: выявление ошибок параллелизма ядра посредством систематического исследования расписания [pdf]. Педро Фонсека, Родриго Родригес и Бьорн Бранденбург.На 11-м симпозиуме USENIX по разработке и внедрению операционных систем (OSDI 2014)

Последнее обновление: 4 дек.2020 г. 13:55

Педро Фонсека — Портфолио — Graphis

Педро Фонсека — Портфолио — Graphis

Дизайнер

Педро Фонсека

Категория

Дизайн

Название

Карточный домик Минималистский плакат

Дизайнер

Педро Фонсека

Категория

Дизайн

Название

Карточный домик Минималистский плакат

Контактная информация

Электронная почта

pedroferreirafonseca @ gmail.com

Адрес

PT

Симау Педро Фонсека Саброса, Португалия. Статистика, биография, фото, возраст и совпадения

Sound On

Sound Off

23:45 | ¿Это не ваше местное время? Измени это! 23: 45 | ¿Не твое время?

Часовой пояс (GMT-11: 00) Остров Мидуэй, Самоа (GMT-10: 00) Гавайи-Алеутские острова (GMT-10: 00) Гавайи (GMT-09: 30) Маркизские острова (GMT-09: 00) Гамбье Острова (GMT-09: 00) Аляска (GMT-08: 00) Тихуана, Нижняя Калифорния (GMT-08: 00) Острова Питкэрн (GMT-08: 00) Тихоокеанское время (США и Канада) (GMT-07: 00) Горное время (США и Канада) (GMT-07: 00) Чиуауа, Ла-Пас, Масатлан ​​(GMT-07: 00) Аризона (GMT-06: 00) Саскачеван, Центральная Америка (GMT-06: 00) Гвадалахара, Мехико , Монтеррей (GMT-06: 00) Остров Пасхи (GMT-06: 00) Центральное время (США и Канада) (GMT-05: 00) Восточное время (США и Канада) (GMT-05: 00) Куба (GMT- 05:00) Богота, Лима, Кито, Рио-Бранко (GMT-04: 30) Каракас (GMT-04: 00) Сантьяго (GMT-04: 00) Ла-Пас (GMT-04: 00) Острова Фаукланд (GMT-04 : 00) Бразилия (GMT-04: 00) Атлантическое время (Goose Bay) (GMT-04: 00) Атлантическое время (Канада) (GMT-03: 30) Ньюфаундленд (GMT-03: 00) UTC-3 (GMT- 03:00) Монтевидео (GMT-03: 00) Микелон, Св.Пьер (GMT-03: 00) Гренландия (GMT-03: 00) Буэнос-Айрес (GMT-03: 00) Бразилиа (GMT-02: 00) Средняя Атлантика (GMT-01: 00) Острова Зеленого Мыса (GMT-01 : 00) Азорские острова (GMT) Среднее время по Гринвичу: Белфаст (GMT) Среднее время по Гринвичу: Дублин (GMT) Среднее время по Гринвичу: Лиссабон (GMT) Среднее время по Гринвичу: Лондон (GMT) Монровия, Рейкьявик (GMT + 01: 00) Амстердам , Берлин, Берн, Рим, Стокгольм, Вена (GMT + 01: 00) Белград, Братислава, Будапешт, Любляна, Прага (GMT + 01: 00) Брюссель, Копенгаген, Мадрид, Париж (GMT + 01: 00) Западная Центральная Африка (GMT + 01: 00) Виндхук (GMT + 02: 00) Бейрут (GMT + 02: 00) Каир (GMT + 02: 00) Газа (GMT + 02: 00) Хараре, Претория (GMT + 02: 00) Иерусалим (GMT + 02: 00) Минск (GMT + 02: 00) Сирия (GMT + 03: 00) Москва, С.-Петербург, Волгоград (GMT + 03: 00) Найроби (GMT + 03: 30) Тегеран (GMT + 04: 00) Абу-Даби, Маскат (GMT + 04: 00) Ереван (GMT + 04: 30) Кабул (GMT + 05 : 00) Екатеринбург (GMT + 05: 00) Ташкент (GMT + 05: 30) Ченнаи, Калькутта, Мумбаи, Нью-Дели (GMT + 05: 45) Катманду (GMT + 06: 00) Астана, Дакка (GMT + 06: 00) Новосибирск (GMT + 06: 30) Янгон (Рангун) (GMT + 07: 00) Бангкок, Ханой, Джакарта (GMT + 07: 00) Красноярск (GMT + 08: 00) Пекин, Чунцин, Гонконг, Урумчи ( GMT + 08: 00) Иркутск, Улан-Батаар (GMT + 08: 00) Перт (GMT + 08: 45) Евкла (GMT + 09: 00) Осака, Саппоро, Токио (GMT + 09: 00) Сеул (GMT + 09 : 00) Якутск (GMT + 09: 30) Аделаида (GMT + 09: 30) Дарвин (GMT + 10: 00) Брисбен (GMT + 10: 00) Хобарт (GMT + 10: 00) Владивосток (GMT + 10: 30) ) Остров Лорд-Хау (GMT + 11: 00) Остров Соломона, Новая Каледония (GMT + 11: 00) Магадан (GMT + 11: 30) Остров Норфолк (GMT + 12: 00) Анадырь, Камчатка (GMT + 12: 00) Окленд, Веллингтон (GMT + 12: 00) Фиджи, Камчатка, Маршалловы острова (GMT + 12: 45) Острова Чатем (GMT + 13: 00) Нукуалофа (GMT + 14: 00) Киритимати [Отмена]

FONSECA Генеалогия | WikiTree БЕСПЛАТНОЕ Семейное древо

Около 272 FONSECA.

Этот индекс FONSECA был предварительно создан, поэтому он загружается быстро. Щелкните здесь, чтобы просмотреть данные в реальном времени и продвинутые инструменты для сотрудничества, генетической генеалогии, фамилий и т. Д. Мария Доротея Фонсека 6 февраля 1913 г., Техас, США — 25 января 1949 г. под управлением Одри Гонсалес, последний раз редактировалось 17 июля 2021 г. Бенджамин Фонсека мл. 10 февраля 1927 г. Донна, Идальго, Техас, США — 2017 г. под управлением Дж. Манча, последний раз редактировалось 11 июля 2021 г. Эдуардо Фонсека около 1799 Crucitas, Nueva España (Гуанахуато, Мексика) под управлением Ли Г.последняя правка отредактирована 8 июл.2021 Регина Фонсека около 1890 г. Энкарнасьон-де-Диас, Халиско, Мексика — около 1950 г. под управлением Педро Педрозы последний раз редактировалось 24 июня 2021 г. Хосе Фонсека abt 1860 Encarnación de Díaz, Халиско, Мексика — до 1911 Иполит Фонсека около 1833 г. Новый Орлеан, Орлеан, Луизиана, США — 17 ноября 1914 г. под управлением М. Хейни последний раз редактировалось 23 июня 2021 г. Бенита Фонсека abt 1784 Nueva España (Гуанахуато, Мексика) под управлением Ли Г. последняя редакция 19 июня 2021 г. Полина (Фонсека) Фолсе 1915 г. Локпорт, Лафурш, Луизиана, США — 19 июля 2000 г. под управлением Дональда Бруссарда последний раз редактировалось 6 июня 2021 г. Антоне (Фонсека) Мониш 24 декабря 1897 г. Аррифес, Понта-Делгада, Сан-Мигель, Азорские острова, Португалия — 22 сентября 1965 г. под управлением К. Гуле, последний раз редактировалось 31 мая 2021 г. Сидни Бенджамин Фонсека 09 мая 1893 г., Паддингтон, Мидлсекс, Англия, Соединенное Королевство — 14 ноября 1956 г. под управлением Джеффа Бронкса, последний раз редактировалось 29 мая 2021 г. Телес Эмиль Фонсека 05 января 1882 г. Локпорт, Лафурш, Луизиана, США — 8 апреля 1952 г. , управляемый Лиз Кронен, последний раз редактировалось 25 апреля 2021 г. Петра Гертрудис Фонсека abt 1760 San Felipe, Nueva España (Гуанахуато, Мексика) — до 30 марта 1824 г. последняя редакция 22 апреля 2021 г. Хуан Фонсека 1980-е годы под управлением Хуана Фонсека последний раз редактировалось 24 марта 2021 года 1 Мария Изабель (Фонсека) Браун 2 октября 1892 г. Тладжомулко де Суньига, Халиско, Мексика — 1 апреля 1980 г. под управлением Джимми Андерсона, последний раз редактировалось 23 марта 2021 г. Матильда (Фонсека) Смит 8 февраля 1843 г., Пеннант-Хиллз, Новый Южный Уэльс, Австралия — 29 октября 1919 г. под управлением Саймона Росс, последний раз редактировалось 13 февраля 2021 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Луисом Фурлани, последний раз редактировался 5 февраля 2021 г.

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Джейн (Фонсека) Дагган 8 января 1839 г., Пеннант-Хиллз, Новый Южный Уэльс, Австралия — 10 апреля 1924 г. под управлением Саймона Росс Хуан Фонсека 18 ноября 1872 г. Охуэлос-де-Халиско, Халиско, Мексика последняя редакция 7 января 2021 г. Самуэль Фонсека abt 1813 Aldgate, Лондон, Англия — abt 1877 , управляемый Крисом Харрисом, последний раз редактировалось 17 декабря 2020 года Моисей Фонсека около 1799 г. Лондон, Англия — около 7 апреля 1848 г. , управляемый Саймоном Россом, последний раз редактировалось 8 сентября 2020 г. Мануэль Фонсека около 1869 Азорские острова, Португалия под управлением C Goulet последний раз редактировалось 30 августа 2020 года

Не указано на бирже Fonseca

Антонио Фонсека 22 августа 1926 г. Фолл-Ривер, Бристоль, Массачусетс, США — около августа 1926 г. Оливия Фонсека 8 января 1930 г., Фолл-Ривер, Бристоль, Массачусетс, США — 3 мая 2003 г. Мария Магдалена Фонсека около 1760 Саусильо, Санта-Мария-де-лос-Лагос, Нуэва-Галисия (Халиско, Мексика) — до 04 марта 1810 г. последний раз редактировалось 27 августа 2020 г. Хуана Фонсека 01 марта 1933 г. Арройо Гранде, Энкарнасьон-де-Диас, Халиско, Мексика — 18 января 1991 г. под управлением Серхио Муньоса последний раз редактировалось 14 августа 2020 г. Педро Фонсека 29 июня 1908 г. Марикита, Энкарнасьон-де-Диас, Халиско, Мексика — 7 января 1936 г. Андрес Фонсека abt 1800 под управлением Рикардо Родригеса последний раз отредактировал 25 июл 2020

Не включенный в список Fonseca , управляемый Луисом Серхио Хайнцельманном, последний раз отредактировал 23 июля 2020 г.

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Josefa Fonseca abt 1790 Nueva España, Silao de la Victoria (Гуанахуато, Мексика) под управлением RG Gutierrez последний раз редактировалось 8 июня 2020 г. Ф.Fonseca , управляемый Ф. Фонсека, последний раз редактировалось 24 мая 2020 г. 1

Не включенный в список Fonseca , управляемый Луисом Серхио Хайнцельманном, последний раз редактировался 8 мая 2020 г.

Энкарнасьон Фонсека abt 1770 Nueva España, Guanajuato, Mexico , управляемый RG Gutierrez, последний раз редактировалось 30 апреля 2020 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Casimer Russak, последний раз отредактировал 13 апр 2020

Хуан Джозеф Мария Фонсека bef 21 марта 1753 г. Ирапуато, Новая Испания (Гуанахуато, Мексика) под управлением Ли Г.последняя правка отредактирована 18 фев 2020 Джордж Уильям Фонсека 14 декабря 1848 г., Хантерс-Хилл, Новый Южный Уэльс, Австралия — 12 ноября 1850 г., под управлением Саймона Росс, последний раз редактировалось 7 февраля 2020 г. Висенте Фонсека abt 1780 Nueva España под управлением Lee G. последняя редакция 1 января 2020 г. Рафаэль Фонсека около 1800 Силао-де-ла-Виктория, Новая Испания (Гуанахуато, Мексика) Рафаэль Фонсека около 1825 г. Неаполь, Силао-де-ла-Виктория, Гуанахуато, Мексика , управляемый Ли Г. Эутимио Фонсека около 1804 г. Неаполь, Силао-де-ла-Виктория, Новая Испания (Гуанахуато, Мексика) под управлением Ли Г. Доротея Фонсека около 1850 Трехо, Силао-де-ла-Виктория, Гуанахуато, Мексика под управлением Синтии Медрано Хулиан Фонсека bef 16 января 1828 г. Mezquite Gordo, Romita, Guanajuato, México Фелициана Фонсека abt 1835 Trejo, Silao de la Victoria, Guanajuato, México последний раз редактировалось 29 дек.2019 г. Нилтон Фонсека 07 июля 1928 г. Рио-де-Жанейро, Рио-де-Жанейро, Бразилия под управлением Алекса Масиэля последний раз редактировалось 12 декабря 2019 г. Криспина Фонсека 1841 Сан-Хосе-де-Аналько, Гвадалахара, Халиско, Мексика , под управлением А.Bracknell последний раз отредактировал 3 дек.2019 г. Альберт Денис Фонсека 1892 Локпорт, Лафурш, Луизиана, США — 1954 под управлением М. Хейни последний раз редактировалось 25 ноября 2019 г. Педро Ноласко Фонсека около 1796 г. Сан-Хуан, Аргентина — около 27 ноября 1862 г. под управлением Федерико Джезуальдо последний раз редактировалось 23 ноября 2019 г. Хуан Лоренцо Фонсека 05 сен 1808 Батон-Руж, Восточный Батон-Руж, Луизиана, США , управляемый Джимом Кристианом, последний раз редактировалось 30 окт.2019 г. Дионисио Фонсека abt 1720 Portugal под управлением Кьярадии Фернандес последний раз редактировалось 4 сен 2019 Франциска Фонсека abt 1735 Tepatitlán, Nueva Galicia (Jalisco, México) последний раз редактировалось 14 авг.2019 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Кьярадией Фернандес, последний раз редактировался 5 августа 2019 г.

Рамон Фонсека 1838 El Puesto, Ledesma, Jalisco, México последний раз редактировалось 26 июля 2019

Не указано на бирже Fonseca

Гюнтер Фонсека 23 января 1909 года Германия — 13 мая 1972 года , управляемая Аннет Аллен, последний раз редактировалась 25 апреля 2019 года

Не включенный в список Fonseca , управляемый Леонидасом Волькато Дескови Филью, последний раз редактировалось 25 марта 2019 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Густаво Ребаем, последний раз отредактировал 19 фев 2019

Не включенный в список Fonseca , управляемый Аной Питада, последний раз редактировался 3 февраля 2019 г.

Не котирующийся на бирже Fonseca , управляемый Аной Питада

Не котирующийся на бирже Fonseca , управляемый Педро да Фонсека

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Лукас Хосе Фонсека 18 окт 1727 г. Ла Калера, Санта-Мария-де-лос-Лагос, Нуэва-Галисия (Халиско, Мексика) , управляемый Серхио Муньос, последний раз редактировалось 13 ноября 2018 г. Ромуло Фонсека 17 февраля 1883 г. Марикита, Энкарнасьон-де-Диас, Халиско, Мексика

Не включенный в список Fonseca , управляемый Марсело Томелином, последний раз отредактировал 4 ноября 2018 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Джерри Фуллером, последний раз редактировался 5 октября 2018 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Пенни Маккензи, последний раз отредактировал 31 июля 2018 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Родриго Круз, последний раз отредактировал 23 июля 2018 г.

Игнасио Фонсека около 18 мая 1846 г. Охо-де-Агуа-дель-Монте, Охуэлос, Халиско, Мексика , управляемый Остином Пересом Хосе Теофило Фонсека Январь 1806 г. Салитрильо, Санта-Мария-де-лос-Лагос, Нуэва-Галисия (Халиско, Мексика) под управлением Делии Элизондо

Не включенный в список Fonseca , управляемый Педро да Фонсека, последний раз отредактировал 8 июня 2018 г.

Engracia Fonseca bef 1900 — кормовая 1965 под управлением Луиса Франко последняя редакция 12 мая 2018 Хоан Фонсека abt 1660 , управляемый Луисом Вазом, последний раз редактировалось 27 декабря 2017 г. Мария Исабель Фонсека Ноябрь 1793 г. Санта-Мария-де-лос-Лагос, Новая Галисия [Халиско, Мексика] — 1828 г. под управлением А.Bracknell последний раз отредактировал 16 ноя 2017

Не включенный в список Fonseca , управляемый Эдом Веласкесом, последний раз редактировался 10 сентября 2017 г.

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не включенный в список Fonseca , управляемый Сьюзан Шварц, последний раз редактировался 1 сентября 2017 г.

Орландина Фонсека 07 января 1917 г. Гранжинья, Табуасу, Португалия — ок. 2000 , управляемый Луисом Вазом, последний раз редактировалось 27 августа 2017 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Дезире Томас Урнесс, последний раз отредактировал 17 августа 2017 г.

Игнасио Фонсека 1770 г. Санта-Мария-де-лос-Лагос, Новая Галисия [Халиско, Мексика] под управлением А.Брэкнелл

Не включенный в список Fonseca , управляемый Дезире Томас Урнесс, последний раз отредактировал 30 мая 2017 г.

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не включенный в список Fonseca , управляемый Хавьером Моронесом, последний раз отредактировал 26 февраля 2017 г.

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не включенный в список Fonseca , управляемый Ребеккой Гурон, последний раз отредактировал 21 февраля 2017 г.

Eleuteria Fonseca около 1865 Баямон, Пуэрто-Рико , управляемый Карен Лоу, последний раз редактировалось 21 декабря 2016 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Сьюзан Шварц, последний раз редактировался 10 октября 2016 г.

Не указано на бирже Fonseca

Петронила Фонсека около 1770 Сантьяго, Чили — кормовая часть 1814 под управлением Фелипе Варгаса Бриньярделло последний раз редактировалось 7 июля 2016 г. Жан Джастин Фонсека 26 сентября 1871 г. Локпорт, Лафурш, Луизиана , управляемый М. Хейни, последний раз редактировалось 2 апреля 2016 г. Пабло Антонио Фонсека , управляемый Старлой Фетчо, последний раз редактировалось 27 января 2016 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Мелиссой Юинг, последний раз редактировался 11 октября 2015 г.

Кристофер Фонсека 1980-е годы под управлением Кристофера Фонсека последний раз редактировалось 11 сентября 2015 г. 2

Не включенный в список Fonseca , управляемый Дуэйном Хупером, последний раз редактировался 21 июня 2015 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый M-J Fonseca, последний раз редактировался 4 июня 2015 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Даниэлем Таннардом, последний раз редактировался 17 апреля 2015 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Эдуардо Маседой, последний раз редактировался 29 января 2015 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Хельгой Фонсека, последний раз редактировался 23 декабря 2014 г.

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Джейн (Фонсека) Барнетт ок. 1846 г. Олдгейт, Лондон, Англия — 10 октября 1903 г. под управлением Криса Харриса, последний раз редактировалось 23 ноября 2014 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Эдуардо Маседой, последний раз редактировался 25 октября 2014 г.

Golden Fonseca 01 декабря 1861 г., Лондон, Англия — 24 августа 1922 г. под управлением Тома Бернетта, последний раз редактировалось 11 апреля 2014 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Джимом Берри, последний раз редактировался 12 декабря 2013 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Линн Альберназ, последний раз отредактировал 2 сентября 2013 г. Маргарида Фонсека — 2000-е годы под управлением Дориана Бахманна, последний раз редактировалось 1 сентября 2013 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Линн Альберназ, последний раз редактировался 31 августа 2013 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Хорхе Антонио Муньос Валле, последний раз редактировался 16 августа 2013 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Линн Альберназ, последний раз отредактировал 30 июля 2013 г.

Не указано на бирже Fonseca

Ирвинг Фонсека , управляемый Старлой Фетчо, последний раз редактировалось 5 июня 2013 г.

Не включенный в список Fonseca , управляемый Лори Фултон, последний раз редактировался 2 января 2013 г.

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не котирующийся на бирже Fonseca , управляемый Анжелой Куинн

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Не указано на бирже Fonseca

Нина Фонсека , управляемый Полом Уилсоном, последний раз редактировалось 22 декабря 2010 г.

Присоединяйтесь к нам в совместной работе над генеалогическими деревьями FONSECA.Нам нужна помощь хороших специалистов по генеалогии, чтобы вырастить полностью бесплатного общего генеалогического дерева , которое объединит всех нас.

Ортогональный контроль среднего значения и вариабельности эндогенных генов в клеточной линии человека

Характеристика топологии последовательной цепи с двумя индуцибельными активаторами транскрипции

Мы построили TuNR как последовательное соединение двух индуцибельных систем активации транскрипции, где вышестоящая система ( первый узел) управляет производством нижестоящей системы (второй узел) (рис.1A и дополнительный рисунок 1A). Первый узел состоит из ДНК-связывающего домена Gal4, слитого с половиной расщепленного домена связывания абсцизовой кислоты (ABA), который в присутствии ABA собирается со своим родственным гетеродимером, слитым с доменом активации VP-16 ^{35, 36} . Рекрутирование ABA-реконструированного генного продукта первого узла на минимальный промотор вышестоящей активирующей последовательности управляет экспрессией второй индуцибельной системы и mRuby в качестве репортера для транскрипции в этом узле каскада.Второй узел состоит из Staphylococcus pyogenes , не содержащего нуклеазу Cas9 (dCas9), N-конца слитого с половиной домена, связывающего гибберелловую кислоту (GA), и домена активации VPR (p65, VP65, Rta), присоединенного к другой половине. связывающего домена GA. В присутствии GA эти два белка димеризуются и при сопутствующей экспрессии направляющей РНК-мишени (gRNA) способны индуцировать экспрессию интересующего гена (рис. 1A). Мы определили ABA и GA в качестве предпочтительных индукторов малых молекул из-за их предыдущей проверки в других системах млекопитающих, обратимости димеризации родственных белков и независимости каждого события гетеродимеризации ^35,36,37 .Более того, мы выбрали dCas9 в качестве конечного узла TuNR из-за его модульности в нацеливании на любой локус с подходящим смежным с протоспейсером мотивом.

Рис. 1: TuNR снижает базальную проницаемость, усиливает кратность изменения и расширяет доступный динамический диапазон по сравнению с одним индуцибельным активатором экспрессии трансгена.

A Схема цепи TuNR, состоящей из конститутивно экспрессируемой абсцизовой кислоты (ABA) -индуцируемой сплит-системы, состоящей из Gal4 и VP-16. Эта индуцибельная система управляет экспрессией mRuby как репортера и индуцированной гибберелловой кислотой (GA) сплит-системы, состоящей из dCas9 и VPR.Добавление GA и конститутивная экспрессия направляющей РНК (gRNA, не изображена), нацеленной на реагирующий элемент тетрациклина (pTRE), запускают экспрессию mAzamiGreen. B Экспрессия mRuby из TuNR, индуцированная увеличением концентрации ABA в течение 7 дней. Медиа пополнялась каждые 24 часа. Трассировка отображает среднее значение двух независимых клонов. C Зависящая от времени экспрессия mAzamiGreen. Сначала клетки индуцировали 400 мкМ ABA в течение 3 дней, после чего добавляли возрастающие концентрации GA.Измерения проводились в течение следующих 7 дней, поддерживая постоянную концентрацию ABA и GA посредством ежедневного пополнения. Трассировка отображает среднее значение двух независимых клонов. D Количественное определение mAzamiGreen в устойчивом состоянии в зависимости от GA (ось x) и ABA (оттенки красного). Данные собирали на 6 день после добавления ABA и на 3 день после добавления GA.

Мы интегрировали TuNR вместе с кассетой gRNA, нацеленной на элемент ответа на тетрациклин (pTRE) и управляемый pTRE репортер mAzamiGreen в клетках PC9 (рис.1А). Чтобы ограничить мешающие эффекты случайной интеграции схемы, мы изолировали и размножили клеточные линии из одноклеточных клонов. Чтобы охарактеризовать стационарную экспрессию первого узла цепи, мы индуцировали экспрессию с различными концентрациями ABA и измеряли экспрессию mRuby ежедневно в течение 7 дней, пополняя индукционную среду каждые 24 часа. Мы наблюдали постепенную активацию mRuby при всех дозах, каждая из которых достигала устойчивого состояния к 3 дню и сохраняла соответствующую экспрессию mRuby до конца эксперимента (рис.1B и дополнительный рис. 1C). Затем мы охарактеризовали экспрессию второго узла в отдельном эксперименте путем максимального праймирования клеток 400 мкМ ABA в течение 3 дней и затем титрования количества GA. Подобно первой характеристике узла, мы измеряли экспрессию mAzamiGreen и пополняли среду каждые 24 часа в течение 7 дней. Как и ожидалось, мы наблюдали пропорциональную индукцию второго индуцибельного узла, поскольку уровни mAzamiGreen достигли устойчивого состояния к 6 дню для всех дозировок (рис. 1C). В каждом из этих экспериментов мы наблюдали ~ 100-кратную индукцию для каждого соответствующего узла, что согласуется с предыдущими отчетами ³⁵ .Клетки, которые не подвергались воздействию ни ABA, ни GA, имели почти в десять раз меньшую экспрессию mAzamiGreen, чем клетки, примированные ABA, из-за отсутствия базальной димеризации из доменов рекрутирования расщепленных GA (дополнительный рис. 1D). Важно отметить, что индукция TuNR с помощью ABA и GA показала, что экспрессия mRuby, которая сообщает об активности первого узла, однозначно отвечает на ABA, а не на GA, подтверждая, что эти две небольшие молекулы имеют небольшую перекрестную реактивность (дополнительный рис. 1E). ).

Чтобы изучить более полный диапазон экспрессии mAzamiGreen в ответ на одновременную индукцию ABA и GA, мы примировали клетки дозозависимой зависимостью ABA в течение 3 дней и, продолжая индукцию ABA, титровали индукцию с помощью GA и измеряли экспрессию. mAzamiGreen (рис.1D). Как и ожидалось, отсутствие как ABA, так и GA (дополнительный рис. 2B, верхний левый угол) устанавливает базальную экспрессию mAzamiGreen с наименьшим возможным количеством TuNR. В качестве иллюстрации преимущества каскадного расположения активаторов транскрипции без ABA мы обнаружили небольшое изменение активации терминального узла в ответ на увеличение GA (Supplementary Fig. 2B, верхний ряд). Напротив, в отсутствие GA TuNR демонстрирует шестикратную индукцию при добавлении ABA, что согласуется с более ранними экспериментами, предполагая, что утечка возникает из-за накопления активатора первого узла (дополнительный рис.2Б, первый столбец). Когда присутствуют обе небольшие молекулы, TuNR индуцирует экспрессию в большей степени, чем одна из малых молекул по отдельности, достигая максимальной экспрессии mAzamiGreen ~ 1000 раз, когда оба индуктора находятся в их самой высокой концентрации. Примечательно, что цепь активатора транскрипции, опосредованная GA (строки Supplementary Fig. 2B), достигает ~ 100-кратной индукции. По мере увеличения концентрации ABA увеличивается и базальная экспрессия. Это отражает компромисс между максимальной экспрессией и базальной неплотностью (рис.1D). Последовательное расположение активаторов транскрипции ослабляет эту базальную проницаемость, обеспечивая при этом превосходную максимальную индукцию кратных изменений по сравнению с одноузловой схемой.

Индуцируемые системы экспрессии генов как в микроорганизмах ^38,39,40 , так и в клетках млекопитающих ^36,37,41,42 исторически страдали от утечки базальной экспрессии в отсутствие индуктора. Наши данные показывают, что последовательная топология TuNR, благодаря комбинации химически индуцируемых ортогональных доменов рекрутирования, была способна генерировать систему с двумя входами и одним выходом с низкой базальной активностью с плавным континуумом значений экспрессии.Интуитивно каскадная структура действует как детектор совпадений, в котором выходные данные зависят от маловероятной одновременной активации двух активаторов транскрипции в базовых условиях (отсутствие входов малых молекул), таким образом опосредуя низкую базальную активность. Однако при индукции обоими низкомолекулярными активаторами активируется выходная экспрессия, и ее можно точно контролировать путем титрования обоих независимых входных сигналов. Затем мы решили исследовать, может ли изменчивость от клетки к клетке также модулироваться в этой топологии схемы посредством различных комбинаций входов малых молекул.

Последовательная топология TuNR обеспечивает независимый контроль средней экспрессии трансгена и шума

Топология TuNR-цепи, как было показано, позволяет независимый контроль среднего и дисперсии экспрессии трансгенов в дрожжах ^29,34 . Чтобы изучить способность TuNR контролировать гетерогенность популяции в экспрессии интересующего трансгена в клетках млекопитающих, мы создали клональную клеточную линию PC9, которая имеет два идентичных промотора pTRE, на которые нацелен второй узел и которые независимо управляют экспрессией обоих mAzamiGreen. и tagBFP (рис.2А). Мы индуцировали TuNR с помощью двумерной доза-ответной реакции ABA и GA, как описано ранее, и измеряли экспрессию mAzamiGreen и tagBFP в устойчивом состоянии. Индукция TuNR с помощью ABA и GA показала сходные эффекты на среднюю экспрессию mAzamiGreen и tagBFP, причем оба флуоресцентных белка отображали коррелированную, увеличивая экспрессию с обоими индукторами (дополнительный рис. 2).

Рис. 2: TuNR обеспечивает независимый контроль среднего популяции и дисперсии экспрессии трансгена.

А Упрощенная схема ТУНР показана на рис.1а, с добавлением pTRE, управляющего экспрессией tagBFP в той же ячейке, для разложения внутреннего и внешнего шума. B Пример диаграммы разброса экспрессии tagBFP и mAzamiGreen из TuNR, индуцированной 4,94 мкМ ABA и 0 нМ GA. Разложение определяет две основные оси дисперсии: внутренняя дисперсия, которая представляет собой разброс точек, перпендикулярных диагонали; и внешняя дисперсия, представленная разбросом точек по диагонали. C График внутреннего (красный), внешнего (синий) и общего (зеленый) шума, количественно выраженный с использованием коэффициента вариации или CV ² , vs.средняя экспрессия mAzamiGreen содержащих TuNR клеток, подвергшихся воздействию различных комбинаций ABA и GA (каждая комбинация ABA / GA имеет ассоциированное значение внутреннего, внешнего и общего шума, представленное точкой). Заштрихованная область представляет собой пример области настраиваемого шума, как показано в D . D Типичные распределения плотности ядра экспрессии mAzamiGreen для различных комбинаций молекул-индукторов, как указано в C (i, ii, iii и iv), которые достигают одинаковой средней экспрессии в одном из двух независимых экспериментов.*** Padj <<< 0,05; двусторонний критерий Колморгорова – Смирнова (с поправкой Бонферрони), NS: не значимо. Кривая 1 (серая), кривая 2 (светло-пурпурная) и кривая 3 (темно-пурпурная). (i) 1: 2, p = 2,03E — 32; 1: 3, п. = 8,51E — 07; 2: 3, p = 1,09E — 18. (ii) 1: 2, p = 4,83E — 12; 1: 3, п. = 9,42E — 53; 2: 3, p. = 5,48E — 24. (iii) 1: 2, NS; 1: 3, п. = 6,16E — 55; 2: 3, p = 2.36E — 49. (iv) 1: 3, p = 1.17E — 31. Масштабная линейка, 50 мкм. E Репрезентативные изображения экспрессии mRuby и псевдоокрашенной экспрессии mAzamiGreen в одном из двух независимых клональных реплик, соответствующих клеткам из популяций, представленных в D , isomean IV.

Чтобы количественно оценить общий шум для каждой комбинации ABA и GA, мы использовали общую стратегию разложения шума, чтобы установить внешние и внутренние вклады в шум выражения, как показано ранее ⁸ . В этом анализе коррелированная экспрессия между двумя концевыми флуорофорами представляет собой внешний шум или межклеточную изменчивость, тогда как некоррелированная экспрессия — это внутренний шум или совокупные внутриклеточные стохастические эффекты (рис.2B и дополнительный рис. 3) ⁴³ . Основываясь на предыдущих исследованиях, мы предположили, что из-за последовательной топологии TuNR различные комбинации ABA и GA могут достичь одного и того же среднего выражения, но с разными значениями шума. Для количественной оценки шума в системе мы использовали коэффициент вариации (CV ² ). В соответствии с представлением о том, что стохастические эффекты из-за шума счета уменьшаются с увеличением среднего, мы наблюдали сильную антикоррелированную связь между собственным шумом и средним выражением (рис.2С). Вопреки тенденции внутреннего шума, мы наблюдали, что разные комбинации ABA и GA достигают одного и того же среднего значения с разными значениями внешнего шума (рис. 2C). Мы дополнительно исследовали эти «изомические» распределения, и была выявлена ​​общая закономерность: клетки, подвергшиеся воздействию меньшего количества ABA и большего количества GA, имели распределения гистограммы с более высоким CV ² , что свидетельствует о большей межклеточной изменчивости, чем клетки подвергались воздействию высоких количеств АБК и более низких концентраций ГА (рис. 2D и дополнительный рис.4). Эффект умножения между последовательно расположенными активаторами транскрипции, который, как было ранее продемонстрировано, обеспечивает модуляцию шума, сохраняет свою эффективность в этой более сложной эукариотической системе ^10,34 . Способность этой топологии схемы создавать комбинации молекул индукторов, которые достигают того же среднего выхода, но с разными отклонениями, была предсказана более ранней вычислительной моделью ³⁴ . В частности, модель предсказывала, что могут быть достигнуты различные уровни выходного шума с высокой дисперсией выходного сигнала для низких уровней ABA и высоких уровней GA и низкой дисперсией для высоких уровней ABA и низких уровней GA.Это наблюдение было согласованным как для флуорофоров, так и для другой клональной клеточной линии цепи, которая, вероятно, имеет разное количество интеграций цепи, подтверждая, что топология цепи TuNR управляет этим поведением (Supplementary Fig. 5). Чтобы визуализировать гетерогенность, мы визуализировали экспрессию mRuby и mAzamiGreen в двух репрезентативных лунках изомей (рис. 2E). Изображения этих клеток дополнительно подтверждают, что высокая концентрация ABA (высокая экспрессия mRuby, верхний ряд) в сочетании с низкой концентрацией GA приводит к более плотному распределению, которое отображает более однородную, среднюю экспрессию mAzamiGreen среди клеток.Напротив, более низкая концентрация ABA (низкая экспрессия mRuby, нижний ряд) с более высокими количествами GA приводит к более гетерогенному распределению и присутствию клеток mAzamiGreen как с низкой, так и с высокой экспрессией (рис. 2E). Эти данные устанавливают TuNR как синтетическую цепь, которую можно использовать для разделения средней экспрессии и шума интересующего трансгена.

TuNR обеспечивает независимый контроль среднего популяции и дисперсии эндогенных генов

Учитывая возможности dCas9, мы затем попытались бросить вызов TuNR, протестировав его эффективность и модульность в отношении эндогенных локусов.Мы выбрали гены NGFR и CXCR4 в качестве первого доказательства концепции, поскольку их кодируемые белки связаны с мембраной и могут быть окрашены на поверхности живых клеток коммерческими антителами. Кроме того, NGFR и CXCR4 ранее были вовлечены как пролиферативные и метастатические онкогены, соответственно, ^21,44 . Эти два гена представляют различные парадигмы экспрессии для оценки независимого среднего и контроля вариабельности: (i) NGFR , который не экспрессируется в клетках PC9 ²¹ ; и (ii) CXCR4 , который конститутивно транскрибируется линией родительских клеток ⁴⁵ .Нацеливаясь на NGFR , мы стремились проверить степень контроля в гене, в локусе которого отсутствует активный транскрипционный аппарат. В случае CXCR4 из-за его нативной конститутивной экспрессии TuNR будет конкурировать с эндогенным транскрипционным и трансляционным аппаратом в регулировании обилия белка.

Для нацеливания цепи на эндогенные локусы модульным способом мы построили модифицированную линию клональных клеток TuNR «шасси» без кассеты гРНК и подтвердили, что первый узел цепи достиг устойчивого состояния со сравнимой кинетикой с исходным TuNR (дополнительная информация). Инжир.6А, Б). Мы трансдуцировали клетки лентивирусом, несущим ранее проверенные гРНК, которые нацелены на промоторы NGFR (фиг. 3A) или CXCR4 (фиг. 3B) с репортером tagBFP, указывающим на интеграцию ⁴⁶ . Затем мы индуцировали клетки ABA и GA в различных концентрациях, воспроизводя двумерную матрицу доза-ответ, описанную ранее, и измерили уровни белка NGFR и CXCR4 (дополнительный рис. 6C, D).

Рис. 3: TuNR обеспечивает ортогональный контроль среднего популяции и дисперсии эндогенных генов.

A Упрощенная диаграмма TuNR, как показано на фиг. 1A, управляет экспрессией NGFR и B CXCR4 из их эндогенных локусов. C Распределение ядра выражения NGFR для отсутствия индукции (оранжевый) и максимальной индукции (фиолетовый) TuNR. Также показано распределение NGFR в родительской клеточной линии (зеленый). p = 1.97E — 39. D Распределения ядра для выражения CXCR4 для отсутствия индукции (оранжевый) и полной индукции (фиолетовый) TuNR.Также показано распределение CXCR4 в родительской клеточной линии (зеленый). p = 9,62E — 33. E Коэффициент вариации эндогенного NGFR как функция средней экспрессии после активации TuNR в течение 6 дней. F Коэффициент вариации эндогенного CXCR4 как функция его средней экспрессии после активации TuNR в течение 6 дней. G , I Типичные распределения ядер NGFR для разных уровней индукции TuNR, которые достигают того же среднего (изомерического), но различной изменчивости, что обозначено серыми полосами в E .Панель G p = 0,02946; Панель I p = 0,0182297. H , J Типичные распределения ядер CXCR4 для различных уровней индукции TuNR, которые достигают того же среднего (изомейского), но различной вариабельности экспрессии, что обозначено серыми полосами в F . Панель H p = 0,03467; Панель J p = 0,0057441. * Padj <0,05; ** Padj «0,05; двусторонний критерий Колморгорова – Смирнова (с поправкой Бонферрони), NS: не значимо.

TuNR достиг 7,2-кратной средней индукции для NGFR и 3,4-кратной индукции для CXCR4 и (рис. 3C, D), что сопоставимо с уровнями, достигнутыми другими системами с CRISPRa ^47,48 . Кроме того, как наблюдали при модулировании mAzamiGreen, TuNR продемонстрировал незначительный эффект на базальные уровни NGFR и CXCR4 (фиг. 3C, D), демонстрируя, что TuNR минимально нарушает экспрессию базальных генов из-за своей последовательной топологии.

Кроме того, распределения обилия белка на разных уровнях индукции ABA и GA показали почти трех- и двукратный диапазон настраиваемого внешнего шума для NGFR и CXCR4 соответственно (рис.3E, F). Здесь снова, сравнивая распределения с одинаковым средним значением для NGFR (рис. 3G, I) и CXCR4 (рис. 3H, J), мы обнаружили, что низкий ABA и высокий GA привели к распределению с большим CV ² , тогда как высокий уровень ABA и низкий уровень GA воспроизводимо приводили к распределению с более низким CV ² экспрессии в популяциях клеток (дополнительные рисунки 7 и 8). Эти результаты показывают, что TuNR способен точно и ортогонально контролировать отборные гены из их эндогенных локусов и продуцировать клеточные популяции с различными средствами и вариациями в соответствии с регуляцией трансгена.

Жуан Педру душ Сантуш Фонсека | Universidade Católica Portuguesa

У меня есть докторская степень в области молекулярной биологии Венского университета, Австрия, и я работал докторантом в Калифорнийском университете в Сан-Франциско, США, прежде чем присоединиться к Амирис в качестве вычислительного биолога в 2020 году.

В настоящее время я работаю с командой Fermentation BASE над разработкой и обновлением программных инструментов ферментации в малых и промышленных масштабах. Помимо создания новых крутых инструментов, меня интересует синтетическая и системная биология, в частности, разработка генетических схем для контроля клеточного поведения.

https://www.linkedin.com/in/jpfon/

Публикации

Bonny AR *, Fonseca JP *, Park J, El-Samad H. TuNR: ортогональный контроль среднего значения и изменчивости эндогенных генов в линии клеток человека. Nature Communications. 2020. * равный вклад.

Fonseca JP , Вайнберг, З., Асланкухи Э., Эль-Самад Х. Двухфазный ответ протеинкиназы А на циклический аденозинмонофосфат запускает отдельные эпителиальные фенотипы.bioRxiv. 2020

Kuritz K, Bonny AR, Fonseca JP , Allgöwer F. Оптимизация с ограничением PDE для оценки динамики популяции в течение клеточного цикла на основе статических измерений отдельных клеток. bioRxiv. 2020.

Fonseca JP *, Bonny AR *, Kumar GR, Ng AH, Town J, Wu QC, Aslankoohi E, Chen SY, Harrigan P, Osimiri LC, Kistler AL, El-Samad, H. Набор инструментов для быстрого модульного строительства биологических цепей в клетках млекопитающих. ACS Synth Bio. 2019. * равный вклад.

Rosa M, Abraham-Juárez MJ, Lewis MW, Fonseca JP , Tian W, Ramirez V, Luan S, Pauly M, Hake S. Формирование ткани.