Роман Шаронов нашел работу на солнечном острове
У кипрского клуба российский владелец и украинский тренер
Бывший главный тренер «Рубина» Роман Шаронов 311 дней пребывал в статусе свободного агента, регулярно появляясь только в эфирах «Матч ТВ». Но теперь он нашел себе новую работу — в средней команде, которая выступает не в самом сильном клубном чемпионате Европы. Получив недавно лицензию Pro, из-за отсутствия которой Шаронов не мог числиться главным в «Рубине», он стал ассистентом в кипрском «Пафосе».
Сейчас новый клуб Романа занимает 8-ю строчку в чемпионате (всего в главной лиге Кипра 12 клубов) Фото: «БИЗНЕС Online»
РУССКИЙ СЛЕД НА КИПРЕ
Вчера «Пафос» одновременно представил нового главного тренера — украинца Дмитрия Михайленко — и его ассистента Романа Шаронова.
После ухода из «Рубина» последний явно не был настроен завершать путь в футболе, что показал стабильными появлениями в эфирах аналитических программ на «Матч ТВ». Сложно сказать, что Роман был лучшим на разборе матчей еврокубков, но факт, что тренер присутствием в федеральном эфире активно себя «продавал». Хорошо здесь сравнить Шаронова, например, с Курбаном Бердыевым, который после ухода из «Рубина» полностью пропал из информационного пространства, а ведь именитому специалисту явно было что сказать.
«Пафос» — очень молодой клуб: команде из одноименного города — 6 лет. В 2014 году «Атлетический союз Пафоса» слился с другим клубом в совершенно новый проект, который сейчас контролирует российский бизнесмен Сергей Ломакин.
Несколько лет назад одну из руководящих должностей в «Пафосе» занимал экс-скаут «Зенита» Антон Евменов, который в прошлом помогал ЦСКА с поиском Марио Фернандеса, Витиньо и Понтуса Вернблума.
В полузащите команды с нынешнего сезона играет голландец Навароне Фор, который выступал в «Витессе» у Леонида Слуцкого Фото: Marcel Van Dorst / Global Look Press
КОМАНДА С РАЙСКОГО ОСТРОВА
Новая команда Шаронова — совсем не тот клуб, которым он лично рулил в России. «Рубин» под его руководством был командой молодых и не очень опытных игроков, тогда как теперь под управлением тренерского штаба Михайленко и Шаронова опытные и местами даже известные футболисты. Так, в полузащите с нынешнего сезона играет голландец 
Пару в центре поля с ним составляет англичанин Сэм Хатчинсон, который бо́льшую часть карьеры провел в Чемпионшипе, но также отыграл сезон в аренде все в том же «Витессе», когда права на него принадлежали «Челси». Вообще футболистов с английским паспортом в клубе, видимо, ценят: в заявке на сезон есть 34-летний Джейсон Панчон — важный игрок в истории «Кристал Пэлас», которой он отдал 7 лет, а теперь доигрывает в чемпионате Кипра; есть и совсем молодой англичанин, впрочем, по имени Никита Дубов
В целом в новой команде Шаронова собралась интересная интернациональная бригада. Есть два украинца: вратарь Артур Рудько из киевского «Динамо» — основной голкипер «Пафоса» в последних двух сезонах и Орест Кузык — он выступает в полузащите «Пафоса» и пока делает это не очень успешно, возможно, с приходом русскоязычного тренерского штаба его дела пойдут лучше. Защитник Павел Лелюхин три года выступает за «Пафос», раньше его можно было увидеть в играх за команды из систем московских «Динамо» и «Спартака».
С нынешнего сезона в составе кипрского клуба — воспитанник пензенской школы футбола Данила Янов. Возможно, в ближайшее время команда под руководством Михайленко и Шаронова обрастет игроками из стран СНГ, и не исключено, что мы увидим пару человек, знакомых тренеру по «Рубину».
Выбор нового места работы Шаронова можно назвать завидным. Остров, на котором круглый год тепло, — классное место жительства даже по сравнению с не самой холодной Казанью. Именно в столице РТ Роман провел бо́льшую часть своей игровой карьеры и всю тренерскую. Напомним, по завершении игровой карьеры Шаронов работал в структуре казанского «Рубина» советником генерального директора, а также в академии клуба.
С сентября 2017 года Роман был старшим тренером молодежной команды, а после увольнения Бердыева летом 2019-го стал главным наставником первой команды. В декабре прошлого года «Рубин» ушел на паузу в чемпионате России, занимая 13-е место, а Шаронов был освобожден от занимаемой должности.
Добавим, что у Шаронова есть недвижимость на побережье в Италии, теперь же он нашел себе не только еще одно хорошее место для жизни, но и не самый плохой вариант для работы.
Роман Шаронов вошел в тренерский штаб кипрского «Пафоса»
https://rsport.ria.ru/20201021/futbol-1580770489.html
Роман Шаронов вошел в тренерский штаб кипрского «Пафоса»
Роман Шаронов вошел в тренерский штаб кипрского «Пафоса»
Бывший защитник и тренер казанского «Рубина» Роман Шаронов вошел в тренерский штаб «Пафоса», сообщается в аккаунте кипрской футбольной команды в Instagram. Спорт РИА Новости, 21.10.2020
2020-10-21T10:22
2020-10-21T10:22
2020-10-21T10:22
роман шаронов
дмитрий михайленко
рубин
футбол
/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content
/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content
https://cdn23.
img.ria.ru/images/155913/29/1559132977_0:0:3072:1728_1920x0_80_0_0_321ebfef75bc9256d31c281868b9df3e.jpg
МОСКВА, 21 окт — РИА Новости. Бывший защитник и тренер казанского «Рубина» Роман Шаронов вошел в тренерский штаб «Пафоса», сообщается в аккаунте кипрской футбольной команды в Instagram.В «Пафосе» 44-летний Шаронов займет должность ассистента Дмитрия Михайленко, который возглавил клуб во вторник.Шаронов покинул пост тренера «Рубина» в декабре 2019 года.
Спорт РИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
2020
Спорт РИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
Новости
ru-RU
https://rsport.ria.ru/docs/about/copyright.html
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/
Спорт РИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.
xn--p1ai/awards/
Спорт РИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
Спорт РИА Новости
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
роман шаронов, дмитрий михайленко, рубин, футбол
Роман Шаронов: интервью.
5 июня 2019-го датировано окончание второго пришествия Курбана Бердыева. На следующий день Романа Шаронова назначили исполняющим обязанности главного тренера «Рубина».При 43-летнем тренере, игравшем за казанскую команду 11 лет, «Рубин» одержал четыре победы, семь раз сыграл вничью и восемь раз проиграл. 16 декабря Шаронов покинул должность с формулировкой «по взаимному согласию сторон». Команда шла на 13-м месте.
И главным тренером стал Леонид Слуцкий. Сейчас «Рубин» – 10-й. И это заставляет вспомнить старую рекламу стирального порошка.
В интервью «Спорту День за Днем» Роман Шаронов вспомнил об уходе из «Рубина», работе с командой и многом другом.
Тезисы:
«Клубы шарахаются, когда нет четкого направления».
«Истерии не работают».
«Сомнения всегда мешают. И ожидания тоже».
«Был уверен, что ситуация в Рубине станет лучше».
«Невозможно работать, когда тебя не понимают».
«Не надо искать причину того, что делаешь, хотя они есть всегда».
«Если мы начнем искать причины, то забудет о том, что делаем».
«Хочу, чтобы все решилось в честной, спортивной борьбе. Но, к сожалению, в этом чемпионате этого не хватает. С начала турнира».
– Как ваши дела? Чем занимались полгода после ухода из «Рубина»?
– У меня был новый опыт – выступал экспертом на «Матч ТВ». Мне понравилось участвовать в разборах игр.
Мне нравилось в «Тотальном футболе» то, что мы не говорили про конкретные эпизоды, голы, мы говорили про игру в целом. Разбирали команды, то, как они строят игру. Это хороший опыт. Тем более, что мы обсуждали матчи топ-чемпионатов. Сейчас провожу много времени с семьей. Смотрю много матчей. За это время узнал для себя очень много полезного. Смотрю матчи, обращаю внимание на детали.
– Как на ваши планы повлияла пандемия COVID-19?
– Я планировал поехать на стажировку – в Италию или Германию.
– В июне вы сдали экзамен на категорию PRO. Значит ли это, что у вас есть предложения? Или это «превентивный удар»?
– Нет. Все шло последовательно. Я прошел все стадии – B, A, и только по срокам не смог поступить на предыдущий поток на категорию PRO. Для того, чтобы исполнять обязанности в «Рубине» до конца.
И мне пришлось ждать около года. Предложения не поступали после того, как я начал обучение на категорию PRO.
– Были предложения до получения лицензии – после ухода из «Рубина» и до начала обучения?
– Конкретных предложений не было. Был вариант из Европы. Интерес, без переговоров. Не топ-чемпионат.
– Какой?
– Не скажу, так как нет смысла об этом много говорить. Не топ-чемпионат. Этот клуб участвовал в еврокубках.
– Почему футболисты и тренеры зачастую так отвечают? Не говорят, какие были предложения? «Было предложение… Но откуда конкретно называть не буду, нет смысла». Футбольная этика?
– Во-первых, тот клуб проявил лишь интерес. Они выбрали другого тренера. И да, это этика. Ведь в моем случае был лишь интерес. Если бы прошли переговоры, то, возможно, я бы назвал команду.
– Есть ли клуб, которому вы откажите несмотря ни на что? Что вас может смутить, даже если уровень чемпионата будет подходящий?
– Я жду предложений. Но не буду бросаться, соглашаться на любое предложение.
– Хорошо. На какие вещи вы обратите внимания в первую очередь? Что должно вас удовлетворить в клубе?
– Перовое – что хочет от меня клуб. Знают ли, какой футбол я хочу видеть и в какой играю. Подхожу ли я под философию. Какое направление у клуба, какая у них цель. Задачи. Важна стратегия. Направление. Оно может быть разным, но должно быть. И быть четким. Ты должен понимать куда ты идешь и зачем. И когда нет четкого направления, то и нет стабильности. Поэтому клубы и шарахаются. Игроки не подбираются под конкретного тренера, они подбираются под философию клуба. Тренер и игроки. Но на эту тему можно много говорить.
– Прошлым летом «Зенит» продал Кристиана Нобоа. Вы хотели видеть его в команде? Вели переговоры?
– Конкретных переговорах не было. Но он был в списке. У клуба были ограниченные возможности поведения на трансферном рынке.
– Некоторые ваши бывшие партнеры продолжают карьеры – Рыжиков, Нобоа. В чем плюсы и минусы работы главного тренера с бывшим партнерами?
– Плюсы и минусы назвать не могу.
Но надо переключаться на отношения тренер – игрок. Мне сложно сказать, как бы это было. Важно поведение игрока именно в плане футбола. Мы не должны жить прошлым, вспоминать, как играли вместе. Нужно, чтобы футболисты выполняли требования. Профессиональное отношения.
– Вы бы ощущали дискомфорт, смущение? Есть молодые футболисты, которые смотрят на вас лишь как на тренера. И рядом с ними сидит ваш бывший партер, которому вы объясняете нюансы тактики.
– Думаю, нет. Все зависит от собственного поведения. Информации, которую даешь. От того, как себя ставишь. Если ты себя поставишь, как бывший партнер, то будет одно. Нужно объяснить, обозначить свою зону ответственности, как тренера, а игроку – свою. Тогда проблем не будет.
– Психологически одно и то же – наорать, напихать на бывшего партнера как на игрока, или напихать молодому футболисту? Или важно, чтобы подача «пихания» была равной для всех?
– Тренеру нужно контролировать эмоции. И что значит – наорать? Это неправильно.
Нужен баланс в том, как ты подаешь информацию. Главное – чтобы ее воспринимали. А каким образом – это второй вопрос. Но истерии не работают.
– Тренер должен одинаково относиться к ветеранам и молодежи? Или должен быть разный подход в общении и подготовке? Кому-то позволить больше, кому-то – меньше?
– Не нужно особо разделять на молодых и возрастных. Но каждому нужен подход. Внимание, даже, нужно уделять больше тем, кто играет реже. Баланс индивидуальных бесед и групповых. Но каждому игроку нужно уделять внимание, нельзя забывать. Знать его психологию, и исходя из нее строить контакт.
– Вы не раз говорили с Хвичей Кварацхелией о его игре. Но он продолжает увлекаться индивидуальной игрой в ущерб командным действиям. В 29-м туре против «Ростова» он показал яркую игру, дриблинг. Но проходил нескольких, терял мяч. Почему вы до него не достучались? И Слуцкий тоже, раз Хвича не меняет подход.
– Тяжело рассуждать о том, в какой футбол он играл в детстве. Что было заложено – только дриблинг ил понимание игры.
Хвича очень сильно любит мяч, отдается игре полностью. На данный момент он игрок эффектный.
– Несмотря на разговоры с вами и Слуцким, его не стиль сильно изменился. Почему нельзя посадить в запас?
– Не могу говорить про настоящее время. Я его не сажал в запас, не искал наказания. Искал оптимальное время для него – то, в которое он может проявить свои лучшие качества, исходя из того, сколько он готов играть. Это ни в коем случае не наказание. Он выходил на замену в тот момент, когда его качества могли принести пользу команде. Он прогрессировал, но все не делается сразу. Болельщики видят, как он обыгрывает, смотрят на яркий эпизод. Но часто есть более простое решение – например, вертикальный пас. Потенциально он – игрок основы. Но потенциал может остаться потенциалом. Нужно расширять кругозор футболиста. И я даже не говорю про оборону. Нужно развивать инструменты, а инструменты – это не только дриблинг.
– Что случилось с Ташаевым? Он подавал надежды в «Динамо».
Растворился в «Спартаке», был неярок в «Рубине».
– У него есть хорошие качества –скорость, вертикальные открывания. Он очень хотел себя проявить. И, может быть, эта внутренняя чрезмерное желание иногда ему мешало, не давало играть раскрепощенней. Сверхжелание, возможно, мешало ему и в «Спартаке». Мне сложно ответить однозначно, ведь мы работали вместе не так долго. В карьере бывают периоды, когда не получается. Но в плане работы у меня не было к нему претензий.
– Болельщики иногда говорят: «Игрок перешел в команду уровнем выше. Получил жирный контракт – и расслабился». Уместно?
– Конечно, уместно. Игроки должны думать о футболе. Финансы – это последствия игры. Качеств, которые они показывают. Как только они меняют приоритеты, то начинается деградация.
– Но это не то, что произошло с Ташаевым? Вы сказали, что у вас не было претензий по тренировкам.
– Я не знаю, что он делал в «Спартаке». В «Рубине» он отдавался футболу на 100 процентов.
– К чему вы готовились, когда вас назначили и.
о. в прошлом году? Ожидали, что будет проще, сложнее?
– Ни к чему не готовился. Поступило предложение – я его принял и включился в работу. Был сконцентрирован на самом процессе. И в слове «процесс» вложено многое – тренировки, коммуникация с игроками, комплектование в минимальный срок, информация по своим идеям для игроков.
– Сомнения? Завышенные ожидания?
– Нет, ничего такого. Сомнения всегда мешают. И ожидания тоже. Чем выше ожидания, тем больше разочарование. Жил сегодняшним днем. Сомнения сеют дисбаланс и неуверенность в себе. По ходу чемпионата у меня были моменты, когда я убирал неуверенность у игроков. Делал так, чтобы они верили в то, что мы делаем.
– Как на вас как на тренера и личность повлиял уход из «Рубина»? Вспомните первые эмоции, когда узнали об этом. Гнев? Разочарование? Злость? Непонимание?
– Чувство недоделанной работы.
Одно дело – если бы я не управлял игроками. Если бы они не понимали, во что мы играем, и куда идем, то я бы ушел сам. Ведь невозможно работать, когда тебя не понимают. Но я видел, что есть прогресс.
– То есть вы понимали, что можете улучшить результаты?
– Конечно. В чемпионате были серии в несколько поражений. Важно было, как мы отреагируем на серию проигрышей. Можно говорить про очки, неиспользованные моменты, мячи забитые и пропущенные. Но я говорю о другом – я управлял командой, и самое важное, что мы не отошли от своих принципов. У меня была уверенность, что станет лучше. Но нужно было усилить несколько позиций. Потому, что некоторые идеи было невозможно реализовать без новых игроков. Но фундамент у команды однозначно был.
– Вы ушли, когда «Рубин» занимал 13-е место. Сейчас, при Слуцком, на 10-м. У вас появилась мысль: «Зачем платить больше, если… »?
– Не ко мне вопрос. Я делал то, что зависит от меня. Решения принимал только на футбольном поле.
– Какие ваши недочеты убрал Слуцкий, а что хорошее, наоборот, разрушил?
– Во-первых, многие игроки ушли, многие пришли.
Это разные команды по возможностям, которые были в трансферные окна. Одни возможности летом, другие – зимой. И это не мое дело сравнивать – я уважаю каждого тренера, вне зависимости от футбола, который он исповедует. Ведь футбол – это не шаблон, где все одинаковое.
– Хорошо, поставлю вопрос иначе – что поменялось?
– Изменения, конечно, есть. Но назову одно. Изменилась структура в атаке. И я не говорю – в лучшую или в худшую сторону. А все остальное – это дело людей, которые разбирают игры, и делают из этого выводы.
– Вы сказали, что сравнения неуместны, но некоторые специалисты говорят о том, что Николич не поменял игру «Локомотива».
– Одно дело – когда есть предсезонная подготовка, время на воплощения идей и принципов. И другой момент – когда тренер приходит во время сезона. Нет времени что-то изменить. Нет времени на изменения требований, стиля. Не думаю, что он ничего не поменял. Мне кажется, «Локомотив» стал больше играть в позиционке. Есть точечные изменения.
Но изменения постепенно будут проявляться.
– Ваши игроки называли вас отличным мотиватором. Как мотивировать команду середняка в конце сезона? Когда, скажем, за два-три тура до конца понятно, что она не вылетит и не займет место в еврокубках.
– Этому меня научил Курбан Бикиевич Бердыев. Научил относиться к футболу на 100%. Все идет от головы. Важно понимать, что это дело твоей жизни. Нужно думать только о том, что ты делаешь, и как ты это делаешь. Не искать причину, хотя они есть всегда. Я говорил всегда игрокам о том, что мы не ищем оправданий. Если мы начинаем их искать, то забудем о том, что мы делаем. Поэтому главное делать то, что зависит от тебя. Оправдания – это способ снять с себя ответственность .
– Есть клише – «чемоданное настроение». Игроки уезжают в отпуск сразу после последнего матча, не возвращаясь в город. Как бороться с таким настроением и подготовить для достойной игры?
– В каждом моменте надо работать, не делить на важное – неважное.
И ситуация зависит от обстановки в команде. От реакции тренера. Если тренер, например, начинает паниковать после проигрыша, то это отразиться на команде. Информацию несет тренер. Первое – это информация, после – требования. Если тренер говорит о том, что сегодня – игра важная, а потом – не очень, то что потом скажут тебе игроки? Если ты сам, тренер, хочешь выигрывать любую игру, то ты так себя и будешь вести. Требовательность, профессионализм – можно подобрать много слов. Другой вопрос, что будет, если ты ведешь себя иначе, разделяя игры по значимости.
– Еще про мотивацию и психологию. Слова Александра Медведева про «Спартак» перед полуфиналом кубка могут повлиять на игроков московской команды? Такие нюансы влияют на футболистов?
– Про Дзюбу? Ох… Не хочу много об этом говорить, так как для меня это – too much. Есть мотивация Гвардьолы, когда он сказал: «Не надо шушукаться, а давайте все решать на поле».
– Если бы такое сказали про вашу команду, то вы бы упомянули об этом на установке?
– Нет.
Ни в коем случае. Не надо отвлекаться. Надо делать свою работу.
– Вы ожидаете открытый или закрытый футбол в матче «Зенит» – «Спартак»?
– Ожидаю все, что угодно, ведь стратегию на конкретную игру выбирает тренер. Жду бескомпромиссной игры, ведь мотивация для нее не нужна. И надеюсь, она будет без околофутбольных дел. Хочу, чтобы все решилось в честной, спортивной борьбе. Но, к сожалению, в этом чемпионате этого не хватает. С начала турнира – и до нынешнего момента.
– Например?
– В первой половине сезона VAR был не у всех. Но он должен работать либо у всех, либо ни у кого. Иначе получаются неравные условия. Так как часто из-за VAR решается результат. То, что сейчас происходит… Я не буду много комментировать… Условия разные, нет спортивного принципа. И я хочу, чтобы судьба Кубка решилась на поле, в честной борьбе.
– Спросил про открытый футбол, так как бытует мнение, что против «Зенита» только «Краснодар» в РПЛ может успешно играть в открытый футбол.
Это верно?
– У «Зенита» одно преимущество – самый сильный состав. С ними можно играть… А открытый футбол, закрытый… Знаете, эта тема для большого разговора. Я до конца не понимаю эту терминологию. Есть такой футбол, когда ты хочешь владеть инициативой. Суть в том, чтобы заставить ошибиться. А бывает так, когда ты ждет ошибки. Я делю так, а не на «открытый» и «закрытый». Мне непонятно это.
– Если тезисно, то почему у Курбана Бердыева не получилось возвращение в «Рубин»?
– В плане результата?
– Да. От возвращения ждали большего специалисты и болельщики.
– Мое мнение, и не более. Проблема была с финансированием. Он приходил под одни условия, а получилось иначе. Ему было тяжело комплектовать тот состав, который хотел.
– Чем он сейчас занимается? Планирует вернуться к работе?
– У меня с ним нет контакта. Сожалею, что не удалось с ним поговорить в тот момент, когда я принял команду. Но поговорить с ним хотелось бы и хочется на футбольные темы, не раз об этом говорил.
фото: «Спорт-Экспресс», «Бизнес Онлайн».
Читайте также
Малафеев: почему ушел из клуба, как подписал Оздоева, за что хейтят «Зенит»
Источник: «Спорт День за Днем»
Оцените материал:
Добавьте «Спорт день за днём»
в список ваших источников
Роман Шаронов — фото, биография, личная жизнь, новости, футбол 2021
Биография
Роман Шаронов — российский спортсмен, игравший на позиции защитника за национальную сборную и выступавший за «Металлург», «Шинник», «Терек» и «Рубин». В составе национальной команды футболист участвовал в чемпионатах Европы 2004 и 2012 годов и вошел в список четырех бэков символической сборной, который по итогам сезона ежегодно составляет ответственный исполнительный комитет.
Детство и юность
Роман Сергеевич Шаронов родился 8 сентября 1976 года в подмосковном поселке Пироговский и с раннего детства полюбил играть в футбол.
Мечтая о хорошей экипировке, мальчик гонял по импровизированному полю индийский мяч, становившийся при надувании непомерно огромным, и ликовал, когда ему и брату достались кроссовки, привезенные из Европы.
С разрешения семьи Роман поступил в школу со спортивным уклоном и, начав юношескую карьеру в дубле московского «Локомотива», из-за отсутствия денег «зайцем» ездил в электричках до станции Черкизово из отдаленных Мытищ.
Когда стало понятно, что у молодого футболиста нет шансов стать игроком основного состава «железнодорожников», подвернулось выгодное финансовое предложение от китайцев, и в ситуации, когда мать и отца уволили с работы, Рома решил поехать в «Фуабей».
Футбол
Однако матчи во втором дивизионе Азиатской лиги не удовлетворили материальные потребности футболиста, который спустя полгода вернулся на родину и сразу попал в красноярский «Металлург».
А потом из-за недостатка игровой практики была черная полоса в жизни, и Шаронов, вопреки спортивному распорядку, посещал ночные клубы и начал курить.
В конце 1990-х годов в спортивной биографии Романа произошли кардинальные изменения, и по приглашению тренера Курбана Бекиевича Бердыева футболист перешел в казанский «Рубин». Начав сражение в Первой лиге, Шаронов вместе с командой завоевал 1-е место в чемпионате своего дивизиона и стал членом высшего футбольного общества, которое в России носит название РФПЛ. Но следующий сезон оказался неудачным, и выше 10-го места «Рубин» подняться не смог.
Такие результаты заставили Шаронова снова начать скитания в поисках подходящей команды, и его выбор пал на «Терек» из Грозного, который впервые попал в элитный чемпионат. Однако, несмотря на приложенные усилия, игра у дебютантов совсем не сложилась, и, надолго вылетев из Премьер-лиги, этот клуб был в середине 1-го дивизиона.
Со сменой тренерского штаба и руководства в 2017 году получил новое название «Ахмат».
Ненадолго отвлекшись на участие в европейском первенстве в составе национальной сборной и заработав красную карточку в игре с испанцами, Шаронов испытывал жгучее желание покинуть аутсайдеров, но от этого шага его удержал контракт.
Проведя следующий сезон в ярославском «Шиннике», защитник снова смог договориться с казанским «Рубином» и в качестве игрока основного состава в 2008 году вернуться в главный российский чемпионат. На этот раз удалось дважды завоевать медали национального первенства и в финале Кубка России бороться за победу с московским ЦСКА.
В 2009 году игрока преследовали травмы, и он на полгола выпал из футбола из-за операции на крестообразных связках. А в апреле 2011-го на встрече «Рубина» со «Спартаком» из Нальчика Шаронов вышел на поле в основном составе, таким образом отметив 200-й сыгранный за казанцев матч.
Личная жизнь
В молодости Шаронов имел неудачный опыт в личной жизни, а после развода с супругой из Подмосковья у него появилась первая дочь. Переехав в Казань, футболист познакомился с телевизионной ведущей Надеждой Шейн, которая брала у него интервью для спортивного эфира и, поняв одиночество Романа, выразила желание ему помочь.
Роман Шаронов и его жена НадеждаПосле нескольких свиданий, во время которых пара говорила о «всякой ерунде» вроде кино и татуировок, женщина согласилась стать второй женой защитника. По прошествии свадьбы родила ему троих детей. И с этого момента в Instagram Нади публикуются десятки семейных фото, на которых поклонники футболиста видят, несомненно, счастливых людей.
Роман Шаронов сейчас
Завершив профессиональную футбольную карьеру, Шаронов после стажировки у бывшего коллеги Сергея Семака остался в «Рубине» в качестве помощника.
В 2019 году после ухода Бердыева выяснилось, что до получения специальной лицензии Роману не удастся на правах главного тренера возглавить прославленный казанский коллектив.
Достижения
«Металлург» (Красноярск)
- 1998 – Победитель Второго дивизиона России
«Шинник» (Ярославль)
- 2007 — Победитель Первого дивизиона России
«Рубин» (Казань)
- 2008, 2009 – Чемпион России
- 2010 – Обладатель Кубка Содружества
- 2010, 2012 – Обладатель Суперкубка России
- 2012 – Обладатель Кубка России
Роман Шаронов новости футбола сегодня 2021 :: Футбол на Soccernews.ru
турнир:
все турнирыАнглия. АПЛАргентина. Примера-ДивизионБельгия. Про-ЛигаГермания. БундеслигаЕгипет. Премьер-ЛигаИспания. Ла ЛигаИталия. Серия АКитай. СуперлигаГолландия. ЭредивизиПортугалия. Лига ПортугезеРоссия. РПЛТурция. СуперлигаУкраина. УПЛУкраина. Первая лигаФранция. Лига 1Европа.
Чемпионат ЕвропыЕвропа. Лига чемпионов УЕФАЕвропа. Лига Европы УЕФАЕвропа. Суперкубок УЕФАЕвропа. Чемпионат Европы до 21Африка. Африканский Кубок НацийМир. Чемпионат мираМир. Кубок КонфедерацийИспания. Терсера-ДивизионМексика. Segunda DivisiónЕвропа. Квалификационный этапЕвропа. Лига наций УЕФАклуб:
все клубыБеларусьДалянь ИфанИнгулецКолос КовалёвкаКосовоМинайМолдоваОболонь-БроварХэбэй Чайна ФорчунАвстралияАвстрияАвстрия до 21 годаАустрия ВенаАзербайджанАзербайджан до 21 годаАлбанияАлбания до 21 годаАлжирАнглияАнглия до 21 годаАрсенал ЛондонАстон ВиллаБернлиБорнмутБрайтон & Хоув АльбионВест Хэм ЮнайтедВулверхэмптонКристал ПэласЛестер СитиЛиверпульМанчестер СитиМанчестер ЮнайтедМидлсброНорвич СитиНьюкасл ЮнайтедСаутгемптонТоттенхэмУотфордЧелсиШеффилд ЮнайтедЭвертонАнголаАндорраАргентинаАргентинос ХуниорсАрсеналАтлетико РафаэлаБанфилдБока ХуниорсВелес СарсфилдГодой КрусДефенса и ХустисияИндепендьентеКильмесКолонЛанусНьюэллз Олд БойзРасинг КлубРивер ПлейтРосарио СентральСан ЛоренцоТальерес де КордобаТигреУраканХимнасия Ла-ПлатаЭстудиантесАрменияАрмения до 21 годаБелоруссия до 21 годаАндерлехтАнтверпенБеверенБельгияБельгия до 21 годаГенкГентЗульте-ВарегемКлуб БрюггеКортрийкЛокеренЛьерс СКМехеленОстендеСент-ТрюйденСеркль БрюггеСтандард ЛьежШарлеруаБенинБолгарияБолгария до 21 годаБосния-Герцеговина до 21 годаБразилияБуркина ФасоБурундиВенгрияВенгрия до 21 годаФеренцварошГабонГанаГвинеяГвинея-БисауАйнтрахт ФранкфуртАлемания АахенАугсбургБавария МюнхенБайер ЛеверкузенБоруссия ДортмундБоруссия МенхенгладбахВердер БременВольфсбургГерманияГермания до 21 годаГертаКельнМайнц 05ПадерборнРБ ЛейпцигУнион БерлинФортуна ДюссельдорфФрайбургХоффенхаймШалькеШтутгартГибралтарАДО Ден ХаагАЗАяксВВВ ВенлоВиллем IIВитессГолландия до 21 годаГоу Эхед ИглзГронингенДе ГрафсхапЗволлеНАК БредаНЕКНидерландыПСВРода ЮКСпарта РоттердамТвентеУтрехтФейеноордФортунна СиттардХераклесХеренвенЭксельсиорЭмменАЕКГрецияГреция до 21 годаОлимпиакос ПирейПаниониосГрузияГрузия до 21 годаДинамо ТбилисиДемократическая Республика КонгоДанияДания до 21 годаСССРЮгославияАль-АхлиЕгипетЗамалекЭль-ГунахЗамбияЗимбабвеИзраиль до 21 годаМаккаби ХайфаИранИрландияИрландия до 21 годаИсландияИсландия до 21 годаАлавесАндорраАтлетик БильбаоАтлетико МадридАтлетико Мадрид IIБарселонаБетисВаленсияВелесВильярреалГранадаДепортиво Ла-КоруньяИспанияИспания до 21 годаЛевантеЛеганесЛорка ДепортиваМальоркаОсасунаРеал ВальядолидРеал МадридРеал СарагосаРеал СосьедадСант АндреуСевильяСельта ВигоТорревьехаХетафеЭброЭйбарЭспаньолАталантаБолоньяБрешияДженоаИнтер МиланИталияИталия до 21 годаКальяриЛациоЛеччеМиланНаполиПалермоПармаРомаСПАЛСампдорияСассуолоСиенаТориноУдинезеФиорентинаХеллас ВеронаЮвентусКабо-ВердеКазахстанКазахстан до 21 годаКамерунКенияКипрКипр до 21 годаБейджин ГуоанГуанчжоуИ. ШанхайЛяонинг ХонгюнСычуаньТянцзин ТедаХенан ЦзяниеЦзянсу ШунтианЧанчун ЯтаиЧонгцинь ЛифанШандонг ЛуненгШанхай ШенхуаШанхай ЮнайтедКолумбияКонгоКоста-РикаКот-д’ИвуарЛатвияЛатвия до 21 годаЛитва до 21 годаЛихтенштейнЛихтенштейн до 21 годаЛюксембургЛюксембург до 21 годаМавританияМадагаскарМакедония (БЮР) до 21 годаМалиМальтаМальта до 21 годаМароккоМексикаМонаркас Морелия IIМолдавия до 21 годаНамибияНигерияНовая ЗеландияНорвегияНорвегия до 21 годаРусенборгПанамаПеруПольшаПольша до 21 годаАлверкаБелененсишБенфикаБоавиштаБрагаВитория ГимарайншВитория СетубалДешпортиво АвешЖил ВисентеКД ТонделаМаритимуМорейренсе ФКПасуш де ФеррейраПортимоненсеПортуПортугалияПортугалия до 21 годаРио АвеСанта-КлараСпортинг ЛиссабонФК АрукаФК ФамаликаоАмкарАнжиАрсенал ТулаАхматДинамо МоскваЗенит Санкт-ПетербургКраснодарКрылья СоветовЛокомотив МоскваРоссияРоссия до 21 годаРостовРубинСпартак МоскваУралУфаЦСКА МоскваРумынияРумыния до 21 годаСтяуа БухарестСан-МариноСан-Марино до 21 годаСаудовская АравияСеверная ИрландияСенегалПартизанСербияСербия до 21 годаСловакияСловакия до 21 годаСловения до 21 годаТанзанияТунисАланьяспорАнкарагюджюАнтальяспорБешикташГазиантеп ББГалатасарайГенчлербирлигиГёзтепе АС ИзмирДенизлиспорДжайкур РизеспорИстанбул ББКайсериспорКасимпасаКоньяспорСивасспорТрабзонспорТурцияТурция до 21 годаФенербахчеУгандаАлександрияАрсенал КиевВерес РовноВолынь ЛуцкВорсклаДесна ЧерниговДинамо КиевДнепр ДнепропетровскЗакарпатье УжгородЗаря ЛуганскЗвезда КропивницкийКарпаты ЛьвовКремень КременчугКривбас Кривой РогЛьвовМариупольМеталлист ХарьковМеталлург ДонецкМеталлург ЗапорожьеНефтяник АхтыркаНиколаевОболонь КиевОлимпик ДонецкПолтаваСевастопольСталь КаменскоеСумыУкраинаУкраина до 21 годаЧерноморец ОдессаШахтер ДонецкУругвайУэльсУэльс до 21 годаФарерские о-ва до 21 годаФарерские островаФинляндияФинляндия до 21 годаАмьенАнжерБастияБордоБрестДижонЛансЛилльЛионМарсельМетцМонакоМонпельеНантНимНиццаОсерПСЖРеймсРеннСент-ЭтьенСошоСтрасбурТулузаФранцияФранция до 21 годаДинамо ЗагребХорватияХорватия до 21 годаЧерногория до 21 годаЧехияЧехия до 21 годаЧилиБазельШвейцарияШвейцария до 21 годаШвецияШвеция до 21 годаРейнджерсХарт оф МидлотианШотландияШотландия до 21 годаЭкваториальная ГвинеяЭстония до 21 годаЮжно-Африканская РеспубликаЮжная КореяЯпонияпо тегу:
время:
за суткиза 3 дняза неделюза месяцза все времянайтиопрос
Кто выиграет Ла Лигу в этом сезоне?
Роман Шаронов покидает пост главного тренера «Рубина» :: Татарстан :: РБК
Роман Шаронов прекращает сотрудничество с казанским клубом.
Об этом сообщается на официальном сайте «Рубина»
«ФК «Рубин» по взаимному согласию сторон прекращает сотрудничество с тренером Романом Шароновым и его тренерским штабом. ФК «Рубин» ценит вклад специалистов в развитие клуба, благодарит за проделанную работу и желает успехов в дальнейшей карьере», — сообщается на сайте.
Напомним, Роман Шаронов был назначен исполняющим обязанности главного тренера «Рубина» 6 июня 2019 года. По итогам прошлого сезона клуб покинул Курбан Бердыев.
Так как у Шаронова отсутствует тренерская лицензии Pro формально обязанности главного тренера в «Рубине» исполнял испанец Эдуардо Докампо. По информации СМИ, он покинет клуб вместе с Шароновым.
По итогам 19 туров РПЛ «Рубин» занимает 13 место из 16. В текущем сезоне казанский клуб одержал четыре победы и потерпел восемь поражений. Семь игр «Рубин» сыграл вничью.
Автор
Оксана Сотник
Задача «Рубина» на сезон – чтобы болельщик пошел на игру
Роман Шаронов
Фото: Алина НИЗАМОВА
В день первого матча нового сезона РПЛ казанский «Рубин» провел открытую тренировку.
На ней с журналистами пообщались исполняющий обязанности главного тренера казанцев Роман Шаронов и новый защитник Виталий Денисов.
В тренировке на базе клуба в соцгороде приняли участие почти все футболисты.
Фото: Алина НИЗАМОВА
Три недели назад вы сказали, что команда укомплектована на 30 процентов. Сейчас насколько? И довольны ли вы тем, как она укомплектована?
— Всегда хочется лучшего, и Рустем Фидаевич (Сайманов, прим.ред.) всегда прилагает максимум усилий, чтобы укомплектовать команду. Идет определенное становление команды, поэтому на данный момент все хорошо, — рассказал наставник.
Что касается чисто тактической подготовки, осваиваемости тренерских требований, насколько команда готова к сезону?
— Понятно, что не так много времени, но это оправдание, на которое мы не будем ссылаться. Есть определенные шаги вперед в плане понимания игроками того, что мы хотим. Естественно, работы еще очень много, — отметил Роман Шаронов.
В вашем программном интервью после вашего назначения не было сказано о задачах. Сейчас можете озвучить задачи, которые стоят перед командой на сезон?
— Задача – играть в футбол. Думаю, что основная задача – чтобы болельщик пошел на игру. Если у нас будет все хорошо, то болельщики пойдут на игру. Это главное, — признался тренер.
В тренировке на базе клуба в соцгороде приняли участие почти все футболисты. На поле не удалось увидеть защитников Владимира Граната и Филипа Уремовича. Гранат продолжает восстановление после перелома ноги полученного в мартовском матче с «Ростовом».
– Он восстанавливается. Подходит уже, но есть определенные проблемы, – рассказал про игрока наставник команды.
Также Роман Шаронов рассказал, что после обновления команды капитана еще не выбрали.
Следом за тренером на вопросы журналистов ответил новый защитник «Рубина» Виталий Денисов.
Вы практически три недели в команде. Расскажите о первых впечатлениях, об адаптации?
— Много работы как на поле, так и за его пределами.
Много общения с тренером, в плане подготовки все отлично. Некоторые вещи были для меня в новинку. Надеюсь, что будем готовы. Первая игра покажет, — ответил футболист.
Какие впечатления от клуба изнутри?
— Конечно, я приехал и был сильно удивлен базой, оснащением, несколько зеленых полей в шикарном состоянии. Это все вызывает радость и положительные эмоции, — признался Виталий.
Вы один из самых опытных игроков в нынешнем «Рубине». Как-то акцентируется внимание внутри коллектива, чтобы вы помогали тренеру? Или это не имеет значения?
— На эту тему не разговаривали. На правах самого старшего в команде могу подсказать, но чтобы тренер делал на этом акцент, такого не было, — отметил игрок.
Виталий Денисов.
Фото: Алина НИЗАМОВА
«Рубин» впервые за долгое время провел предсезонку дома. Это плюс или минус?
— Это не столь важно. Здесь важна сама работа, как мы выполняем установки тренера. Как это переносится на футбольное поле в плане реализации идей.
Если команда уедет в горы и после этого будет отлично играть, то какие вопросы, — сказал футболист.
Особый настрой у вас есть на игру с «Локомотивом»? Или все равно?
— Я не могу сказать, что все равно. Настраиваюсь как на хорошую игру. Стараюсь не акцентировать внимание на том, что это команда, в которой провел долгое время, — признался Виталий.
В первом матче нового сезона «Рубин» 15 июля на «РЖД Арене» в Москве встретится с «Локомотивом». Начало игры назначено на 20.00.
РСМД :: Андрей Шаронов
Президент Московской школы управления СКОЛКОВО, член РСМД
Г-н Шаронов родился в Уфе в 1964 году. Окончил Уфимский государственный авиационный технический университет и Российскую академию государственной службы при Президенте Российской Федерации; имеет докторскую степень. в социологической науке.
С 1989-1991 гг. Г-н Шаронов был народным депутатом СССР, а до 1996 г. был председателем Государственного комитета Российской Федерации по делам молодежи.
С 1996 по 2007 год работал в Министерстве экономического развития и торговли Российской Федерации начальником управления, заместителем министра и статс-секретарем.
С 2007 по 2010 год г-н Шаронов был управляющим директором и председателем Совета директоров инвестиционной компании «Тройка Диалог», а также возглавлял инвестиционно-банковский бизнес.
Андрей — Председатель Правления ООО «НефтеТрансСервис», член Правления таких компаний, как ПАО «Софкомфлот», ОАО «НОВАТЭК», член Наблюдательного совета ПАО Банк ВТБ.
Распоряжением Мэра Москвы от 22 декабря 2010 года г-н Шаронов был назначен заместителем Мэра Москвы по экономической политике, курирующим бюджетирование, государственные закупки, промышленность и политику в поддержку предпринимательства, регулирование торговли и рынка услуг. Он был председателем Региональной энергетической комиссии.
Г-н Шаронов является заместителем главы Исполнительного комитета Московского урбанистического форума.
Г-н Шаронов был награжден премией Аристоса в категории «Независимый директор» в 2009 году, национальной премией «Директор года — 2009» в категории «Независимый директор» и международной премией «Человек года — 2012» в категории «Деловая репутация».
».Также он получил специальную награду за личный вклад в развитие корпоративного управления в 2016 году от Ассоциации независимых директоров и Российского союза промышленников и предпринимателей. Г-н Шаронов награжден Орденом Почета и является Заслуженным экономистом Российской Федерации.
9783846581957: «… откуду пошла Русская земля …»: этногенетический аспект (русское издание) — AbeBooks
В монографии rassmatrivayutsya diskussionnye проблемы- против izuchenii РУССКОЙ я erzyanskoy истории, raskryvaetsya antifinskaya napravlennost ‘РУССКОЙ историографии, dokazyvaetsya nesostoyatel’nost’ proiskhozhdeniya теории и русских OT «vostochnykh Slavyan», privodyatsya dannye о meryano-erzyano-vepsskoy prirode русского Народа я эго yazyka, pokazyvaetsya виртуальность категорий «великорусское племя», «великорусский язык», «восточные славяне».
Выводы, сделанные в исследовании, противоречат официальной метафизической теории русского этногенеза. Поэтому автору не будет смущать самая жесткая критика. Нет на надеется, что правда о народе эрзя, о финнах ио русском народе, уходящем корнями в эрзю-мерю-мурому-мешеру-весь-корелу, в конце концов, будет признана, ибо она несеть в себе дьявольское русское финской России.
«синопсис» может принадлежать к другой редакции этого названия.
Об авторе :Шаронов Александр Маркович, доктор филологических наук, профессор, Научно-исследовательский институт гуманитарных наук при Правительстве Республики Мордовия, ведущий научный сотрудник, Саранск
«Об этом заголовке» может принадлежать другой редакции этого заголовка.
Набор инструментов для мультиплексной визуализации нуклеоида и мембраны E. coli в сверхвысоком разрешении с использованием новых меток PAINT
Этикетки PAINT упрощают визуализацию нуклеоида и мембраны бактерий с высоким разрешением
Мы представляем известные и новые зонды на основе родамина 22 которые облегчают получение изображений PAINT E.coli , нуклеоид и мембрана (рис. 1). Мы расширяем предыдущую работу, устанавливая два отдельных класса датчиков PAINT 16 (рис. S1). Для связывания ДНК мы первоначально соединили Si-родаминовый краситель Janelia Fluor 646 (JF 646 ) с Hoechst 33342, который связывает малую бороздку на AT-богатых последовательностях 16,23,24 , чтобы получить JF 646 — Хехст (1).
Мы расширили эту концепцию на другие красители Janelia Fluor с другими спектральными свойствами (рис. S1 и S2), в результате чего получили JF 549 -Hoechst (2) и JF 503 -Hoechst (3, рис.1а). Для нацеливания на мембраны мы синтезировали производные ранее описанного азепанилродаминового красителя «Потомак желтый» (4), который, как мы случайно обнаружили, обладает врожденным сродством к клеточным мембранам 16 . Эта структура была модифицирована для увеличения гидрофобности («Потомак Голд», 5), введения отрицательного заряда (5-карбокси-Потомак желтый, 6) или спектров красного смещения («Потомак красный», 7, рис. 1b и S2). Эти зонды позволили нам визуализировать наноразмерную структуру E.coli и клеточная оболочка с точностью локализации в диапазоне 10–20 нм (рис. 1, S3, S4 и таблица S1), что обеспечивает значительно более высокое разрешение по сравнению с традиционными методами флуоресцентной микроскопии, такими как конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (рис.
S5) . Последовательный многоцветный подход SMLM 6 позволил повторить визуализацию нуклеоидов в одной и той же клетке с использованием разных меток и условий буфера. Мы могли бы показать, что JF 503 -Hoechst, JF 549 -Hoechst и JF 646 -Hoechst хорошо подходят для разрешения наноразмерной структуры нуклеоида в быстрорастущих E.coli (рис. 1в). Кроме того, мы обнаружили, что новые красители хорошо работают как в нейтральных (PBS, pH 7,4), так и в восстанавливающих (здесь 100 мМ трис, 100 мМ MEA, pH 8,0) буферных системах (рис. S3). Это открытие важно для мультиплексной визуализации в сочетании с другими методами SMLM, такими как d STORM и PALM. PBS может быть предпочтительным при использовании фотомодулируемых флуоресцентных белков, поскольку восстановление буферных систем может влиять на фотоактивацию / -конверсию во время экспериментов с PALM 18 .Напротив, большинство органических красителей в визуализации d STORM требуют уменьшения буферных систем для эффективного перехода в долгоживущее темное состояние.
Кроме того, мы обнаружили, что конъюгаты Hoechst показывают значительно повышенную яркость в буфере трис / MEA по сравнению с PBS. Это увеличение способствовало не улучшенному поведению фотопереключения, как это было видно в экспериментах d STORM, а скорее измененной нано-среде Si-родаминовых красителей. Хотя о спонтанном фотопереключении сообщалось для спиролактонов у эукариот 25 , мы не могли наблюдать такое поведение для ковалентно включенного JF 646 .Таким образом, динамика фотообесцвечивания, наблюдаемая в нейтральном (PBS) или восстанавливающем буфере (трис / MEA), была аналогичной, что указывает на отсутствие индуцированного перехода в долгоживущее темное состояние (рис. S6). Таким образом, стабильный сигнал, наблюдаемый для конъюгатов Hoechst, наиболее вероятно, способствует временному связыванию, что подтверждается сродством мкМ к дцДНК, о котором сообщалось в предыдущих исследованиях 16,17 Мы дополнительно проанализировали время связывания, которое показало схожее распределение для мембран и Зонды для нацеливания на ДНК и различные буферы (рис.
S7). Более высокое количество фотонов, собранных на один флуорофор, приводит к улучшенной экспериментальной точности локализации (рис. 1d, таблица S2) с Hoechst-JF 503 , показывающим наиболее сильное изменение с примерно 18,0 ± 1,0 нм до 11,9 ± 0,3. нм. Увеличение яркости в буфере трис / MEA также наблюдалось для мембранных красителей Потомак желтый, 5-карбокси-Потомак желтый и Потомак Голд (рис. 1d и S3). Хотя все мембранные красители PAINT можно использовать для визуализации оболочки клетки в измерениях 2D PAINT, повышенная яркость e.грамм. Potomac Gold по сравнению с Nile Red выгодно для измерений 3D SMLM (рис. S8).
Получение изображений бактериального нуклеоида и клеточной мембраны в сверхвысоком разрешении с использованием новых красителей для ДНК и мембран PAINT в фиксированных клетках E. coli , выращенных в среде LB. ( a, b ) Химическая структура этикеток PAINT для ДНК ( a , 1 — 3 ) и мембран ( b , 4 — 7 ).
( c ) Нуклеоид быстрорастущего E.coli визуализировали с помощью микроскопии PAINT, используя конъюгированные родаминовые красители Hoechst JF 503 -Hoechst, JF 549 -Hoechst и JF 646 -Hoechst. Пунктирные линии указывают границы клеток и были определены из изображений PAINT клеточной мембраны (см. Рис. S3). Изображения бактериальной мембраны со сверхвысоким разрешением реконструировали на основе измерений PAINT с использованием гидрофобных флуорофоров Nile Red, Potomac Gold и Potomac Red (масштабная линейка: 1 мкм). ( d) Выходы одномолекулярных фотонов ДНК-связывающего (слева) и мембранно-связывающего зондов PAINT (справа), показанных в ( a ).Статистическая значимость оценивалась с использованием двустороннего непараметрического критерия Манна – Уитни: n.s. P> 0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. Прямоугольники представляют средние значения, а соответствующие стандартные отклонения - прямоугольники. Медиана обозначена горизонтальными линиями, а усы - минимальным и максимальным значениями.
Для конъюгатов Hoechst оптимальные условия визуализации были найдены для концентраций от 400 до 800 пМ (рис. S9). Однако эти значения зависят от таких параметров, как фиксация клеток и сила проницаемости или применяемых условий роста.Поэтому мы рекомендуем титрование перед экспериментом, чтобы достичь достаточной плотности метки и в то же время предотвратить перекрытие сигналов одиночных молекул 26 . При оптимальных концентрациях красителя постоянная замена этикеток обеспечивает постоянную плотность эмиттера, что позволяет получать изображения в течение длительного времени. Кроме того, на визуализацию PAINT не влияет необратимое фотообесцвечивание, которое наблюдается для ковалентно связанных органических флуорофоров («стационарные метки») (рис. S6 и S10). Время связывания этикеток PAINT (~ 20–50 мс, рис.S7) учитывают скорость получения изображений, обычно используемую для обычных измерений d STORM или PAINT на основе пептидов (например, Lifeact, время полураспада 23 мс) 11 .
Другие методы, такие как PALM и DNA-PAINT, часто требуют более длительного времени интеграции камеры (~ 100–200 мс) 12,27 .
Сравнение структуры нуклеоидов, наблюдаемых при визуализации живых клеток и PAINT.
О высокоструктурированной морфологии нуклеоида E. coli во время быстрого роста сообщалось в нескольких исследованиях 6,28,29 .Применение меток PAINT в этом исследовании и визуализация d STORM меченной щелчком ДНК показали, что ДНК сильно уплотнена и образует интригующие нуклеоидные структуры. Мы стремились проверить, присутствуют ли эти структуры в живых клетках и сохраняются ли они во время химической фиксации. Таким образом, мы экспрессировали слитый белок GFP-Fis из индуцибельной плазмиды в штамме MG1655 WT. GFP-Fis равномерно украшает бактериальный нуклеоид и позволяет косвенно визуализировать структуру ДНК в живых клетках с помощью стандартной флуоресцентной микроскопии 28 .Экспрессия GFP-Fis была индуцирована в быстрорастущей культуре, и затем живые клетки были иммобилизованы на обработанных хитозаном поверхностях 30 (фиг.
2). После записи светлого поля и широкопольных изображений GFP-Fis (рис. 2а) клетки химически фиксировали с использованием 2% формальдегида.
Влияние фиксации формальдегида на морфологию и распределение нуклеоидов. ( a ) Живые клетки MG1655 дикого типа, выращенные в среде LB при 32 ° C и экспрессирующие GFP-Fis, иммобилизованные на покрытой хитозаном поверхности.Клетки поддерживали рост и деление клеток (зеленая звездочка). ( b ) Клетки фиксировали на предметном стекле, одновременно записывая сигнал GFP-Fis (голубой, горячий). Отметки времени указывают время после добавления формальдегида, каждое изображение представляет в среднем 5 кадров изображения. Показанная бактерия соответствует бактерии, отмеченной голубой звездочкой на ( a ). ( c ) Сравнение сигнала GFP-Fis, записанного до фиксации, с соответствующим изображением PAINT, полученным с использованием JF 646 -Hoechst после 30-минутной фиксации FA.
Ограниченное дифракцией изображение канала PAINT было реконструировано путем вычисления изображения стандартного отклонения из 5000 кадров изображения. Белые пунктирные линии обозначают контуры, определенные из изображения PAINT мембраны, которое было получено в режиме параллельной визуализации с использованием Nile Red (масштабные полосы: 3 мкм в a и 1 мкм в b и c). ( d ) Нормализованные профили интенсивности ячейки, показанные на ( c ). Были определены профили вдоль длинной оси бактерий для сигнала GFP-Fis, зарегистрированного в живой клетке (голубые линии, оба графика), реконструированного дифракционно-ограниченного сигнала PAINT ДНК (красная линия, левый график), сверхразрешенного сигнала PAINT. ДНК из фиксированной клетки (красная линия, правый график) и сигнал PAINT мембраны (желтые линии, оба графика).
До фиксации иммобилизованные бактерии продолжали расти и делиться, за исключением основных ингибирующих эффектов, вызванных иммобилизацией клеток (рис. 2a, зеленая звездочка, рис.
S11). Прямое получение канала GFP-Fis при добавлении фиксирующего раствора не выявило изменений в морфологии клеток и нуклеоидов (рис. 2b). Несмотря на температурный сдвиг во время иммобилизации и получения изображений живых клеток (от 32 ° C до комнатной температуры), нуклеоид обнаруживает высокоструктурированную морфологию, о которой сообщалось в предыдущих исследованиях 6,28,29 .Это согласуется с опубликованными результатами 28 , показывающими, что общая геометрия нуклеоида сохраняется в течение нескольких минут. После 30 минут фиксации образец был удален из микроскопа, клетки были проницаемы и добавлен буфер для визуализации, содержащий JF 646 -Hoechst / NR, для записи изображений PAINT с суперразрешением бактериального нуклеоида и мембраны (рис. 2c). Как и ожидалось, высококонденсированные нити ДНК формируют два нуклеоида, которые уже были разделены на этой стадии клеточного цикла.Чтобы исключить, что химическая фиксация или связывание Hoechst вызывают конденсацию ДНК во время и после процесса фиксации, мы реконструировали ограниченное дифракцией изображение из последовательности изображений PAINT.
Это позволяет провести прямое сравнение с широкопольным изображением, полученным в живой клетке (рис. 2c), показывая очень высокое сходство в структуре и распределении нуклеоидов (рис. 2d). Это является прямым доказательством того, что снимки с суперразрешением в фиксированных клетках, визуализированные как d STORM 5,6 , так и PAINT, представляют собой естественные структуры бактериального нуклеоида.Такой контроль важен, поскольку химическая фиксация с использованием сшивающих реагентов часто считается причиной артефактов визуализации и может влиять на морфологию и распределение нуклеоидов. В то же время химическая фиксация широко применяется в биохимических экспериментах, таких как захват конформации хромосомы 31 .
Спектрально разделенные метки PAINT позволяют проводить мультиплексную визуализацию генетических локусов, нуклеоида и мембраны
Благодаря хорошо разделенным спектрам поглощения и излучения (рис.S2), некоторые мембранные и ДНК-связывающие зонды позволяют проводить параллельные многоцветные SMLM. Это упрощает экспериментальную процедуру, так как нет необходимости в замене буфера и трудоемком извлечении ранее отображенных клеток. Мы выполнили параллельную трехцветную визуализацию клеточной оболочки и нуклеоида в клетках E. coli MG1655, несущих систему тегирования генетических локусов parS -ParB 21 . Последовательность parS в используемых штаммах располагалась либо рядом с точкой начала репликации, либо в концевой области штамма E.coli хромосома. Слитые белки GFP-ParB специфически связываются с последовательностями parS и сообщают о положении хромосомных локусов. Эти позиции были локализованы и коррелированы со всем нуклеоидом, а также с границей клетки (раздел «Методы»). Культивирование клеток E. coli в минимальной среде с добавками (время удвоения массы культуры t d = 46,6 ± 0,9 и 48,2 ± 1,2 мин для Ori-1 и Ter-5, соответственно) привело к явно менее конденсированному и менее сложному нуклеоиду. структура (рис.
3) по сравнению с клетками, выращенными в богатой среде (рис. 1 и 2, t d = 27 мин) 6,28 . При этой промежуточной скорости роста мы наблюдали 2–6 точек начала репликации на клетку, в то время как в максимуме были обнаружены две концевые области (рис. 3a и S12). Чтобы исследовать относительное расположение макродоменов Ori и Ter, мы сгенерировали нормализованные карты локализации путем усреднения сверхразрешенных изображений нескольких ячеек (рис. 3b, n = 44 и 45 ячеек для ori — и ter с тегами ячеек).Вариация пространственного положения макродомена Ori (рис. 3b, левая панель), таким образом, возникает из-за различного количества циклов репликации на клетку и нормализации и усреднения клеток разной длины (рис. S12). Напротив, макродомен Ter оставался расположенным около середины клетки (фиг. 3b, средняя панель), с локусами ter , пространственно отделенными от oriC (фиг. 3b, правая панель).
Параллельные многоцветные SMLM генетических локусов, нуклеоида и мембраны в фиксированных E.
coli , выращенные в минимальной среде M9 с добавками. ( a ) Источник репликации (верхняя панель) или терминальная область (нижняя панель) бактериальной хромосомы были помечены GFP с использованием системы тегирования генетических локусов parS -ParB (раскаленный). Мембрана (зеленая) окрашивалась Nile Red, а нуклеоид (голубой) окрашивалась JF 646 -Hoechst (масштабная линейка: 1 мкм). ( b ) Средние карты локализации начала репликации (левая панель) и терминальной области (средняя панель).Композитный (правая панель) показывает исключение областей oriC (пурпурный) и ter (раскаленный).
Мультиплексная визуализация PAINT и dSTORM визуализирует зарождающуюся ДНК в корреляции со всем нуклеоидом
Поскольку временное связывание конъюгатов Hoechst также наблюдается в восстанавливающих буферных системах, визуализацию нуклеоида PAINT можно комбинировать с обычным визуализацией d STORM (рис. 4). Это позволяет визуализировать бактериальную ДНК как с меткой PAINT, так и с фотопереключаемым флуорофором, ковалентно связанным с ДНК.
Мы использовали общий метод метаболической маркировки, чтобы включить аналог тимидина 5-этинил-2′-дезоксиуридин (EdU) в зарождающуюся ДНК реплицирующихся бактерий. Этот метод метаболического мечения ранее применялся к клеткам млекопитающих и бактерий для изучения пространственно-временной организации репликации ДНК с использованием стандартной флуоресцентной микроскопии 32,33 и SMLM 6,34 .
Импульсное мечение растущей ДНК в клетках E. coli с EdU.( a ) Эксперимент по импульсному мечению в быстрорастущей периодической культуре E. coli (среда LB, 32 ° C). Кривые роста культур с EdU и без него показаны в верхней левой панели. Аликвоты культур фиксировали через 2, 3,5 и 5 мин и метили с помощью Alexa Fluor 647 с помощью щелчковой химии. Параллельная многоцветная визуализация выполнялась, как описано в разделе «Методы». Нуклеоиды зондировали с использованием JF 503 -Hoechst и мембран с использованием Nile Red.
Отдельные локализации в каналах ДНК были удалены с помощью алгоритма кластерного анализа на основе плотности DBSCAN 35 (см. Раздел Методы и рис.S13). Увеличение времени инкубации EdU приводит к увеличению покрытия нуклеоидов (соотношение площади, заполненной ДНК с импульсной меткой, и всего нуклеоида) (верхняя правая панель). На нижней панели показаны репрезентативные клетки для указанных длительностей импульса EdU, помеченные для зарождающейся ДНК (раскаленная докрасна), весь нуклеоид (раскаленная голубым цветом) и мембрана (зеленая). Контуры были определены на изображении PAINT мембраны и показаны пунктирными линиями на изображениях DNA d STORM и PAINT. ( b ) Мечение пульса при остановке метаболизма.Клетки MG1655 выращивали в среде LB при 32 ° C. Кривые роста культур с SHX и без него показаны в верхней левой панели. Обработанную культуру разделяли на 3 культуры и добавляли EdU в течение последних 30 минут обработки SHX, в результате чего клетки задерживались на 30 минут, 60 минут и 90 минут.
Параллельная многоцветная визуализация выполнялась, как описано в разделе «Методы». Покрытие нуклеоидами зарождающейся ДНК уменьшается со временем обработки SHX (верхняя правая панель). На нижней панели показаны репрезентативные клетки для различных моментов времени во время остановки метаболизма, цветовая кодировка остается идентичной ( a ).Столбцы представляют собой средние значения, а столбцы ошибок — стандартное отклонение (шкала: 1 мкм).
Мы разработали два эксперимента, в которых EdU добавляли в культуру в течение определенных интервалов времени либо в нормально растущих культурах (рис. 4a), либо во время строгого ответа 20 (рис. 4b).
Мы использовали короткое время инкубации (2–5 минут), чтобы пометить вариабельную фракцию вновь реплицированной хромосомной ДНК в клетках E. coli с EdU и конъюгировали органический краситель Alexa Fluor 647 с модифицированными азотистыми основаниями с помощью реакции «щелчок химии» 33 .Это позволило нам записать двухцветные изображения SMLM и сопоставить пространственное распределение растущей ДНК, меченной Alexa Fluor 647, со всем бактериальным нуклеоидом, визуализированным с помощью красителя PAINT JF 503 -Hoechst (рис.
4a). Добавление EdU не повлияло на рост клеток (рис. 4a, верхняя левая панель), а контрольные метки выявили незначительный вклад неспецифического связывания, который был удален с использованием d ensity- b a s ed c lustre и alysis (DBSCAN 35 ) (рис.S13).
За 2 мин воздействия EdU были обнаружены очаги растущей ДНК диаметром 176 ± 7 нм (SEM, n = 287 кластеров) (рис. 4а, нижняя панель). Этот диаметр хорошо согласуется с подвижностью генетических локусов, обнаруженных в живых клетках 21 , которые, как сообщалось, диффундируют со скоростью от 0,0001 до 0,0004 мкм² / с. Эти значения соответствуют круглой области диаметром 124–248 нм, покрываемой за 2 минуты. Как и ожидалось, продолжающаяся репликация приводит к увеличению площади зарождающейся ДНК (рис.4а, нижняя панель). Поскольку весь нуклеоид может быть визуализирован с использованием ДНК-нацеленных меток PAINT (здесь: JF 503 -Hoechst), относительная площадь нуклеоида, покрытая растущей ДНК, может быть определена как отношение площадей зарождающейся и основной площади ДНК (рис.
4a). , верхняя правая панель, рис. S14). Также здесь были удалены области с низкой плотностью сигналов Alexa Fluor 647 и JF 503 -Hoechst (рис. S13). Анализ 30–49 клеток на условие показал, что увеличение времени инкубации EdU приводит к последовательному увеличению отношения площади растущей / основной ДНК.Противоположная тенденция может наблюдаться во время остановки метаболизма при использовании серингидроксамата, гомолога серина (рис. 4b). Обработка SHX останавливает трансляцию рибосом, что приводит к ингибированию транскрипции за счет запуска строгого ответа и в конечном итоге ингибирует инициацию репликации 20 . Мы наблюдали, что рост культуры сразу же подвергался воздействию SHX, что приводило к постоянной оптической плотности через ~ 30 мин (рис. 4b, верхняя левая панель). Чтобы визуализировать влияние аминокислотного голодания на репликацию хромосом, EdU добавляли в среду для роста, содержащую SHX, за 30 минут до фиксации.Поскольку клетки E. coli демонстрируют множественную репликацию в применяемых условиях роста 20 (среда LB, 32 ° C), весь нуклеоид должен быть помечен по крайней мере один раз в течение 30-минутного периода воздействия EdU.
Действительно, в течение первых 30 минут голодания репликация, по-видимому, не пострадала, поскольку EdU включен для маркировки всего нуклеоида E. coli (рис. 4b, нижняя панель). Однако, если EdU добавляется в течение 30 минут в конце обработки SHX (60–90 минут), метится только небольшая часть нуклеоида, в то время как вся хромосома все еще может быть визуализирована с помощью JF 503 -Hoechst (Рисунок.4б, нижняя панель). Анализ формирующейся и основной ДНК 21–53 клеток за момент времени выявил уменьшение соотношения площадей со временем инкубации SHX (рис. 4b, верхняя правая панель), что согласуется с прекращением активной репликации и сопутствующим ингибированием новых раундов репликации.
Комбинация PAINT и PALM для параллельной трехцветной визуализации
Недавно было опубликовано сообщение о последовательном рабочем процессе визуализации, объединяющем PALM-визуализацию фотомодулируемых слитых флуоресцентных белков с d STORM визуализацию зарождающейся ДНК 6 .
Последовательная визуализация была необходима, поскольку буферная система, необходимая для фотопереключения органического красителя, сильно влияла на фотоактивацию флуоресцентного белка, фотоактивируемого mCherry1 (PAmCherry1), но этот подход требует надежного восстановления положений образца. Поскольку конъюгаты Hoechst не требуют специальных буферов для визуализации, визуализация нуклеоида с помощью PAINT должна быть совместима с PALM, что значительно упрощает как подготовку образцов, так и процедуру визуализации. Чтобы подтвердить, что присутствие меток PAINT, нацеленных на ДНК и мембраны, в буфере для визуализации не влияет на визуализацию PALM, мы сверхэкспрессировали PAmCherry1 с гистограммой из индуцибельной плазмиды (рис.S15) и количественно оценили сигнал PAmCherry1, используя как последовательный, так и параллельный рабочий процесс визуализации. Результаты, полученные в обоих рабочих процессах, очень хорошо согласуются как качественно (3-цветные изображения SMLM), так и количественно (бюджет фотонов PAmCherry1 и количество молекул на µm² площади ячейки) для трех полосовых эмиссионных фильтров, обычно используемых для обнаружения PAmCherry1.
Таким образом, бюджет фотонов на молекулу PAmCherry1 сильно коррелирует с долей окна излучения, покрытой соответствующими полосовыми фильтрами (рис.S15). Идентичные бюджеты фотонов для PAmCherry1 в параллельном и последовательном режимах визуализации исключают значительные перекрестные помехи от зондов PAINT, нацеленных на ДНК и мембраны. Это подтверждается пространственным разделением цитозольного PAmCherry1, мембраны и нуклеоида, как это наблюдается на многоцветных изображениях (Рис. S16). Чтобы оценить потенциальные перекрестные помехи, вызванные другими датчиками PAINT, мы также записали спектры излучения и наложили данные фильтра (рис. S17, таблица S3). После проверки его надежности мы использовали подход параллельной визуализации для визуализации субъединицы β ‘РНК-полимеразы, слитой с PAmCherry1 (теперь называемой только РНКП) в корреляции с нуклеоидом и границами клетки (рис.5). Мы выбрали этот гибридный белок, поскольку (i) мы можем сравнить изображения с предыдущими результатами, полученными с использованием подхода последовательной визуализации 6 , и (ii) влияние препаратов, останавливающих транскрипцию и трансляцию, рифампицина и хлорамфеникола на RNAP и распределение нуклеоидов, является хорошо зарекомендовавшие себя (хорошо рассмотрены Джином и др.
. 36 ). Используя наш подход к параллельной визуализации, мы наблюдали, что молекулы RNAP в значительной степени организуются вокруг нуклеоида E. coli в необработанных, экспоненциально растущих клетках, как сообщается в нескольких исследованиях 6,29,37 (рис. 5a и S18).Добавление рифампицина ингибирует инициацию транскрипции, отменяя активную транскрипцию в течение 5–10 минут после обработки. 38 . В течение первых двух минут лечения нуклеоид сильно конденсировался вдоль короткой оси бактерии, в то время как молекулы РНКП были равномерно распределены по цитозолю. Часть молекул РНКП находилась поблизости от нуклеоида, предположительно транскрибируя более крупные гены. Более длительная обработка рифампицином приводила к равномерному распределению RNAP, сопровождающемуся расширением нуклеоида, который заполнял почти весь цитозоль к моменту 30-минутного воздействия (рис. 5b, S18 и S19).
Комбинация ЛАДОНИ и КРАСКИ для параллельного 3-цветного SMLM-изображения. Штамм KF26 выращивали в среде LB при 32 ° C, химически фиксировали и отображали (см. Раздел «Методы»). Показаны нуклеоид (i, голубой горячий), субъединица β ‘РНК-полимеразы (ii, слияние PAmCherry1, желтый горячий) и наложение (iii), включая изображение PAINT мембраны (красный). ( a ) Типичное трехцветное изображение необработанных клеток KF26. Контуры клеток (красные пунктирные линии) определяли с использованием изображения PAINT мембраны Potomac Red.( b ) Типичные изображения клеток KF26, обработанных 100 мкг / мл рифампицина в течение указанной продолжительности. ( c ) Типичные изображения клеток KF26, обработанных 50 мкг / мл хлорамфеникола в течение указанного периода времени (масштабная полоса: 1 мкм).
Ингибирование элонгации трансляции с помощью хлорамфеникола первоначально приводило к морфологии нуклеоидов, аналогичной наблюдаемой для обработанных рифампицином клеток, показывая конденсацию нуклеоидов вдоль короткой оси. Однако, в отличие от лечения рифампицином, заметные кластеры молекул РНКП располагались вокруг нуклеоида.
После 30-минутной обработки хлорамфениколом морфология нуклеоида изменилась на тороидальную структуру, сохраняя локализацию РНКП вокруг нуклеоида (рис. 5c, S18 и S19). Это морфологическое изменение было приписано силам конденсации, вызываемым активной транскрипцией молекул RNAP 37 . Обратите внимание, что эффекты лечения как рифампицином, так и хлорамфениколом не зависели от стадии клеточного цикла, поскольку изменения в распределении нуклеоидов и RNAP были одинаковыми для клеток всех размеров (рис. S19).Вместе эти результаты показывают, что наш подход к параллельной визуализации предоставляет ценную информацию о наноразмерном распределении бактериальных белков в корреляции с нуклеоидом. Этикетки PAINT настоящим не требуют какого-либо времени, например, EdU и позволяют проводить прямую параллельную 3-цветную SMLM-визуализацию клеток, обработанных лекарством.
Внутриопухолевые изотипы иммуноглобулинов позволяют прогнозировать выживаемость при подтипах аденокарциномы легких | Journal for ImmunoTherapy of Cancer
Germain C, Gnjatic S, Tamzalit F, Knockaert S, Remark R, Goc J, Lepelley A, Becht E, Katsahian S, Bizouard G, et al.Присутствие В-клеток в третичных лимфоидных структурах связано с защитным иммунитетом у пациентов с раком легких. Am J Respir Crit Care Med. 2014. 189 (7): 832–44.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Карми Ю., Спитцер М.Х., Линде И.Л., Берт Б.М., Прествуд Т.Р., Перлман Н., Дэвидсон М.Г., Кенкель Дж. А., Сегал Е., Пусапати Г. В. и др. Аллогенный IgG в сочетании со стимулами дендритных клеток индуцирует противоопухолевый Т-клеточный иммунитет.Природа. 2015; 521 (7550): 99–104.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Ясуда М., Мизуками М., Ханагири Т., Шигемацу Ю., Фукуяма Т., Нагата И., Со Т., Итики Ю., Сугая М., Такенояма М. и др. Антигены, распознаваемые IgG, происходят из инфильтрирующих опухоль В-лимфоцитов при раке легких человека. Anticancer Res. 2006. 26 (5A): 3607–11.
CAS PubMed Google Scholar
Мозе Л.Е., Селицкий С.Р., Биксби Л.М., Маррон Д.Л., Иглесия, доктор медицины, Сероди Дж.С., Перу С.М., Винсент Б.Г., Паркер Дж. С.. Основанный на сборке вывод репертуаров рецепторов В-клеток из данных секвенирования РНК с коротким считыванием с помощью V’DJer. Биоинформатика. 2016; 32 (24): 3729–34.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Болотин DAea: профилирование антигенного рецептора по данным РНК-seq. Nat Biotechnol 2017.
Nielsen JS, Sahota RA, Milne K, Kost SE, Nesslinger NJ, Watson PH, Nelson BH. CD20 + лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, имеют атипичный фенотип памяти CD27 и вместе с CD8 + Т-клетками способствуют благоприятному прогнозу при раке яичников. Clin Cancer Res. 2012. 18 (12): 3281–92.
CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar
Ши Дж.Й., Гао Кью, Ван З.С., Чжоу Дж., Ван Си, Минь З.Х., Ши Й.Х., Ши Дж.Проникающие в края CD20 (+) В-клетки обнаруживают атипичный фенотип памяти и коррелируют с благоприятным прогнозом при гепатоцеллюлярной карциноме. Clin Cancer Res. 2013. 19 (21): 5994–6005.
CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar
Гилберт А.Е., Карагианнис П., Додев Т., Коерс А., Лейси К., Джозефс Д.Х., Тахар П., Гех Дж. Л., Хили С., Харрис М. и др. Мониторинг компартмента В-клеток системной памяти пациентов с меланомой на предмет выявления противоопухолевых антител IgG.PLoS One. 2011; 6 (4): e19330.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
ДеФалко Дж., Харбелл М., Мэннинг-Бог А, Байя Дж., Шольц А., Миллар Б., Суми М., Чжан Д., Чу Ф., Дауд С. и др. Пациенты с непрогрессирующим раком имеют стойкие В-клеточные ответы, экспрессирующие общие паратопы антител, которые нацелены на общественные опухолевые антигены.
Clin Immunol. 2018; 187: 37–45.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Kobold S, Lutkens T, Cao Y, Bokemeyer C, Atanackovic D. Аутоантитела против опухолевых антигенов: частота встречаемости и биологическое значение. Hum Immunol. 2010. 71 (7): 643–51.
CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar
Macdonald IK, Parsy-Kowalska CB, Chapman CJ. Аутоантитела: возможности для раннего выявления рака. Тенденции рака. 2017; 3 (3): 198–213.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Питцалис С., Джонс Г.В., Бомбардиери М., Джонс С.А. Внематочные лимфоидные структуры при инфекции, раке и аутоиммунитете. Nat Rev Immunol. 2014. 14 (7): 447–62.
CAS Статья Google Scholar
Germain C, Gnjatic S, Dieu-Nosjean MC.
В-клетки, связанные с третичной лимфоидной структурой, играют ключевую роль в противоопухолевом иммунитете. Фронт Иммунол. 2015; 6: 67.
PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar
Colbeck EJ, Ager A, Gallimore A, Jones GW. Третичные лимфоидные структуры при раке: движущие силы противоопухолевого иммунитета, иммуносупрессия или наблюдатели при болезни? Фронт Иммунол. 2017; 8: 1830.
PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar
Чжу В., Жермен К., Лю З., Себастьян Ю., Деви П., Ноккарт С., Брохон П., Леманн К., Дамотт Д., Валидире П. и др. Высокая плотность В-клеток третичной лимфоидной структуры в опухолях легких связана с повышенной клональностью репертуара рецепторов CD4 (+) Т-клеток.Онкоиммунология. 2015; 4 (12): e1051922.
PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar
Rivera A, Chen CC, Ron N, Dougherty JP, Ron Y. Пересмотр роли B-клеток как антигенпредставляющих клеток in vivo: антигенспецифические B-клетки необходимы для размножения Т-клеток в лимфатических узлах и для системные ответы Т-клеток на низкие концентрации антигена. Int Immunol. 2001. 13 (12): 1583–93.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Bouaziz JD, Yanaba K, Venturi GM, Wang Y, Tisch RM, Poe JC, Tedder TF. Терапевтическое истощение В-клеток ухудшает адаптивную и аутореактивную активацию CD4 + Т-клеток у мышей. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104 (52): 20878–83.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Бруно Т.К., Эбнер П.Дж., Мур Б.Л., Скволлс О.Г., Во К.А., Ерусланов Е.Б., Сингхал С., Митчелл Д.Д., Франклин В.А., Меррик Д.Т. и др. Антигенпрезентирующие внутриопухолевые В-клетки влияют на фенотип CD4 (+) TIL у пациентов с немелкоклеточным раком легкого.
Иммунологические исследования рака. 2017; 5 (10): 898–907.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Данг В.Д., Хильгенберг Э., Райс С., Шен П., Филлатро С. От регуляторных функций В-клеток до идентификации субпопуляций плазматических клеток, продуцирующих цитокины. Curr Opin Immunol. 2014; 28: 77–83.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Zhou J, Min Z, Zhang D, Wang W, Marincola F, Wang X. Повышенная частота и потенциальный механизм B-регуляторных клеток у пациентов с раком легких. J Transl Med. 2014; 12: 304.
PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar
Shalapour S, Font-Burgada J, Di Caro G, Zhong Z, Sanchez-Lopez E, Dhar D, Willimsky G, Ammirante M, Strasner A, Hansel DE, et al. Иммунодепрессивные плазматические клетки препятствуют Т-клеточной иммуногенной химиотерапии.
Природа. 2015; 521 (7550): 94–8.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Курай Дж., Чикуми Х., Хашимото К., Ямагути К., Ямасаки А., Сако Т., Туге Х., Макино Х., Таката М., Мията М. и др. Антителозависимая клеточная цитотоксичность, опосредованная цетуксимабом, в отношении клеточных линий рака легких. Clin Cancer Res. 2007. 13 (5): 1552–61.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Барбера-Гиллем Э., Мэй К.Ф. младший, Нихус Дж. К., Нельсон МБ. Стимулирование инвазии опухоли за счет взаимодействия гранулоцитов и макрофагов, активируемых противоопухолевыми антителами. Неоплазия. 1999; 1 (5): 453–60.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Андреу П., Йоханссон М., Аффара Н.И., Пуччи Ф., Тан Т., Джунанкар С., Корец Л., Лам Дж., Тауфик Д., ДеНардо Д.Г. и др. Активация FcRgamma регулирует плоскоклеточный канцерогенез, связанный с воспалением.Раковая клетка. 2010. 17 (2): 121–34.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Дай Л., Цай Дж. К., Ли Дж., Йи Т. А., Мунгер Дж. С., Пасс Х, Ром В. Н., Чжан И, Тан Е. М., Чжан Дж. Аутоантитела против опухолевых антигенов в раннем выявлении рака легких. Рак легких. 2016; 99: 172–9.
PubMed Статья Google Scholar
Тан З.М., Линг З.Г., Ван СМ, Ву Ю.Б., Конг Дж.Л.Сывороточные опухолевые аутоантитела как диагностические биомаркеры рака легких: систематический обзор и метаанализ. PLoS One. 2017; 12 (7): e0182117.
PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar
Gnjatic S, Ritter E, Buchler MW, Giese NA, Brors B, Frei C, Murray A, Halama N, Zornig I., Chen YT, et al. Серомическое профилирование рака яичников и поджелудочной железы. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2010; 107 (11): 5088–93.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Hirasawa Y, Kohno N, Yokoyama A, Kondo K, Hiwada K, Miyake M. Естественные аутоантитела к MUC1 являются прогностическим индикатором немелкоклеточного рака легких. Am J Respir Crit Care Med. 2000. 161 (2 Pt 1): 589–94.
CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar
Wouters MCA, Nelson BH.Прогностическое значение инфильтрирующих опухоль В-клеток и плазматических клеток при раке человека. Clin Cancer Res. 2018; 24 (24): 6125–35.
PubMed Статья PubMed Central Google Scholar
Джентлз AJ, Newman AM, Liu CL, Bratman SV, Feng W., Kim D, Nair VS, Xu Y, Khuong A, Hoang CD, et al. Прогностический ландшафт генов и проникающих иммунных клеток через рак человека. Nat Med. 2015; 21 (8): 938–45.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Иглесия, доктор медицины, Паркер Дж. С., Хоадли К. А., Сероди Дж. С., Перу С. М., Винсент Б. Дж. Геномный анализ инфильтратов иммунных клеток по 11 типам опухолей. J Natl Cancer Inst. 2016: 108 (11).
PubMed Central Статья CAS PubMed Google Scholar
Чароентонг П., Финотелло Ф, Ангелова М., Майер С., Ефремова М., Ридер Д., Хакл Х., Траяноски З. Иммуногеномный анализ пан-рака выявляет взаимосвязь генотип-иммунофенотип и предикторы реакции на блокаду контрольных точек.Cell Rep., 2017; 18 (1): 248–62.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Шалапур С., Линь XJ, Бастиан И.Н., Брейн Дж., Берт А.Д., Аксенов А.А., Врбанак А.Ф., Ли В., Перкинс А., Мацутани Т. и др. Вызванные воспалением клетки IgA + разрушают иммунитет против рака печени. Природа. 2017; 551 (7680): 340–5.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Sjoberg E, Frodin M, Lovrot J, Mezheyeuski A, Johansson M, Harmenberg U, Egevad L, Sandstrom P, Ostman A. Меньшая группа пациентов с почечно-клеточным раком с высокой инфильтрацией В-клеток CD20 + связана с плохой прогноз. Br J Рак. 2018; 119 (7): 840–6.
PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar
Мохаммед З.М., Гоинг Дж. Дж., Эдвардс Дж., Эльсбергер Б., Макмиллан, округ Колумбия. Взаимосвязь между субпопуляциями лимфоцитов и клинико-патологическими детерминантами выживаемости у пациентов с первичным операбельным инвазивным протоковым раком молочной железы.Br J Рак. 2013. 109 (6): 1676–84.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Balkwill F, Montfort A, Capasso M. Регуляторные клетки B при раке. Trends Immunol. 2013; 34 (4): 169–73.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Маури К., Менон М. Человеческие регуляторные В-клетки в здоровье и болезни: терапевтический потенциал.J Clin Invest. 2017; 127 (3): 772–9.
PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Schroeder HW Jr, Cavacini L. Структура и функция иммуноглобулинов. J Allergy Clin Immunol. 2010; 125 (2 Suppl 2): S41–52.
PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Болотин Д.А., Пославский С., Давыдов А.Н., Френкель Ф.Е., Фанчи Л., Золотарева О.И., Хеммерс С., Путинцева Е.В., Образцова А.С., Шугай М. и др.Профилирование репертуара антигенных рецепторов по данным RNA-seq. Nat Biotechnol. 2017; 35 (10): 908–11.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Атлас генома рака Research N. Комплексное молекулярное профилирование аденокарциномы легких. Природа. 2014; 511 (7511): 543–50.
Артикул CAS Google Scholar
Ли Х, Хандакер Б., Вайсокер А, Феннелл Т., Руан Дж., Гомер Н., Март Дж., Абекасис Дж., Дурбин Р.Обработка данных геномного проекта S: формат выравнивания / карты последовательностей и SAMtools. Биоинформатика. 2009. 25 (16): 2078–9.
PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar
Болотин Д.А., Пославский С., Митрофанов И., Шугай М., Мамедов И.З., Путинцева Е.В., Чудаков Д.М. MiXCR: программное обеспечение для комплексного адаптивного профилирования иммунитета. Нат методы. 2015; 12 (5): 380–1.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Шугай М., Багаев Д.В., Турчанинова М.А., Болотин Д.А., Британова О.В., Путинцева Е.В., Погорелый М.В., Назаров В.И., Звягин И.В., Киргизова В.И. и др. VDJtools: объединяющий пост-анализ репертуаров рецепторов Т-клеток. PLoS Comput Biol. 2015; 11 (11): e1004503.
PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar
Tumeh PC, Harview CL, Yearley JH, Shintaku IP, Taylor EJ, Robert L, Chmielowski B, Spasic M, Henry G, Ciobanu V, et al.Блокада PD-1 вызывает ответы, подавляя адаптивную иммунную резистентность. Природа. 2014; 515 (7528): 568–71.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Хантер ДжейДи. Matplotlib: среда 2D-графики. Вычислительная техника в науке и технике. 2007. 9 (3): 90–5.
Артикул Google Scholar
Киношита Т., Мурамацу Р., Фудзита Т., Нагумо Х., Сакураи Т., Нодзи С., Такахата Е., Ягути Т., Цукамото Н., Кудо-Сайто С. и др.Прогностическая ценность инфильтрирующих опухоль лимфоцитов различается в зависимости от гистологического типа и привычки к курению при полностью удаленном немелкоклеточном раке легкого. Энн Онкол. 2016; 27 (11): 2117–23.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Лор М., Эдлунд К., Ботлинг Дж., Хаммад С., Хеллвиг Б., Осман А., Берглунд А., Ламбе М., Холмберг Л., Экман С. и др. Прогностическая значимость инфильтрирующих опухоль плазматических клеток и иммуноглобулина каппа C указывает на важную роль гуморального иммунного ответа при немелкоклеточном раке легкого.Cancer Lett. 2013. 333 (2): 222–8.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Аль-Шибли К.И., Доннем Т., Аль-Саад С., Перссон М., Бремнес Р.М., Бусунд ЛТ. Прогностический эффект инфильтрации эпителиальных и стромальных лимфоцитов при немелкоклеточном раке легкого. Clin Cancer Res. 2008. 14 (16): 5220–7.
CAS Статья Google Scholar
Эрнандес-Прието С., Ромера А., Феррер М., Субиза Дж. Л., Лопес-Асенджо Дж. А., Харабо Дж. Р., Гомес А. М., Молина Е. М., Пуэнте Дж., Гонсалес-Ларриба Дж. Л. и др.Сигнатура из 50 генов — это новая система оценки для инфильтрирующих опухоль иммунных клеток с сильной корреляцией с клиническим исходом немелкоклеточного рака легкого I / II стадии. Clin Transl Oncol. 2015. 17 (4): 330–8.
CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar
Селицкий С.Р., Моуз Л.Е., Смит С.К., Чай С., Ходли К.А., Диттмер Д.П., Москос С.Дж., Паркер Дж.С., Винсент Б.Г. Прогностическое значение В-клеток при меланоме кожи.Геномная медицина. 2019; 11 (1): 36.
PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar
Турчанинова М.А., Давыдов А., Британова О.В., Шугай М., Бикос В., Егоров Е.С., Киргизова В.И., Мерзляк Е.М., Староверов Д.Б., Болотин Д.А. и др. Высококачественное полноразмерное профилирование иммуноглобулинов с уникальным молекулярным штрих-кодированием. Nat Protoc. 2016; 11 (9): 1599–616.
CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar
Cafri G, Yossef R, Pasetto A, Deniger DC, Lu YC, Parkhurst M, Gartner JJ, Jia L, Ray S, Ngo LT и др. Т-клетки памяти, нацеленные на онкогенные мутации, обнаруженные в периферической крови больных эпителиальным раком. Nat Commun. 2019; 10 (1): 449.
PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar
Мэн К., Валентини Д., Рао М., Мейрер М. КРАС РЕНЕССАНС (S) в опухолевых инфильтрирующих В-клетках при раке поджелудочной железы.Фасад Онкол. 2018; 8: 384.
PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Велиндер С., Йирстром К., Лен С., Нодин Б., Марко-Варга Г., Бликст О., Даниэльссон Л., Янссон Б. Внутриоопухолевый IgA1 часто встречается при раке и коррелирует с плохим прогнозом при раке мочевого пузыря. Гелион. 2016; 2 (8): e00143.
PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Fujimoto M, Yoshizawa A, Sumiyoshi S, Sonobe M, Kobayashi M, Koyanagi I, Aini W, Tsuruyama T, Date H, Haga H. Стромальные плазматические клетки, экспрессирующие подкласс иммуноглобулина G4 при немелкоклеточном раке легкого. Hum Pathol. 2013; 44 (8): 1569–76.
CAS PubMed Статья PubMed Central Google Scholar
Biton J, Mansuet-Lupo A, Pecuchet N, Alifano M, Ouakrim H, Arrondeau J, Boudou-Rouquette P, Goldwasser F, Leroy K, Goc J, et al.Мутации TP53, STK11 и EGFR предсказывают иммунный профиль опухоли и ответ на анти-PD-1 при аденокарциноме легкого. Clin Cancer Res. 2018; 24 (22): 5710–23.
PubMed Статья Google Scholar
Zhang XC, Wang J, Shao GG, Wang Q, Qu X, Wang B, Moy C, Fan Y, Albertyn Z, Huang X и др. Всесторонняя геномная и иммунологическая характеристика пациентов с немелкоклеточным раком легкого в Китае. Nat Commun. 2019; 10 (1): 1772.
PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar
Тран Э, Роббинс П.Ф., Лу Ю.К., Прикетт Т.Д., Гартнер Дж.Дж., Цзя Л., Пазетто А., Чжэн З., Рэй С., Гро Э.М. и др. Терапия с переносом Т-клеток, направленная на мутантный KRAS при раке N Engl J Med. 2016. 375 (23): 2255–62.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Schabath MB, Welsh EA, Fulp WJ, Chen L, Teer JK, Thompson ZJ, Engel BE, Xie M, Berglund AE, Creelan BC, et al. Дифференциальная ассоциация STK11 и TP53 с экспрессией, пролиферацией и иммунным надзором генов, связанных с мутацией KRAS, при аденокарциноме легкого.Онкоген. 2016; 35 (24): 3209–16.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Cheng H, Fan K, Luo G, Fan Z, Yang C, Huang Q, Jin K, Xu J, Yu X, Liu C. Kras (G12D) мутация способствует регулятивному превращению Т-клеток через активацию путь MEK / ERK при раке поджелудочной железы. Cancer Lett. 2019; 446: 103–11.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Thorsson V, Gibbs DL, Brown SD, Wolf D, Bortone DS, Ou Yang TH, Porta-Pardo E, Gao GF, Plaisier CL, Eddy JA и др. Иммунный ландшафт Рака. Иммунитет. 2018; 48 (4): 812–30 e814.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Рубцов А.В., Рубцова К., Капплер Дж. В., Якобелли Дж., Фридман Р.С., Маррак П. В-клетки, экспрессирующие CD11c, расположены на границе Т-клетки / В-клетки в селезенке и являются мощными АПК.J Immunol. 2015; 195 (1): 71–9.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Россетти RAM, NPC Лоренци, Yokochi K, Rosa M, Benevides L, Margarido PFR, Baracat EC, Carvalho JP, Villa LL, Lepique AP. В-лимфоциты могут активироваться, чтобы действовать как антигенпрезентирующие клетки, способствуя противоопухолевым ответам. PLoS One. 2018; 13 (7): e0199034.
PubMed PubMed Central Статья CAS Google Scholar
Чафт Дж. Э., Литвак А., Арсила М. Е., Патель П., Д’Анджело С. П., Круг Л. М., Руш В., Маттсон А., Кушотт С., Парк Б. и др. Фаза II исследования вакцины GI-4000 KRAS после лечебной терапии у пациентов с аденокарциномой легких I-III стадии, несущей мутации KRAS G12C, G12D или G12V. Клинический рак легкого. 2014; 15 (6): 405–10.
CAS PubMed Статья Google Scholar
Schuurman J, Perdok GJ, Gorter AD, Aalberse RC. Дисульфидные связи между тяжелыми цепями IgG4 находятся в равновесии с внутрицепочечными дисульфидными связями.Мол Иммунол. 2001. 38 (1): 1–8.
CAS PubMed Статья Google Scholar
van der Neut KM, Schuurman J, Losen M, Bleeker WK, Martinez-Martinez P, Vermeulen E, den Bleker TH, Wiegman L, Vink T, Aarden LA и др. Противовоспалительная активность человеческих антител IgG4 при динамическом обмене Fab-плечами. Наука. 2007. 317 (5844): 1554–7.
Артикул CAS Google Scholar
Гундерсон А.Дж., Куссенс Л.М. В-клетки и их медиаторы как мишени для терапии солидных опухолей. Exp Cell Res. 2013. 319 (11): 1644–9.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Карагианнис П., Гилберт А.Е., Джозефс Д.Х., Али Н., Додев Т., Саул Л., Корреа И., Робертс Л., Беддоуз Е., Коерс А. и др. Антитела подкласса IgG4 нарушают противоопухолевый иммунитет при меланоме. J Clin Invest. 2013; 123 (4): 1457–74.
CAS PubMed PubMed Central Статья Google Scholar
Shi Lab — Публикации
43. Ши Л. ** , Фунг А.А. Энди Чжоу. «Достижения в области визуализации вынужденного комбинационного рассеяния света в тканях и животных», приглашенный агентством Quantitative Imaging в медицине и хирургии. 2020.
42. Фунг А. А., Ши Л ** . «Визуализация клеток и тканей млекопитающих с использованием рамановской и когерентной рамановской микроскопии». ПРОВОДА Системная биология и медицина . 2020; e1501. https://doi.org/10.1002/wsbm.1501, 2020.
41. Ши Л. ** , Гайен Т., Буданский Ю., Ю К., Секор Дж., Харви Т., Харви Г., Шумяцкий П., Нолан Д. и Альфано Р. «Повышенное стимулированное рамановское рассеяние растворителя из-за ангармонической передачи энергии от резонансных рамановских молекул растворенного вещества». Опт. Express 28, 21792-21804, 2020.
40. Shi L., Liu X. *, Shi L. *, Stinson H., Rowlette J., Kahl L., Evans C., Zheng C., Dietrich L. , Мин В. «Визуализация метаболизма в среднем инфракрасном диапазоне с помощью вибрационных датчиков». Nature Methods 17, 844-851, 2020.
39. Mazhar SFB., Meyer H.J., Samuels T., Шаронов М., Ши L , Альфано Р.Р. «Объяснение конкуренции между индуцированным О- и Е-волнами стимулированного комбинационного рассеяния света и суперконтинуума в кальците при сверхбыстром лазерном возбуждении». Applied Optics 59 (17), 5252-5257, 2020.
38. Xiong H., Qian N., Zhao L., Shi L, Miao Y, Min W. «Отображение химических связей без фона с помощью простая и надежная частотно-модулированная микроскопия с вынужденным комбинационным рассеянием ». Optics Express 28 (10), 15663-15677, 2020.
37.Bendau E., Smith J., Zhang L., Ackerstaff E., Kruchevsky N., Wu B., Koutcher JA, Alfano RR и Shi L. ** «Отличие метастатического тройного отрицательного рака молочной железы от неметастатического рака молочной железы». с использованием ГВГ-визуализации и резонансной рамановской спектроскопии ». J. Biophotonics , 2020; e202000005, 2020 (** соответствующий автор)
36. Мамани С., Нолан Д.А., Ши Л., Альфано Р.Р.« Специальные классы оптических векторных вихрей. лучи — это фотоны типа Майорана ». Optics Communications , 464, 125425, 2020.
35. Шумяцкий П., Ши Л., Сордилло Л. А., Буданский Ю., Альфано Р. Р. «Сравнение непрерывной волны с пикосекундным ВКР и эффект резонансного ВКР». Applied Optics 59 (3), 622-627, 2020.
34. Zhang L *, Shi L *, Shen Y *, Miao Y, Wei M, Qian N, Liu Y, Min W. «Спектральная трассировка изотопа дейтерия для визуализации метаболизма глюкозы ». Nature Biomedical Engineering 3 (5): 402-413, 2019. (соавтор)
33. Wei M *, Shi L *, Shen Y, Zhao Z, Guzman A, Kaufman L, Wei L, Min W.«Объемная химическая визуализация с помощью микроскопии стимулированного комбинационного рассеяния света с улучшенным просветом». PNAS 116 (14): 6608-6617, 2019. (соавтор)
32. Чжоу Ю., Лю К., Ву Б., Ю X., Ченг Г., Чжу К., Ван К. ., Zhang C., Zhao M., Zong R., Zhang L., Shi L., Alfano RR Идентификация оптической биопсии и классификация глиом с использованием безметочной резонансной рамановской спектроскопии, J. of Biomedical Optic s, 24 (9), 095001, 2019.
31. Лю К., Ву Б., Сордилло Л., Boydston-White S., Sriramoju V., Zhang C., Beckman H., Zhang L., Pei Z., Shi L., Alfano RR «Пилотное исследование по различению базальноклеточного рака от нормальных тканей кожи человека с использованием видимого резонанса. Рамановская спектроскопия ». J Лечение метастазов рака ; 5: 4, 2019.
30. Zhou Y, Liu C, Wu B, Zhang C, Yu X, Cheng G, Chen H, Li S, Liang Q, Zhang M, Zhu K, Shi L, and Alfano RR «Характеристика молекулярных биомаркеров для классификации глиомы мозга человека с использованием видимой резонансной рамановской спектроскопии». APL Photonics 3, 120802, 2018.
29. Shi L *, Zheng C *, Shen Y, Chen Z, Silveira E, Zhang L, Wei M, Liu C, De Sena-Tomas C, Targoff K, Min W. «Оптическое отображение метаболической динамики у животных». Nature Communications , 9, 2995, 2018.
28. Ши Л., Шен И. и Мин У. «Визуализация синтеза белка у мышей с мечения дейтерированных аминокислот in vivo с использованием вибрационной визуализации». APL Photonics 3 , 092401, 2018.
27. Long R, Zhang L, Shi L, Shen Y, Hu F, Zeng C.и Мин В. «Двухцветная вибрационная визуализация метаболизма глюкозы с помощью стимулированного комбинационного рассеяния света». Chemical Communications 152-155, 2018.
26. Мамани С., Ши Л., Ахмед Т., Карник Р., Родригес-Контрерас А., Нолан Д. и Альфано Р. Р. «Передача классически запутанных лучей через ткань мозга мыши». Дж. Биофотоника . 11 (12): e201800096, 2018.
25. Лу Л., Ши Л., Секор Дж., Альфано Р. Р. «Резонансное комбинационное рассеяние раствора β-каротина, возбужденного видимыми лазерными лучами во втором синглетном состоянии». J. Photochem. Photobiol . B 179: 18-22, 2018.
24. Шен Й, Чжао З, Чжан Л., Ши Л., Шахриар С., Чан Р., Паоло Дж., Мин В. «Метаболическая активность вызывает разделение фаз мембраны в эндоплазматическом ретикулуме». PNAS 114 (51): 13394-13399, 2017.
23. Сордилло, округ Колумбия, Сордилло, Лос-Анджелес, Сордилло П.П., Ши Л., Альфано Р.Р. «Коротковолновые инфракрасные оптические окна для оценки доброкачественных и злокачественных тканей». J. Biomed. Опция . 22 (4): 45002, 2017.
22.Ши Л., Линдвассер Л., Ван В., Родригес-Контрерас А. и Альфано Р. Р.. «Распространение гауссовых и гауссовых гауссовских пучков вихрей через ткань мозга мыши». J. Biophotonics 10 (12): 1756-1760, 2017.
21. Ши Л., Лу Л., Харви Г., Харви Т., Родригес-Контрерас А. и Альфано Р. Р.. «Безметочная флуоресцентная спектроскопия для обнаружения ключевых биомолекул в ткани мозга на мышиной модели болезни Альцгеймера». Scientific Reports 7: 2599, 2017.
20. Das B *, Shi L *, Budansky Y, Rodríguez-Contreras A, and Alfano RR.«Ткань мозга мышей с болезнью Альцгеймера, измеренная с помощью флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением с использованием одно- и многофотонного возбуждения нативных молекул, свободных от метки». J. Biophotonics 11 (1), 2017. (соавтор).
19. Ши Л., Гальвез Э. и Альфано Р. Р. «Плетение фотонов через ткани мозга». Scientific Reports 6: 37714, 2016.
18. Лю С., Бойдстон-Уайт С., Вайсберг А., Ван В., Сордилло Л., Перот А., Томаселли В., Сордилло П., Пей З, Ши Л. и Альфано Р. Р..«Обнаружение уязвимых атеросклеротических бляшек с помощью резонансной рамановской спектроскопии», J. Biomed. Опция . 21 (12): 127006, 2016.
17. Альфано Р.Р., Милионе Дж., Гальвез Э. Дж., Ши Л. «Оптические источники: лазер для сложных пространственных мод». Nature Photonics 10 (5): 286-288, 2016.
16. Ван В., Гозали Р., Ши Л. и Альфано Р. Р. «Глубокое прохождение лагерро-гауссовых вихревых пучков через мутную рассеивающую среду». Опт. Lett. 41 (9): 2069-72, 2016.
15.Ши Л., Шумятский П., Родригес-Контрерас А., Альфано Р. Р. «Терагерцовые спектры мозговой ткани на мышиной модели болезни Альцгеймера». J. Biomed. Опция . 21 (1): 015014-1, 2016.
14. Ши Л., Сордилло Л.А., Родригес-Контрерас А., Альфано Р. Р. «Передача в ближнем инфракрасном оптическом окне для глубокой визуализации мозга». J. Biophotonics 9 (1–2): 38–43, 2016.
13. Ши Л., Родригес-Контрерас А., Альфано Р. Р. «Гауссов луч в двухфотонной флуоресцентной визуализации микрососудов мозга крысы». J. Biomed. Опция . 19 (12): 126006, 2014.
12. Shi L, Palacio P, Badami J, Shin D, Zeng M, Cardoso L, Tu R, Fu BM «Количественная оценка временного увеличения проницаемости гематоэнцефалического барьера для макромолекул. оптимизированным сфокусированным ультразвуком в сочетании с микропузырьками ». Внутр. Ж. Наномедицина . 9 (1): 4437-48, 2014.
11. Ши Л., Цзэн М., Фу Б.М. «Временные эффекты фактора роста эндотелия сосудов и 3,5-циклического монофосфата на проницаемость растворенных веществ через гематоэнцефалический барьер in vivo». J. Neurosci. Res . 92 (12): 1678-89, 2014.
10. Shi L, Rodriguez-Contreras A, Budansky Y, Pu Y, Nguyen T., Alfano RR «Глубокое двухфотонное микроскопическое изображение ткани мозга с использованием второго синглетного состояния из флуоресцентный агент хлорофилл α в листьях шпината ». J. Biomed. Опт. 19 (6): 066009, 2014.
9. Ши Л. Рецензия на книгу «Диагностическая эндоскопия». J. Biomed. Опция . 19 (4): 049902-1. 2014.
8. Ши Л., Цзэн М., Сунь Й, Фу Б. М.«Количественная оценка проницаемости растворенных веществ гематоэнцефалического барьера и транспорта мозга с помощью многофотонной микроскопии». J. Biomech. Eng . 136: 031005, 2014.
7. Родригес-Контрерас А., Ши Л., Фу Б. М. «Метод трепанации черепа вентрального черепа новорожденных грызунов». J. Vis. Exp. (87), e51350, 2014.
6. Ислам СМЗ, Гайен Т., Тинт Н., Ши Л., Середыч М., Бандош Т.Дж. и Альфано Р.Р. «Влияние температуры изготовления на вольт-амперные характеристики и энергетическую эффективность квантовых устройств точечно-сенсибилизированные гибридные солнечные элементы ZnOH-GO ». J. Appl. Phys . 116, 173102, 2014.
5. Ислам СМЗ, Гайен Т., Тинт Н., Ши Л., Середыч М., Бандош Т.Дж., Альфано Р.Р. «Гибридные солнечные элементы из микро / мезопористого Zn (OH) 2 и его графитовых композитов, сенсибилизированных. квантовыми точками CdSe ». J. Photon. Энергия . 4 (1): 043098, 2014.
4. Pu Y, Ши Л., Пратавиера С., Альфано Р. Р. «Микроскопия с двухфотонным возбуждением с использованием второго синглетного состояния флуоресцентных агентов в оптическом окне ткани». Дж.Прил. Phys. 114 (15): 153102-4, 2013.
3. Ислам СМЗ, Гайен Т., Середыч М., Мабайой О., Ши Л., Бандош Т. Дж. И Альфано Р. Р. Энергия запрещенной зоны солнечных микро / мезопористых композитов оксид цинка (гидр) с оксидами графита ». J. Appl. Phys. 114 (4): 043522 — 6, 2013.
2. Ислам СМЗ, Гайен Т., Дас Б., Ши Л., Середыч М., Муссави А., Бандош Т.Дж., Альфано Р.Р. «Флуоресценция с временным разрешением Zn (OH) 2 и композит с оксидом графита ». Опт. Lett. 38 (13): 2227-2229, 2013.
1. Ислам СМЗ, Гайен Т., Муссави А., Ши Л., Середыч М., Бандош Т.Дж., Альфано Р. Р. «Структурные и оптические характеристики Zn (OH) 2 и его композитов с оксидами графита». Опт. Lett. 38 (6): 962-964, 2013.
Купить Lq15 Quadrangle: Lunar Orbiter 1, Buys-Ballot, Mendeleev, Mandel’shtam, Coriolis, Van Gent, Schuster, Mare Moscoviense, Тихомиров, Шаронов Забронировать онлайн по низким ценам в Индии | Lq15 Quadrangle: Lunar Orbiter 1, Buys-Ballot, Менделеев, Мандельштам, Кориолис, Ван Гент, Шустер, Mare Moscoviense, Тихомиров, Шаронов Отзывы и рейтинги
Обратите внимание, что содержание этой книги в основном состоит из статей, доступных из Википедии или других бесплатных источников в Интернете.Страниц: 109. Без иллюстраций. Главы: Lunar Orbiter 1, Buys-Ballot, Менделеев, Мандельштам, Кориолис, Ван Гент, Шустер, Mare Moscoviense, Тихомиров, Шаронов, Миллс, Хоффмайстер, Штайн, Андерсон, Тиселиус, Виртанен, Валье, Сент-Джон, Спенсер Джонс , Фрейндлих, Зидентопф, Дюфай, Папалекси, Кольшуттер, Трамплер, Хендерсон, Хартманн, Нагаока, Титов, Зернике, Чосер, Терешкова, afa ik, Ричардс, Комаров, Фишер, Бергман, Глаубер, Маре Десидехатерин, Сэдэдэхэтэриэн, Хардэн , Бенедикт, Леонов, Lacus Luxuriae.Отрывок: Mare Moscoviense («Московское море») — лунная кобыла, обитающая в бассейне Moscoviense. Это одна из немногих марий на обратной стороне Луны. Как и Mare Marginis, эта кобыла кажется довольно худой. Однако он явно сосредоточен в большом ударном бассейне. Он также намного ниже, чем дно внешнего бассейна или дальнее нагорье. Большая глубина этой кобылы под близлежащим нагорьем, вероятно, объясняет, почему отряды кобыл настолько редки на дальней стороне Луны. Очень немногие бассейны на дальнем берегу были достаточно глубокими, чтобы допустить кобыльский вулканизм.Таким образом, в то время как большие ударные бассейны встречаются как на ближней, так и на дальней стороне, большие моря в основном встречаются на ближней стороне. По-видимому, морские лавы могли чаще и легче выходить на поверхность. Материал бассейна относится к нектарской эпохе, а кобыльский — к верхнеимбрийской. Кратер Комаров находится к юго-востоку от кобылы, а кратер Титова — в северной части кобылы. Этот регион был назван Mare Moscovrae после того, как Луна 3 вернула первые изображения обратной стороны.Однако сегодня только название Mare Moscoviense признано МАС и используется в настоящее время.
Новый pH-зависимый мембранный пептид, который связывается с EphA2 и ингибирует миграцию клеток
На обозревателей произвело положительное впечатление сочетание большого объема биофизической, клеточно-биологической и модельной работы, которую вы смогли построить на сложной системе. Они считают, что ваше исследование будет значительным шагом вперед в этой области, но тем не менее требуется значительное количество дополнительных доказательств в поддержку ваших выводов и изменений для консолидации статьи.
Эти основные моменты резюмируются ниже:
1) Чтобы подтвердить свою гипотезу, авторы должны подтвердить, что TYPE7 действительно увеличивает активность киназы EphA2, например, путем мониторинга фосфорилирования субстрата (Fang et al., 2008) и / или с помощью набора антител к фосфокиназе на рисунке 4 — дополнение к рисунку 3, которое содержит ряд нисходящих целей EphA2.
Чтобы удовлетворить запрос о мониторинге фосфорилирования субстрата EphA2, мы изучили влияние TYPE7 на фосфорилирование Akt.Akt является важной нижестоящей мишенью EphA2, а фосфорилирование Akt способствует миграции клеток. Мы предлагаем новые панели рисунков (рис. 3F-H), которые показывают, что TYPE7 вызывает дефосфорилирование Akt, которое сравнимо с эффектом ephrinA1-Fc (EA1), лиганда EphA2. Дефосфорилирование Akt — это хорошо зарекомендовавший себя механизм уменьшения миграции клеток. Таким образом, это новое открытие дополняет уже собранную нами механистическую информацию TYPE7. Нам было предложено изучить Akt после переоценки набора киназ, где мы заметили, что TYPE7 способствует дефосфорилированию Akt (теперь он показан на рисунке 4 — рисунок в приложении 12C), который теперь упоминается в последнем абзаце подраздела «TYPE7 способствует ограниченному самостоятельная сборка EphA2 ».Чтобы проверить результаты набора киназ, мы решили провести вестерн-блоттинг для двух сайтов активации Akt (S473 и T308), подтвердив влияние TYPE7 на эту киназу, важную для миграции клеток. Идентификация влияния TYPE7 на важнейшую нисходящую мишень EphA2 является важным дополнением к рукописи.
Первоначально мы предложили изучить Rac1, отдельную цель нижестоящего EphA2. Мы провели эти эксперименты, и мы не обнаружили влияния TYPE7 на фосфорилирование Rac1.Этот результат неудивителен, поскольку активация Rac1 происходит, когда EphA2 фосфорилируется по Y735, остатку, который мы не оценивали в нашей рукописи из-за отсутствия коммерчески доступных фосфоспецифических антител.
2) Они должны показать, что TYPE7 не влияет на кластеризацию EphA2-deltaJ-GFP, если домен TM заменен неродственным доменом TM, и что TYPE7 не влияет на кластеризацию Myr-EphA2-ICD-GFP, если положительно заряженный аминокислоты удаляются.
Новые эксперименты FCS были выполнены на живых клетках, где коэффициент диффузии рецептора Plexin A4 был определен в контрольных условиях и в присутствии TYPE7.Новый рисунок (Рисунок 4 — приложение к рисунку 11) показывает, что TYPE7 не влияет на латеральную диффузию Plexin A4-GFP. Был добавлен новый параграф, обсуждающий эти результаты (подраздел «TYPE7 способствует ограниченной самосборке EphA2», третий параграф). Этот результат предполагает, что TYPE7 не влияет на мембранную диффузию однопроходных мембранных рецепторов неспецифическим образом, и что влияние TYPE7 на диффузию EphA2 является результатом прямого связывания.
3) Некоторые контрольные эксперименты отсутствуют: чтобы сделать вывод о том, что TYPE7 увеличивает pY772, а pHLIP — нет, эффекты TYPE 7 и pHLIP следует сравнивать в одних и тех же клетках и предпочтительно в одном эксперименте.
Рукопись уже содержалась в исходных данных представления, выполненных с pHLIP и TYPE7, переносимых одновременно и с той же линией клеток, h458 (Рисунок 3 — приложение к рисунку 6C). Мы провели дополнительные эксперименты, в которых изучали влияние на фосфорилирование Y772 TYPE7 и pHLIP. Эти эксперименты снова проводятся в то же время, но теперь в ячейках A375. Кроме того, эксперименты с pHLIP, проведенные при кислом pH (pH 4,2), где pHLIP, как ожидается, будет полностью в трансмембранной конфигурации, не показали никакого эффекта (Рисунок 3 — приложение к рисунку 6B).Согласно новым данным, TYPE7 также увеличивает фосфорилирование EphA2 по Y772, хотя и в меньшей степени, чем в клетках h458. Мы также включаем дополнительный рисунок (рисунок 3 — приложение к рисунку 5), где изучалась миграция клеток в клетках h458 (предыдущие данные миграции, рисунок 3A, были выполнены в клетках A375). TYPE7 снижает миграцию клеток в обеих клеточных линиях. Однако эффект кажется даже более сильным в клетках h458, что, по-видимому, согласуется с большим увеличением фосфорилирования Y772 в этой клеточной линии по сравнению с A375.
4) Рецензенты обеспокоены математической моделью кинетики и задаются вопросом, следует ли сохранить эту модель в рукописи. Во-первых, неясно, была ли модель просто построена на заказ для получения наблюдаемых результатов, а действительно ли она предоставила новое понимание. Этот момент следует прояснить. Более того, некоторые прогнозы модели не согласуются с опубликованными данными: например, литература не поддерживает наличие значительной популяции неактивных димеров EphA2 в отсутствие эфрина-As (см., Например, Singh et al., 2015 и Sabet et al., 2015; Сингх и др., 2018 г., Биология коммуникации 15; и, для EphB2, Ojosnegros et al., 2017 PNAS 114: 13188). Согласно предложенной модели, стимуляция ephrinA1 разрушает неактивные димеры EphA2 и способствует образованию активных димеров, которые используют другой интерфейс TM. Каковы прогнозы модели в отношении поведения двух мутантов EphA2 с нарушенным интерфейсом TM, и согласуются ли они с данными в Sharonov et al., 2014, где мутация каждого интерфейса TM влияет на активность EphA2 как в нестимулированном, так и в ephrinA1? -стимулированные клетки?
В результате вашего предложения последняя версия рукописи больше не содержит разделов математического моделирования.Проблемы, поднятые в этом пункте, а также в следующем, относятся исключительно к модели. После удаления этой не центральной части рукописи эти опасения должны были быть устранены.
5) Авторы должны добавить больше экспериментальных доказательств того, что TYPE7 взаимодействует с интерфейсом EphA2 TM, но не с другим интерфейсом.
См. Ответ на пункт 4.
Рецензент № 1:
[…] У меня есть два важных комментария, которые, если правильно проработать их, убедят меня в том, что статью следует опубликовать в eLife.
1) Авторы заявляют со ссылкой на фиг. 3 — приложение к рисунку 4D-E, что не наблюдается значительного увеличения уровней EphA2 после лечения TYPE7. Однако эта цифра, похоже, указывает на то, что есть, по крайней мере, некоторое увеличение экспрессии (примерно на 30%). Поскольку мы не знаем, существует ли связь между уровнями экспрессии EphA2 и активацией, необходимо исключить возможность того, что повышенная (хотя и умеренная) экспрессия, индуцированная TYPE7, не вызывает активации.Сверхэкспрессия других мембранных белков, таких как рецепторы TNF, может вызывать кластеризацию без лиганда и активацию в клеточных мембранах. Авторы должны протестировать эффект сверхэкспрессии в своих клеточных линиях на различных уровнях трансфекции ДНК, чтобы убедить читателя в том, что это не влияет на их основные выводы.
Мы включили дополнительные данные FCS, которые подтверждают предыдущий вестерн-блоттинг EphA2. Эти результаты показывают, что TYPE7 не изменяет уровни EphA2FL-GFP или EphA2DJ-GFP в плазматической мембране (Рисунок 4 — приложение к рисунку 10C).Теперь мы упоминаем об этом открытии во втором абзаце подраздела «TYPE7 способствует ограниченной самосборке EphA2».
2) Использование компьютерного моделирования заслуживает похвалы, но мне не ясно, действительно ли эта модель дала новое понимание. В частности, я не убежден, что результаты модели не являются тривиальным следствием предположений, использованных для построения модели. Авторам следует лучше объяснять модель и делать прозрачным то, чем результаты модели отличаются от тех, которые являются тривиальным следствием исходных предположений.Я постараюсь объяснить, и если я просто запутался, исправьте текст, чтобы прояснить эти моменты:
«Модель предполагает, что связывание уровней насыщения EA1 вызывает конформационный переключатель, который неблагоприятен для неактивных димеров, полностью блокируя неактивный интерфейс». Затем, что неудивительно, результаты показывают увеличение количества мономеров при добавлении лиганда и быстрое увеличение кластеров из-за быстрого образования активных димеров (рис. 5B). Затем добавление Типа 7 (рис. 5C) все замедляет.Разве это не просто следствие того факта, что, в отличие от лиганда EA1, эффект TYPE7 замедлен по вашему выбору, чтобы замедлить его реактивность путем его диффузии? То есть, учитывая эту разницу между EA1 (мгновенное / насыщающее) и TYPE7 (диффузионно-замедленное / зависящее от концентрации), разве вы не могли заранее предсказать (то есть без решения уравнений), что процесс будет замедлен с TYPE7? Я не говорю, что механизм замедления неправильный (связывание лиганда мгновенно активирует предварительно собранные димеры, а TYPE7 должен диффундировать), я просто спрашиваю, нужна ли вам сложная кинетическая модель, чтобы знать, что это так.
Чтобы решить эту проблему, в рукописи больше нет математической модели.
Рецензент № 2:
[…] Открытие пептида, который можно использовать для активации EphA2 нетрадиционным механизмом, потенциально интересно и может иметь терапевтическое применение. Однако необходимы дополнительные экспериментальные данные для подтверждения представленных выводов и математической модели кластеризации EphA2.
Авт. Обнаружили, что TYPE7 увеличивает фосфорилирование EphA2 на Y772, но не на Y588 и Y594.Они предполагают, что это связано с новым механизмом активации EphA2, который не включает фосфорилирование Y588 и Y594. Чтобы поддержать эту гипотезу, авторы должны проверить, что TYPE7 действительно увеличивает активность киназы EphA2 (например, путем мониторинга фосфорилирования субстрата (Fang et al., 2008) и / или с помощью набора антител к фосфокиназе на рисунке 4. — рисунок в приложении 3, который содержит ряд нисходящих целей EphA2). Следует отметить, что pY588 и pY594 являются основными сайтами аутофосфорилирования EphA2, и поэтому можно ожидать, что они будут фосфорилироваться в активном рецепторе, даже если их фосфорилирование не играет роли в активации рецептора.Следует также отметить, что Locard-Paulet et al., 2016, причастны pY772 к миграции / инвазивности раковых клеток, но этот эффект может не быть связан с активностью киназы EphA2.
Мы благодарим рецензента за сообщение об этой проблеме. Это побудило нас изучить последующие эффекты TYPE7. В результате мы обнаружили, что TYPE7 вызывает дефосфорилирование Akt, белка, который способствует миграции клеток. Эффект TYPE7 был аналогичен эффекту ephrinA1-Fc. Эти новые данные (рис. 3F-H) показывают, что TYPE7 влияет на фосфорилирование нижестоящей мишени EphA2, которая является ключевой для миграции клеток.
Дополнительные элементы управления необходимы для поддержки предложенного механизма активации EphA2 с помощью TYPE7. Например, дополнительные элементы управления для рисунков 2A, B должны включать кластеризацию неродственного трансмембранного рецептора, чтобы показать, что TYPE7 специфически объединяется с EphA2.
Мы изучили, влияет ли TYPE7 на диффузионные свойства плексина A4, неродственного однопроходного рецептора. Данные на рис. 4 — приложение к рисунку 11 показывают, что TYPE7 не влияет на диффузию этого рецептора, что дополнительно предполагает, что действие TYPE7 на EphA2 является специфическим.
Дополнительные элементы управления для рисунка 3A и рисунка 3 — приложение к рисунку 3 не должно демонстрировать никаких эффектов TYPE7 на миграцию клеток, которые не экспрессируют EphA2, чтобы исключить неспецифические эффекты TYPE7 на миграцию клеток.
Рукопись теперь содержит данные о миграции клеток в двух разных линиях клеток: A375, рис. 3A; и h458, рисунок 3 — дополнение к рисунку 5, которое подкрепляет наши предыдущие данные о миграции клеток. Однако мы думаем, что проведение экспериментов с мигрирующими клетками, которые не экспрессируют EphA2, выходит за рамки рукописи, которая уже содержит обширные доказательства специфичности эффекта TYPE7.
Кроме того, эксперименты с пептидом pHLIP на фиг. 3 — рисунки 2 и 3 могут оказаться недостаточными в качестве контролей, если они проводились при нейтральном pH, поскольку в этих условиях TYPE7, но не pHLIP, будет внедряться в мембрану клеток, экспрессирующих EphA2.
Рисунок 3 — дополнение к рисунку 6 теперь содержит эксперименты, проведенные с pHLIP при кислом pH. Эти результаты показывают, что pHLIP не вызывает изменений в фосфорилировании EphA2 Y772 при нейтральном pH (Рисунок 3 — приложение к рисунку 6C) или кислом pH (Рисунок 3 — приложение к рисунку 6B).Эти результаты подтверждают данные, уже представленные на рисунке 3 — рисунок в приложении 7, показывающий, что pHLIP не влияет на миграцию клеток.
Авт. Предполагают, что TYPE7 взаимодействует с интерфейсом EphA2 TM, наблюдаемым с помощью ЯМР (предполагается, что он обеспечивает димеризацию неактивного EphA2 в клетках), но не с другим интерфейсом (предполагается, что он обеспечивает димеризацию активного EphA2 в клетках). Однако необходимо включить дополнительные экспериментальные данные в поддержку этой модели. Например, Шаронов и др., 2014, сообщает о мутациях, которые выборочно дестабилизируют каждый интерфейс TM. Если механизм, представленный авторами, верен, TYPE7 не должен ассоциироваться с мутантом EphA2, где интерфейс, предположительно опосредующий образование неактивных димеров и взаимодействующий с TYPE7, мутирован.
Чтобы решить эту проблему, в рукописи больше нет математической модели.
Авт. Предполагают, что TYPE7 влияет на кластеризацию EphA2 посредством взаимодействия как с TM доменом, так и с положительно заряженной частью на N-конце сегмента JMS.Чтобы поддержать эту идею, авторы должны показать, что (i) TYPE7 не влияет на кластеризацию EphA2-deltaJ-GFP, если домен TM заменен неродственным доменом TM, и (ii) TYPE7 не влияет на кластеризацию Myr-EphA2. -ICD-GFP, если удаляются положительно заряженные аминокислоты. Может ли альтернативное объяснение эффектов, наблюдаемых на рисунке 4, заключаться в том, что введение TYPE7 изменяет свойства мембран, замедляя латеральную диффузию белков?
Мы благодарим рецензента за этот комментарий, поднимающий интригующую возможность того, что TYPE7 может изменять физические свойства мембраны таким образом, что замедляет диффузию белка.Чтобы исключить эту возможность, мы провели эксперименты FCS с другим рецептором, Plexin A4. Новые данные, содержащиеся на рисунке 4 — добавление к рисунку 11, показывают, что TYPE7 не влияет на коэффициент диффузии плексина A4, что позволяет предположить, что TYPE7 не увеличивает микровязкость плазматической мембраны.
Различные типы экспериментов и их контроли должны проводиться на одной и той же клеточной линии с возможной проверкой некоторых результатов на других клеточных линиях. Например, контроли на рисунке 3 — рисунок 2 с пептидом pHLIP следует проводить в той же клеточной линии, которая использовалась для изучения эффектов TYPE7 (т.е.е. A375). Существует также некоторая озабоченность по поводу использования клеток h458, в которых активация EphA2 с помощью ephrinA1, по-видимому, не имеет надежных сигнальных эффектов (см. Рисунки 3 — приложение к рисунку 2 и рисунок 4 — приложение к рисунку 3).
Эксперименты, проведенные одновременно с TYPE7 и pHLIP в клетках A375 (рис. 3 — приложение к рисунку 6B) и клетках h458 (рисунок 3 — приложение к рисунку 6C), показывают, что, хотя TYPE7 действительно увеличивает P-Y772, pHLIP не увеличивает. Дополнительные данные о клетках h458 подтверждают мнение о том, что эти клетки пригодны для изучения EphA2, поскольку EA1 значительно снижает миграцию клеток (рис. 3 — приложение к рис. 5) и способствует фосфорилированию EphA2 Y588 (рис. 3B, D, E) и де- фосфорилирует Akt (рис. 3F-H).
Авторы представляют подробную математическую модель кластеризации EphA2. Однако некоторые прогнозы модели не соответствуют опубликованным данным. Например, данные в литературе не подтверждают наличие значительной популяции неактивных димеров EphA2 в отсутствие эфрин-As (см., Например, Singh et al., 2015 и Sabet et al., 2015; Singh et al. ., 2018, Communications Biology 15; и, для EphB2, Ojosnegros et al., 2017 PNAS 114: 13188).Согласно предложенной модели, стимуляция ephrinA1 разрушает неактивные димеры EphA2 и способствует образованию активных димеров, которые используют другой интерфейс TM. Каковы прогнозы модели в отношении поведения двух мутантов EphA2 с нарушенным интерфейсом TM? Согласованы ли эти прогнозы с предыдущими данными Sharonov et al., 2014, где мутации каждого интерфейса TM влияли на активность EphA2 как в нестимулированных, так и в стимулированных ephrinA1 клетках?
Чтобы решить эту проблему, в рукописи больше нет математической модели.
Рецензент № 3:
[…] Приведенные ниже комментарии представляют собой предложения о том, как авторы могут и должны улучшить и без того очень хорошую и тщательно написанную рукопись.
Рис. 1: A) выровняйте последовательности для облегчения сравнения. D) Слишком много кривых связывания, наложенных друг на друга, так что их невозможно различить по отдельности. Я предлагаю сгруппировать их в разные панели или отобразить некоторые из них со смещенной шкалой pH. Объединенные наложения все еще можно было бы показать на дополнительном рисунке, чтобы подчеркнуть хорошее наложение.E) На рисунке справа я не уверен, каковы доказательства того, что TYPE2 связывается с димером EphA2. Разве не было бы более реалистичным показать связывание TYPE2 с мономером, вытесняющее другой мономер EphA2?
A) Последовательности были выровнены, как было предложено рецензентом.
D) Рецензент прав, указывая, что в исходной версии рисунков было трудно индивидуально различить некоторые из наложенных кривых. Мы изменили затенение, представляющее доверительные интервалы, и думаем, что теперь легче различать разные эксперименты.
E) Рисунок предназначен для демонстрации модели связывания между TYPE7 и TM-EphA2, без каких-либо заявлений о специфическом состоянии олигомеризации или стехиометрии связывания.
экспериментов ОКР, описанных в последнем абзаце подраздела «Шаронов и др., 2014»: действительно ли красная пунктирная линия ближе к теоретической кривой для спирали ТМ? Мне эти данные кажутся несколько неоднозначными. Действительно ли эти данные отражают ситуацию с pH 5? При чтении соответствующего раздела «Материалы и методы» выясняется, что сначала пептиды и липиды были высушены, а затем повторно гидратированы до относительной влажности 96%.Фактически, в этой ситуации значение pH может быть неопределенным, и мембраны при относительной влажности 96% не такие, как в основной воде или буфере, и это может загнать пептид глубже в мембрану и тем самым изменить его ориентацию относительно полностью гидратированных бислоев. Это следует признать. Если авторы считают, что это не вызывает беспокойства, они должны представить сравнительные данные при pH 5 и pH 7.
Рецензент был справедливо сбит с толку, поскольку цвет (серый и черный) двух теоретических линий в легенде рисунка поменялся местами (в основном тексте это было правильно).Мы благодарим рецензента за обнаружение этой ошибки. Текст зафиксирован в легенде на Рисунке 1. Мы обновили раздел «Материалы и методы», чтобы уточнить значение относительной влажности 96% (подраздел «Ориентированный круговой дихроизм (ОКР)»). Во время инкубации в течение ночи сухой образец на предметном стекле сначала был полностью гидратирован большим количеством кислотного буфера. Мы ожидаем, что после инкубации в течение ночи влажность липидных бислоев будет близка к 100%. Чтобы избежать высыхания ранее добавленного буфера, большое количество насыщенной соли заполняло изгиб, где выполнялся этот этап.Атмосфера этого изгиба должна была сохраняться влажной с помощью насыщенной соли (относительная влажность 96%). Однако образец все равно будет на 100% гидратирован. В этой ситуации мы ожидаем адекватного контроля pH. Мы благодарим рецензента за то, что он подсказал нам прояснить этот важный момент. Мы уверены, что применяемый нами протокол ОКР дает достоверные результаты. В частности, мы провели эксперименты с ОКР на трех различных пептидах, и наши результаты дали ориентацию мембран, независимо подтвержденную другими методами с использованием 100% гидратации.Это пептид GWALP23 (Nguyen et al., 2018 Biophysical Journal), пептид pHLIP (Scott et al., 2015 Biochemistry) и пептид ATRAM (Nguyen et al., 2015).
Что касается предложения о проведении экспериментов по ОКР при pH 7, мы думаем, что это не может быть простым экспериментом. С одной стороны, при этом pH пептид имеет небольшую спиральную структуру (рис. 1B), и ожидается очень слабый сигнал OCD. Кроме того, выполнение этого эксперимента имеет дополнительную сложность, заключающуюся в том, что при нейтральном pH сродство к мембране TYPE7 уменьшается (рис. 1C), в результате чего немаловажное количество пептида не связывается с мембраной, но остается в растворе.Любой сигнал CD от этого образца будет результатом не ориентированного пептида, а от TYPE7 в растворе, вызывающего артефакт. В прошлом такая ситуация делала интерпретацию данных ОКР pHLIP при нейтральном pH ненадежной в наших руках.
Подраздел «TYPE7 не проявляет токсичности и связывается с клетками в зависимости от pH»: определение MTS.
Химическое название соединения MTS было добавлено в подраздел «Материалы и методы» «Анализ пролиферации клеток (MTS)».
Подраздел «TYPE7 взаимодействует с EphA2», первый абзац: Каковы доказательства на рисунке 1D, что часть TYPE7 уже находится в состоянии TM при pH 7? Также может быть полезно указать где-нибудь в этом абзаце, что TM-EphA2 был в 4-кратном молярном превышении по сравнению с TYPT7 в этих экспериментах (согласно разделу «Материалы и методы»).
В тексте сказано, что «часть TYPE7 уже находится в состоянии TM при нейтральном pH», что основано на Рисунке 1D в присутствии TM-EphA2 (оранжевые символы), показывая, что при pH 7 мы находимся за пределами плато с высоким pH. (периферическое состояние), и уже в пределах сигмоидального перехода, где формируется α-спираль. Это обсуждалось в первом абзаце подраздела «Анализ пролиферации клеток (MTS)». Чтобы уточнить, что здесь мы имеем в виду наличие α-спирали, а не то, что это доминирующий вид, мы изменили текст, заменив «дробь» на «значительную долю».Кроме того, мы представили в основном тексте наличие молярного избытка TM-EphA2 (TMJM546-EphA2) по сравнению с TYPE7, как предложил рецензент.
Предложение «Инкубация с EA1 повторяет трансактивацию EphA2 мембранными кластерами ephrinA1» требует ссылки на литературу.
Добавлена соответствующая ссылка (подраздел «Анализ пролиферации клеток (MTS)», последний абзац).
Кажется, есть некоторая путаница в определении JMS и других частей (киназного домена) ICD.В первом абзаце подраздела «TYPE7 взаимодействует с EphA2», JMS, по-видимому, определяется как несколько соседних с TMS остатков, которые непосредственно примыкают к поверхности мембраны, что является общим определением для многих других однопролетных мембранных белков. Однако во втором абзаце подраздела «TYPE7 ингибирует миграцию клеток за счет специфического фосфорилирования EphA2 по Y772» авторы, по-видимому, включают гораздо больше остатков, включая все три сайта фосфорилирования, которые находятся на расстоянии 30 остатков от TMS в своем определении JMS.Пожалуйста, сделайте определения последовательными.
Мы уточнили, что TM-EphA2 содержит подмножество N-концевой области более длинного JMS (подраздел «Анализ пролиферации клеток (MTS)», первый абзац. Фактически, чтобы прояснить этот момент, мы решили переименовать TM- EphA2 для его распознавания включает остатки JM. Новое название TM-EphA2 — TMJM 563 -EphA2, что указывает на то, что включает последовательность JM до остатка 563. Имя было обновлено во всей рукописи.
Рисунок 4: A) Слишком мал, чтобы увидеть кластеры vs.нет кластеров, которые авторы хотели бы выделить. B) Возможно, синяя кривая FCS представляет более одного рассеивающего компонента? Его форма явно отличается от двух других. E) Верно, что связывание TYPE7 снижает диффузию миристилированного рецептора, как это было с нативным рецептором (подраздел «TYPE7 способствует ограниченной самосборке EphA2», последний абзац), но все коэффициенты диффузии намного выше в липидно-заякоренных. по сравнению со случаями, привязанными к белку. Т.е. масштаб отличается в E vs.C и D. Ничего плохого в этом нет, но стоит упомянуть.
A) Добавлены новые вставки, выделяющие кластеры (рисунок 4A, легенда рисунка 4A).
B) Рецензент прав, указывая, что наши эксперименты с FCS не позволяют исключить наличие более чем одного диффундирующего компонента. Однако данные хорошо соответствуют одному релаксационному члену (уравнение 5), что позволяет предположить, что используемое нами приближение, которое заключается в сравнении средних значений для соответствия одного компонента, является разумным.Мы ввели эту важную квалификацию во втором абзаце подраздела «TYPE7 способствует ограниченной самосборке EphA2».
E) Теперь мы обсудим увеличенное значение D для миристоилированной конструкции в последнем абзаце подраздела «TYPE7 способствует ограниченной самосборке EphA2».
Математическая модель: имеет ли стохастическая модель шкалу реального времени, такую как минуты, показанные на всех модельных рисунках, или она не имеет произвольных временных шагов, и поэтому, если шкалу времени на этих рисунках не лучше называть произвольный? Конечно, это не мешает моделированию, но не привязывает цифры напрямую к реальной экспериментальной временной шкале, которая может сильно отличаться.
Модель, изображенная на дополнительном рисунке 11A, также требует дополнительных пояснений. Кажется, что существует 3 разных типа k (I), (включен и выключен) и 2 разных типа k (A), (включен и выключен), как показано на разных панелях. Или все они ограничены одними и теми же соответствующими значениями в модели? Итак, сколько параметров свободной подгонки присутствует в модели? Уточнение этого момента важно для лучшего понимания основного текста.