Смолов призвал освободить Кокорина и Мамаева из-под стражи
https://rsport.ria.ru/20190130/1550161462.html
Смолов призвал освободить Кокорина и Мамаева из-под стражи
Смолов призвал освободить Кокорина и Мамаева из-под стражи — РИА Новости Спорт, 02.09.2019
Смолов призвал освободить Кокорина и Мамаева из-под стражи
Нападающий «Локомотива» и сборной России Федор Смолов опубликовал в своем аккаунте в Instagram пост в поддержку футболистов Александра Кокорина и Павла Мамаева. РИА Новости Спорт, 02.09.2019
2019-01-30T22:51
2019-01-30T22:51
2019-09-02T15:16
футбол
александр кокорин
павел мамаев
скандал с кокориным и мамаевым
/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content
/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content
https://cdnn21.img.ria.ru/images/rsport/111951/80/1119518022_0:0:2884:1623_1920x0_80_0_0_058e6153548e607631c71cac4a2d5a08.jpg
МОСКВА, 30 янв — РИА Новости. Нападающий «Локомотива» и сборной России Федор Смолов опубликовал в своем аккаунте в Instagram пост в поддержку футболистов Александра Кокорина и Павла Мамаева. Смолов опубликовал фото обоих фигурантов скандального дела, сопроводив пост хэштэгами «Свободу Мамаеву» и «Свободу Кокорину».Ранее Смолов в интервью Ксении Собчак рассказал, что Кокорин и Мамаев должны понести наказание, но счел содержание под стражей на протяжении четырех месяцев слишком суровым.Мамаев, Кокорин, его младший брат Кирилл и играющий в любительской лиге Александр Протасовицкий 8 октября 2018 года стали участниками двух конфликтов в центре Москвы. Первый произошел, по данным следствия, около 08:30 мск, когда несколько мужчин у гостиницы «Пекин» напали на водителя одной из ведущих Первого канала Виталия Соловчука, избили его, а также разбили стекло и повредили заднюю дверь машины.Позже компания переместилась в кафе на Большой Никитской улице, где ими был избит глава департамента Минпромторга Денис Пак. Попытавшийся успокоить молодых людей гендиректор НАМИ (разработчик президентских автомобилей Aurus) Сергей Гайсин также получил от одного из них удар по лицу.Тверской суд Москвы 5 декабря на два месяца продлил арест Кокорина и Мамаева.
Уголовное дело возбуждено по статьям «хулиганство в составе группы лиц» и «побои». Санкция только статьи «хулиганство» предполагает до семи лет заключения. Срок содержания под стражей истекает 8 февраля.
https://rsport.ria.ru/20190128/1550016425.html
https://rsport.ria.ru/20190130/1550147855.html
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
2019
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
Новости
ru-RU
https://rsport.ria.ru/docs/about/copyright.html
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
https://cdnn21.img.ria.ru/images/rsport/111951/80/1119518022_0:0:2732:2048_1920x0_80_0_0_1f6bbeba8a2f1b25bbc3d9c5bff06d35.
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
александр кокорин, павел мамаев, скандал с кокориным и мамаевым
МОСКВА, 30 янв — РИА Новости. Нападающий «Локомотива» и сборной России Федор Смолов опубликовал в своем аккаунте в Instagram пост в поддержку футболистов Александра Кокорина и Павла Мамаева.
Смолов опубликовал фото обоих фигурантов скандального дела, сопроводив пост хэштэгами «Свободу Мамаеву» и «Свободу Кокорину».
Ранее Смолов в интервью Ксении Собчак рассказал, что Кокорин и Мамаев должны понести наказание, но счел содержание под стражей на протяжении четырех месяцев слишком суровым.
Мамаев, Кокорин, его младший брат Кирилл и играющий в любительской лиге Александр Протасовицкий 8 октября 2018 года стали участниками двух конфликтов в центре Москвы. Первый произошел, по данным следствия, около 08:30 мск, когда несколько мужчин у гостиницы «Пекин» напали на водителя одной из ведущих Первого канала Виталия Соловчука, избили его, а также разбили стекло и повредили заднюю дверь машины.
28 января 2019, 13:56
Смолов рассказал, почему Кокорин и Мамаев должны понести наказаниеПозже компания переместилась в кафе на Большой Никитской улице, где ими был избит глава департамента Минпромторга Денис Пак. Попытавшийся успокоить молодых людей гендиректор НАМИ (разработчик президентских автомобилей Aurus) Сергей Гайсин также получил от одного из них удар по лицу.
Тверской суд Москвы 5 декабря на два месяца продлил арест Кокорина и Мамаева. Уголовное дело возбуждено по статьям «хулиганство в составе группы лиц» и «побои». Санкция только статьи «хулиганство» предполагает до семи лет заключения. Срок содержания под стражей истекает 8 февраля.
30 января 2019, 17:22ФутболДзюба, Жирков и Тарасов поддержали Александра Кокорина«Они все осознали».

https://rsport.ria.ru/20181214/1547973785.html
«Они все осознали». Смолов, Дзагоев и Джикия поддержали Кокорина и Мамаева
«Они все осознали». Смолов, Дзагоев и Джикия поддержали Кокорина и Мамаева — РИА Новости Спорт, 03.09.2019
«Они все осознали». Смолов, Дзагоев и Джикия поддержали Кокорина и Мамаева
Полузащитник «Крыльев Советов» Алан Чочиев выложил на странице в Instagram видеообращения футболистов в поддержку Александра Кокорина и Павла Мамаева, которые… РИА Новости Спорт, 03.09.2019
2018-12-14T10:59
2018-12-14T10:59
2019-09-03T15:04
футбол
алан дзагоев
александр кокорин
дмитрий тарасов
александр самедов
павел мамаев
владимир габулов
дмитрий тарасов
/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content
/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content
https://cdnn21.img.ria.ru/images/rsport/112852/96/1128529635_0:0:1596:899_1920x0_80_0_0_240f0b80c34c5fdf0b97aa31504803d0. jpg
МОСКВА, 14 дек — РИА Новости. Полузащитник «Крыльев Советов» Алан Чочиев выложил на странице в Instagram видеообращения футболистов в поддержку Александра Кокорина и Павла Мамаева, которые находятся в СИЗО за нанесение побоев и хулиганство.Слова поддержки выразил нападающий «Локомотива» Федор Смолов. Он заявил, что Кокорина и Мамаева «не хватает на футбольном поле». Футболист пожелал им терпения и спокойствия. К Кокорину и Мамаеву обратился и защитник «Спартака» Георгий Джикия. Он пожелал им и близким футболистов терпения и сил.Полузащитник «Спартака» Александр Самедов пожелал Кокорину и Мамаеву удачи и сил. Он выразил уверенность в том, что «все скоро наладится».Две потасовкиДве драки с участием Кокорина и Мамаева произошли 8 октября. Как считают следователи, обвиняемые сначала избили водителя одной из ведущих Первого канала Виталия Соловчука. Затем в кафе — главу департамента Минпромторга Дениса Пака и руководителя НАМИ (разработчик президентских автомобилей Aurus) Сергея Гайсина. Футболисты явились в полицию только два дня спустя после того, как следствие пригрозило объявить их в розыск.Фигурантов дела поместили в изолятор, затем арестовали.Возбуждено уголовное дело по статьям «Хулиганство в составе группы лиц» и «Побои». Александра Кокорина, Павла Мамаева и Александра Протасовицкого обвиняют в двух эпизодах побоев и одном эпизоде хулиганства. Кирилла Кокорина обвиняют в трех эпизодах побоев и одном — хулиганства.Обвиняемые извинились за свои действия и заявили о раскаянии. Выяснилось, что Денис Пак не имеет претензий к Мамаеву, так как тот не совершал в отношении чиновника противоправных действий. В ноябре стало известно, что со стороны Мамаева выплатили компенсацию Соловчуку.
https://rsport.ria.ru/20181205/1146978200.html
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
2018
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og. xn--p1ai/awards/
Новости
ru-RU
https://rsport.ria.ru/docs/about/copyright.html
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
https://cdnn21.img.ria.ru/images/rsport/112852/96/1128529635_0:0:1596:1197_1920x0_80_0_0_1c99597b3a387454d552ccaf6d3f92af.jpgРИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
РИА Новости Спорт
7 495 645-6601
ФГУП МИА «Россия сегодня»
https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/
алан дзагоев, александр кокорин, дмитрий тарасов, александр самедов, павел мамаев, владимир габулов, дмитрий тарасов
МОСКВА, 14 дек — РИА Новости. Полузащитник «Крыльев Советов» Алан Чочиев выложил на странице в Instagram видеообращения футболистов в поддержку Александра Кокорина и Павла Мамаева, которые находятся в СИЗО за нанесение побоев и хулиганство.
Хочу выразить свою поддержку ребятам. Эта ситуация их не красит, так делать нельзя. Хочу извиниться от своего имени, от лица Дмитрия Тарасова, перед теми людьми, которые пострадали в ту ночь и утро. Хочу извиниться за ребят, потому что я их хорошо знаю. Прошу дать ребятам шанс исправиться и вернуться в спорт, не сажать их.
Дмитрий Тарасов
защитник ФК «Локомотив»Слова поддержки выразил нападающий «Локомотива» Федор Смолов. Он заявил, что Кокорина и Мамаева «не хватает на футбольном поле». Футболист пожелал им терпения и спокойствия.
Хочу выразить свою поддержку Саше и Паше. Разочарован всей этой ситуацией и тем, что ребята до сих пор находятся в заключении. Да, наказание должно быть, и они его уже понесли. Я думаю, они уже все осознали. Хочется увидеть в их деле справедливость, которая заключается в том, чтобы ребята вышли на свободу и имели возможность играть в футбол.
Алан Дзагоев
полузащитник ПФК ЦСКАК Кокорину и Мамаеву обратился и защитник «Спартака» Георгий Джикия. Он пожелал им и близким футболистов терпения и сил.
Кокора, брат, держись. Все мы рядом — те, кто знает, какой ты на самом деле добрый и искренний человек. Кто из нас не ошибается в жизни? Каждый совершал и еще будет совершать ошибки. Надеюсь, эта ситуация в скором времени разрешится и ты займешься своим любимым делом. А мы всегда будем рядом. Держись, брат.
Владимир Габулов
министр спорта Северной Осетии, экс-вратарь московского «Динамо»Полузащитник «Спартака» Александр Самедов пожелал Кокорину и Мамаеву удачи и сил. Он выразил уверенность в том, что «все скоро наладится».
Две потасовки
Две драки с участием Кокорина и Мамаева произошли 8 октября. Как считают следователи, обвиняемые сначала избили водителя одной из ведущих Первого канала Виталия Соловчука. Затем в кафе — главу департамента Минпромторга Дениса Пака и руководителя НАМИ (разработчик президентских автомобилей Aurus) Сергея Гайсина.
Футболисты явились в полицию только два дня спустя после того, как следствие пригрозило объявить их в розыск.
Фигурантов дела поместили в изолятор, затем арестовали.
5 декабря 2018, 19:30ФутболКокорин и Мамаев встретят Новый год в СИЗОВозбуждено уголовное дело по статьям «Хулиганство в составе группы лиц» и «Побои». Александра Кокорина, Павла Мамаева и Александра Протасовицкого обвиняют в двух эпизодах побоев и одном эпизоде хулиганства. Кирилла Кокорина обвиняют в трех эпизодах побоев и одном — хулиганства.
Обвиняемые извинились за свои действия и заявили о раскаянии. Выяснилось, что Денис Пак не имеет претензий к Мамаеву, так как тот не совершал в отношении чиновника противоправных действий. В ноябре стало известно, что со стороны Мамаева выплатили компенсацию Соловчуку.
Смолов и Мамаев сыграли в Кройфа
Футболисты «Краснодара» Павел Мамаев и Федор Смолов в матче 2-го тура РОСГОССТРАХ чемпионата России против «Терека» (4:0) порадовали болельщиков эффектным представлением. Игроки сборной России решили разыграть пенальти, что не запрещается правилами футбола – бьющий пенальти имеет право делать пас партнеру, а не наносить удар по воротам. Главными условиями здесь является то, что нельзя пасовать назад, а также должен быть соблюден весь регламент выполнения 11-метрового, то есть, игроки не должны вбегать в штрафную до касания мяча.
В итоге, вместо обычного удара по воротам «Терека» Павел Мамаев сделал короткое касание влево и это явно ждал Федор Смолов, успевший поразить ворота голкипера гостей, прежде чем его накрыли защитники. Так Павел Мамаев одновременно стал автором незабитого пенальти и голевой передачи.
– Видимо, ребята тренировали этот момент. Непроста такой розыгрыш, это домашняя заготовка. Я не видел, чтобы они разыгрывали пенальти на тренировках. Наверное, делали это после тренировок. Удачно всё сложилось. Думаю, болельщикам понравилось. Мы их поздравили, – рассказал полузащитник «Краснодара» и один из кандидатов в сборную России Юрий Газинский.
Розыгрыш пенальти в исполнении Мамаева и Смолова – далеко не первый в истории мирового футбола. Первооткрывателями считаются бельгийцы Рик Коппенс и Андре Петерс, решившие разыграть пенальти в отборочном матче чемпионата мира 1958 года против Исландии. Классический случай розыгрыша 11-метрового случился в матче «Аякс» – «Хелмонд Спорт» зимой 1982 года. Тогда знаменитый Йохан Кройф разыграл одиннадцатиметровый с Йеспером Ольсону и закатил мяч в пустые ворота.
Последним же примером отлично разыгранного пенальти стал эпизод из матча «Барселоны» в прошлом сезоне чемпионата Испании, когда в игре с «Сельтой»(6-1) аргентинец Лионель Месси отпасовал уругвайцу Луису Суаресу.
Случались и неудачные попытки. В 2005 году игроки «Арсенала» Роберт Пирес и Тьерри Анри попытались разыграть пенальти в матче против «Манчестер Сити», однако французские игроки лондонской команды не синхронизировали свои действия и момент для гола был упущен.
Любопытно, что все эти случаи розыгрыша случались в тот момент, когда зарабатывающая 11-метровый удар команда ведет в счете. Если же неопределенность результата присутствует, то при реализации пенальти футболисты предпочитают идти обычным путем.
«Краснодар» – «Терек» (Грозный) – 4:0 (1:0)
Судьи: Сельдяков (Балашиха). Абусуев (Санкт-Петербург), Демешко (Химки).
«Краснодар»: Крицюк, Енджейчик, Гранквист, Сигурдссон, Петров, Каборе, Газинский (Торбинский, 78), Перейра (Ахмедов, 69), Ари (Вандерсон, 80), Смолов, Мамаев.
«Терек»: Городов, Уциев, Родолфу, Семенов, Плиев, Торже (Лебеденко, 58), Пирис, Кузяев, Иванов, Грозав, Балай (Мбенг, 58).
Предупреждения: Каборе, 38. Ари, 39. Родолфу, 72. Гранквист, 73. Семенов, 76.
Голы: Смолов, 34 (1:0). Ари, 54 (2:0). Смолов, 77 (3:0). Вандерсон, 88 (4:0).
Нереализованный пенальти: Мамаев (Краснодар), 77.
8 августа. Краснодар. Стадион «Кубань».
Другие результаты 2 тура:
«Уфа» – «Зенит» (Санкт-Петербург) – 0:0
Судьи: Мешков (Дмитров). Миневич (Смоленск), Богач (Люберцы).
«Уфа»: Шелия, Живоглядов, Васин, Никитин, Аликин, Обляков (Диегу, 89), Ванек (Засеев, 76), Безденежных, Стоцкий, Игбун, Кротов (Абдулавов, 61).
«Зенит»: Лодыгин, Смольников, Нету, Кришито, Жирков, Хави Гарсия, Маурисиу (Юсупов, 75), Витсель, Шатов, Кокорин (А.Кержаков, 78), Джорджевич (Мак, 64).
Предупреждения: Кокорин, 52. Аликин, 71. Кришито, 79. Нету, 87. Витсель, 90.
6 августа. Уфа. Стадион «Нефтяник».
Арсенал» (Тула) – «Рубин» (Казань) – 1:0 (1:0)
Судьи: Турбин, Болотенков, Кобзев (все – Москва).
«Рубин»: Рыжиков, Устинов, Серхио Санчес, Бурлак, Набиуллин (Ткачук, 80), Самуэль Гарсия (Жемалетдинов, 67), Цакташ, Оздоев, Рочина (Девич, 53), Гекдениз, Жонатас.
Предупреждения: Серхио Санчес, 39. Шевченко, 77. Бурлак, 87. Герус, 90+4.
Гол: Шевченко, 21.
6 августа.Тула. Стадион «Арсенал».
«Оренбург» – ЦСКА – 0:1 (0:0)
Судьи: Егоров (Саранск), Суховерхов (Воронеж), Стипиди (Краснодар).
«Оренбург»: Гутор, Кацалапов, Малых, Андреев, Ойеволе, Бамба, Афонин, Померко, Воробьев (Делькин, 86), Ефремов, Саная (Прудников, 74).
ЦСКА: Акинфеев, Мариу Фернандес, В.Березуцкий, Игнашевич, Щенников (Миланов, 81), Тошич (Натхо, 68), Вернблум, Еременко, Дзагоев, Головин (Ионов, 59), Траоре.
Предупреждения: Воробьев, 83. Игнашевич, 90+1.
Гол: Еременко, 84.
7 августа. Оренбург. Стадион «Газовик».
«Амкар» (Пермь) – «Анжи» (Махачкала) – 2:0 (1:0)
Судьи: Безбородов (Санкт-Петербург), Гаврилин (Владимир), Данченко (Уфа).
«Амкар»: Селихов, Гиголаев, Зайцев, Джикия, Занев, Комолов (Шаваев, 88), Гол, Огуде, Идову, Анене (Баланович, 62), Шиндер (Йовичич, 79).
«Анжи»: Беленов, Гаджибеков (Мусалов, 79), Жиров, Лазич, Тигиев, Газимагомедов (Эбесилио, 46), Гасанов, Маевский, Георгиевский (Боли, 63), Бериша, Будковский.
Предупреждения: Жиров, 17. Лазич, 38. Гол, 57. Мусалов, 81. Зайцев, 89.
Удаление: Жиров, 65.
Голы: Анене, 31 (1:0). Зайцев, 88 (2:0).
7 августа. Пермь. Стадион «Звезда».
«Локомотив» (Москва) – «Томь» (Томск) – 2:2 (2:0)
Судьи: Иванов (Ростов-на-Дону). Болховитин (Ленинградская область), Семенов (Гатчина).
«Локомотив»: Гильерме, Шишкин, Пейчинович, Михалик, Денисов, Самедов, Ндинга, Коломейцев, Миранчук, Касаев (Игнатьев, 72), Шкулетич (Хенти, 71).
«Томь»: Коченков, Яблонский, Пульич, Дьяков, Бордачев, Попов (Кудряшов, 64), Тишкин (Касьян, 79), Бикфалви, Голышев (Баляйкин, 65), Пугин, Самодин.
Предупреждения: Яблонский, 12. Тишкин, 22. Самодин, 72. Баляйкин, 87.
Голы: Шкулетич, 13 – с пенальти (1:0). Самедов, 33 – с пенальти (2:0). Бикфалви, 76 (2:1). Пугин, 85 (2:2).
7 августа. Москва. Стадион «Локомотив».
«Ростов» (Ростов-на-Дону) – «Урал» (Екатеринбург) – 0:0
Судьи: Федотов, Деушев, Сафьян (все Москва).
«Ростов»: Джанаев, Терентьев, Новосельцев, Сесар Навас, Баштуш, Кудряшов, Калачев (Эззатоллахи, 79), Нобоа, Гацкан, Азмун, Бухаров (Ерохин, 68).
«Урал»: Заболотный, Кулаков, Новиков, Фонтанелло, Динга, Данцев, Коробов (Чантурия, 75), Фидлер, Емельянов, Лунгу (Ставпец, 82), Павлюченко.
Предупреждения: Гацкан, 25. Фидлер, 25. Павлюченко, 25. Бухаров, 45+2. Емельянов, 57. Фонтанелло, 66.
Удаление: Азмун , 23.
7 августа. Ростов-на-Дону. Стадион «Олимп-2».
«Спартак» (Москва) – «Крылья Советов» (Самара) – 1:0 (0:0)
Судьи: Вилков (Нижний Новгород), Веретешкин, Лебедев (оба Санкт-Петербург).
«Спартак»: Ребров, Ещенко, Таски, Кутепов, Боккетти, Комбаров, Фернанду, Глушаков, Зобнин (Попов, 61), Зе Луиш (Мельгарехо, 68), Промес (Ромулу, 81).
«Крылья Советов»: Лория, Цаллагов, Таранов, Концедалов, Надсон, Ятченко (Божин, 81), Чочиев (Корниленко, 86), Башкиров, Ткачев (Брюно, 75), Родич, Яхович.
Предупреждение: Фернанду, 71.
Гол: Ещенко, 70.
8 августа. Москва. Стадион «Открытие Арена».
Тинькофф чемпионат России по футболу (РПЛ)
Тинькофф чемпионат России по футболу (РПЛ) | Мамаев и Смолов разыграли пенальти в стиле Йохана Кройфа (ВИДЕО).
-
Фото:
sports.ru
Читайте Спорт день за днём в
Игроки «Краснодара» Павел Мамаев и Федор Смолов в победном матче чемпионата России против «Терека» (4:0) повторили знаменитый розыгрыш пенальти в исполнении легендарного игрока Аякса Йохана Кройфа. На 77-й минуте в ворота грозненцев был назначен пенальти, который взялся исполнять Павел Мамаев. Но вместо удара он предпочел катнуть мяч на Смолова, который поразил пустой угол ворот голкипера Городова.
Точно выйти?
Да Нет
Восстановление пароля
Используя данный сайт, вы даете согласие на использование файлов cookie,
данных об IP-адресе и местоположении, помогающих нам сделать его удобнее для вас. Подробнее
Голевые мемы: что может дать Смолов «Динамо» и уйдет ли Дзюба | Статьи
За новогодние праздники в Российской премьер-лиге (РПЛ) появилось множество интересных новостей о возможных громких трансферах. Форвард сборной России Федор Смолов почти сменил «Локомотив» на «Динамо», Артем Дзюба хочет к Леониду Слуцкому в Казань, а Павел Мамаев и Александр Кокорин могут воссоединится в «Химках». Зимнее трансферное окно в российской премьер-лиге закроется только 22 февраля. Рестарт чемпионата после паузы — 26 февраля.
Смолов в «Динамо»Пожалуй, главное возвращение зимнего трансферного окна — переход Федора Смолова в «Динамо». Нападающий в ближайшие дни должен присоединиться к команде и поехать на зимние сборы. «Локомотив» хочет избавиться от большой группы высокооплачиваемых игроков, и Смолов не входил в планы нового руководства. У Федора даже были варианты поиграть в американской МЛС, но форвард выбрал хорошо знакомое «Динамо». С 2006 по 2015 год права на игрока принадлежали московскому клубу, где Смолов забил три гола в 68 матчах.
Если сделка пройдет успешно и все детали урегулируют, Смолов может всерьез усилить одного из лидеров РПЛ, которому как раз не помешает опытный форвард.
— Очевидно, что Федор хочет играть, сейчас именно футбол для него на первом месте, — отметил в беседе с «Известиями» экс-капитан «Динамо» Александр Точилин — Это правильная мотивация. Сандро Шварц пропагандирует агрессивный, энергозатратный, мобильный футбол, и насколько Смолов будет соответствовать этому требованию, надо смотреть. Если у него получится, то и для бело-голубых, и для сборной это будет большим плюсом.
Артем Дзюба летом станет свободным агентом, но не хочет еще полгода сидеть в запасе «Зенита» и может покинуть команду зимой. Сергей Семак по-прежнему не видит его в качестве основного игрока, даже если Сердар Азмун все-таки уедет в Европу. А 10 января питерский клуб объявил о подписании форварда «Крыльев Советов» Ивана Сергеева, а это значит, что Дзюбе опять придется сидеть на скамейке.
Главный претендент на форварда — «Рубин» Леонида Слуцкого, с которым Артем работал в сборной России. По данным «Спорт-Экспресса», летом на корпоративе в честь юбилея тренера Дзюба открыто заявил, что хочет поработать со Слуцким в клубе. Кажется, это вполне реально. В Казани Артему придется пойти на понижение зарплаты до €1,5–2 млн, зато в казанском клубе он будет главной примой, как и привык.
Ямаец в «Спартаке», друг Холанда в «Краснодаре»«Спартак» под конец 2021-го года подписал лучшего футболиста Ямайки — форварда Шамара Николсона. Нападающий выступал за бельгийский «Шарлеруа», где забил 31 гол в 83 матчах. В московском клубе считают, что игрок станет кошмаром для защитников РПЛ и анонсировали его трансфер в стилизации постера из хоррора «Сияние» с актером Джеком Николсоном.
В этом сезоне в чемпионате Бельгии Шамар забил 11 голов в 17 матчах. Новый тренер «Спартака» Паоло Ваноли наверняка ждет от форварда такой же результативности в России.
Громкий трансфер «Краснодара», который в последний год активно тратит на подписания новичков — Эрик Бутхейм из «Буде-Глимт». 22-летний норвежец обошелся «быкам» в €8–10 млн в зависимости от бонусов. Он забил 15 голов в 30 матчах чемпионата Норвегии и в Лиге конференций, а еще поучаствовал в пяти из шести голов «Буде-Глимт» в матче с «Ромой». Именно после той встречи к форварду и начали проявлять серьезный интерес европейские клубы.
В Норвегии Бутхейма называли вторым Эрлингом Холандом, с которым новичок «Краснодара» близко дружит. После переезда в Россию звезда «Боруссии» обратился к клубу Сергея Галицкого в Instagram. «Поздравляю, Эрик! Береги его, «Краснодар», — написал норвежец.
Самый резнонасный трансфер зимы — переход украинского защитника «Шахтера» Марка Мампасси в «Локомотив». 18-летний игрок не провел ни одного матча за донецкий клуб, выступая в аренде в «Мариуполе», но привлек внимание российского клуба. За защитника «Локо» заплатил около €4 млн, а сам игрок подписал контракт на пять лет. В соцсетях Марка атаковали хейтеры и упрекнули в том, что он поехал из Украины именно в российский клуб. Обвинили и в продажности, и в измене родине и даже в сепаратизме. Как 18-летний игрок справится с таким давлением, покажет весенняя часть сезона.
— Мне очень любопытно то, что происходит в «Локомотиве», но логику решений я не очень понимаю, — сказал «Известиям» бывший президент московского клуба Илья Геркус. — Наблюдаю с огромным интересом. Смена гражданства Мампасси? Насколько я понимаю, он заигран только за молодежку — есть возможность поменять футбольное гражданство. Но надо быть уверенным, что он дорастет до уровня нашей сборной. У той же Украины есть Забарный в сборной, на подходе Попов и Бондарь из молодежи. Сильная конкуренция.
Мамаев и Кокорин в «Химках»«Спартак» расстался с Александром Ломовицким, который так и не смог закрепиться в составе красно-белых. Теперь раскрыть потенциал игрока попытается Леонид Слуцкий, который собирается сделать из него левого защитника. В этом сезоне Ломовицкий уже играл защитника при Руе Витории в «Спартаке», а сейчас будет выступать на этой позиции в Казани, но при схеме в два центральных. Куда Слуцкий поставит Самошникова, что будет с другими фланговыми защитниками — Зотовым, Игнатьевым и Зуевым — пока не совсем понятно.
За трансфер Ломовицкого «Рубин» заплатит €1,5 млн, при этом казанцы продали воспитанника Данила Степанова в «Арсенал», который проводит неплохой сезон. Правильное ли это было решение — покажет вторая часть сезона.
Перед новым годом Павел Мамаев покинул «Ростов» и подписал контракт до конца сезона с «Химками». Игрок давно хотел перебраться ближе к столице и попытается реанимировать карьеру в подмосковном клубе. 33-летний Мамаев пришел в «Химки» не без участия лидера команды Дениса Глушакова, который участвовал в переговорах. Теперь клуб хочет провернуть еще два громких трансфера возрастных футболистов: вернуть из Италии Александра Кокорина и подписать Юрия Жиркова.
— Мне жаль, что у Кокорина совсем не получилось в Италии, — сказал «Известиям» призер чемпионата мира Анзор Кавазашвили. — У него огромный талант, поэтому если есть возможность вернуться в Россию, то надо ею пользоваться. В РПЛ он способен дать результат многим командам.
Кокорин толком не успел поиграть в «Фиорентине» (4 матча в Серии А) из-за травм и восстановлений, а 38-летний Жирков летом ушел из «Зенита» и до сих пор без команды. По слухам, он выбирает между «Химками» и «Нижним Новгородом», куда его зовет бывший партнер по сборной Александр Кержаков.
Трансферы зима 2021-2022: Буффон в «Спартаке», Мамаев перешел в «Химки», Миранчук заинтересовал «Дженоа», Смолов может переехать в MLS — 20 декабря 2021
Что в России
Мамаев перешел в «Химки»
Член наблюдательного совета «Химок» Роман Терюшков подтвердил информацию о том, что полузащитник «Ростова» Павел Мамаев заключил соглашение с подмосковным клубом. «Да, он сегодня подписал контракт. Но срок контрактного соглашения мы не разглашаем», — заявил Терюшков.
Отметим, что Мамаев в нынешнем сезоне РПЛ сыграл в составе «Ростова» шесть матчей, в которых не отметился результативными действиями.
Арсен Адамов — в «Локомотиве»
Хайдар Алханов — дедушка правого защитника «Урала» Арсена Адамова — сообщил, что его внук близок к переходу в «Локомотив». «Все очень близко. Арсен дал добро на переезд в Москву. Единственное, о чем осталось договориться — по сумме выкупа трансфера. И «Урал», и «Локомотив» уже приняли решение о трансфере. Все скоро должно решиться. Можно сказать, что трансфер Адамова в «Локомотив» почти завершен. Арсен очень хочет играть за «Локомотив».
Я очень горжусь за него, в детстве я ему много помогал. Он, если так можно сказать, глотал всю информацию. Он большой молодец», — заявил Алханов.
Буффон — второй Терри для «Спартака»?
Необычный слух из Италии: сайт Serie B News пишет, что легендарный вратарь Джанлуиджи Буффон, который сейчас выступает за «Парму», мог бы (формулировка именно такая — «мог бы»!) продолжить карьеру в «Спартаке».
«Новый тренер красно-белых Паоло Ваноли мог бы позвонить Буффону, чтобы соблазнить его захватывающим приключением за границей. Однако это вряд ли будет реализовано на практике, учитывая сильную связь Буффона с «Пармой» и тот факт, что его контракт истекает 30 июня 2023 года», — говорится в публикации.
Ваноли и Буффон вместе играли за «Парму».
Что ж: сами придумали новость — сами ее опровергли. Зато у этой трансферной подборки появился громкий заголовок — спасибо итальянским журналистам.
Смолов может уехать в Америку
Следующим клубом Федора, чей контракт с «Локомотивом» истекает в июне 2022 года, может стать одна из команд MLS. Об этом рассказал журналист Павел Городницкий в своем ютуб-блоге. «15 декабря номинальный агент Смолова Михаил Данилюк заключил договор с Дэном Мильштейном о том, что до мая 2022 года Мильштейн представляет интересы компании Pro Sports Management и может от ее лица вести переговоры. С кем? Естественно, с клубами MLS, потому что Дэн обычно занимается перетаскиванием российских хоккеистов в НХЛ.
Здесь же нужно отправить российского футболиста в MLS. Какие клубы? «Нэшвилл», «Орландо», «Чикаго», «Остин», «Даллас» и некоторые другие. Так что Федя Смолов реально собрался в Америку, и я думаю, что «Локомотив» не будет скучать. Ну а фанаты — тем более», — отметил Городницкий.
Что в Европе
«Ливерпуль» не будет покупать игроков без вакцины
Об этом заявил главный тренер 19-кратных чемпионов Англии Юрген Клопп. «Вакцинация будет иметь значение, определенно. Если игрок вообще не вакцинирован, он представляет угрозу для всех нас. Он, конечно, не хочет быть угрозой. И это совсем не значит, что он думает: «Боже мой, мне плевать на остальных». Но он все же представляет угрозу.
Поэтому мы должны найти разные варианты. Ему нужно переодеваться в отдельной раздевалке, он должен есть в другой столовой, он должен сесть в другой автобус, он должен ехать на другой машине. С организационной точки зрения это настоящий бардак. Мы не собираемся строить дополнительные здания для невакцинированных игроков. Надеюсь, до этого не дойдет», — сказал немец.
«Аталанта» назвала цену на Миранчука
Алексей Миранчук, который никак не может пробиться в основной состав «Аталанты», попал в сферу интересов «Дженоа», где с ноября главным тренером работает Андрей Шевченко. Газета Il Secolo XIX пишет, что генуэзцев может отпугнуть сумма, которую бергамаски просят за россиянина, — 16 миллионов евро. Если «Аталанта» откажется снижать цену, то «Дженоа» подпишет вместо Миранчука полузащитника «Милана» Самуэля Кастильехо.
Дом-2. Новости / Кокорина и Мамаева посадили на два месяца. Реакция общественности
Александр Кокорин и Павел Мамаев
Фото: «Инстаграм»
Тверской суд Москвы вынес приговор Александру Кокорину и Павлу Мамаеву. Футболистов сначала арестовали на 48 часов, а затем продлили этот срок на два месяца — до 8 декабря 2018 года. В ходе заседания скандальные игроки «Зенита» и «Краснодара» рассказали, как всё было на самом деле, и что они чувствуют после произошедшего.
«По пьяни мы начали сравнивать соседа по столу с исполнителем Gangam Style, он обиделся и обматерил нас. Я вел себя недопустимо, я сделаю все, чтобы заслужить прощение и загладить вину. Прошу не лишать меня свободы», — пояснил Кокорин.
Александр также отметил, что грубое обращение Дениса Пака к ним и спровоцировало их драку — именно из-за этого футболист потянулся за стулом и ударил его по голове. Вместе с Александром отбывать наказание будет его младший брат Кирилл, который тоже участвовал в драке, а также Павел Мамаев.
Кокорина вместе с младшим братом арестовали до 8 декабря
Фото: «Инстаграм»
«Я не собираюсь скрываться, готов помогать следствию, готов сдать загранпаспорта. Я хочу публично извиниться перед пострадавшими, я не имел права себе этого позволять, я готов загладить весь моральный и материальный ущерб, хочу, чтобы это донесли до пострадавших», — сказал игрок ФК «Краснодар» Мамаев.
Мамаев раскаялся в содеяннос
Фото: Соцсети
Мнение общественности разделилось на два лагеря: одни сочли такое наказание слишком строгим, другие же, напротив, посчитали его недостаточным для осмысления всего ужаса произошедшего. Так, футболист Фёдор Смолов, который в последнее время всё чаще попадает в скандалы, примкнул к первому лагерю и вступился за коллег по полю. Почему Федор Смолов согласился на низкую зарплату в «Локомотиве»?
«Все мы люди, и все мы ошибаемся. Каждый из нас совершал глупые поступки, о которых неоднократно жалел впоследствии. Проще всего сейчас осуждать этих ребят, тем самым только ухудшая ситуацию. Не лучше ли дать им возможность исправить эту ошибку и загладить свою вину перед пострадавшими и всем обществом в целом?
Все нуждаются в прощении и поддержке! Давайте все будем чуточку снисходительнее и добрее!» — написал Фёдор в «Инстаграме».
Бывший президент ФК «Спартак» Андрей Червиченко также не остался в стороне от скандального поведения молодых игроков. Он отметил, что многие клубы российской Премьер-лиги не откажутся от заключения контракта с Кокориным и Мамаевым даже после их освобождения. «Кокорин и Мамаев должны понести наказание»: звезды «ДОМа-2» вынесли вердикт футболистам
«Спартак» спокойно возьмёт любого из них. Все преследуют свою выгоду: думаю, что и другие клубы не откажутся от таких футболистов. Вопрос немного в другом — насколько новые клубы смогут потянуть финансовые претензии Кокорина и Мамаева…
Если после всего случившегося они даже снизятся в два или три раза, всё равно это огромные деньги. И смогут ли Кокорин и Мамаев играть на таком же уровне? Они ведь могут думать: «Мне дали условия в три раза хуже, чего я буду рвать себе все жилы, играя за эту команду?». Они посидят два месяца, а остальное условно. Заодно покажут, что у нас перед законом все равны», — говорит Червиченко.
Футбольная карьера друзей под угрозой
Фото: Соцсети
Чемпион СССР в составе «Зенита» Борис Чухлов дал понять, что отношение к футболистам в нашей стране нужно пересматривать. По его словам, игроки получают немалые деньги и чувствуют совершенную вседозволенность, поэтому и позволяют себе вести разгульный образ жизни и ощущать себя Богами.
«Мне тут довелось прочитать, что всему виной стресс Кокорина после интенсивных тренировок, мол, крыша поехала. Как вам это объяснение? Вот такое пишут. Надо решать что-то в глобальном плане, потому что сейчас вседозволенность ощущают и младший брат Кокорина, и другие подростки. В Кокорина с 22 лет вложены такие финансовые средства! Думаю, сейчас Миллер, Фурсенко и Дюков могут задуматься о том, за что они деньги платят этому мальчику. Есть повод почесать репу. И что с ним сделать сейчас?» — высказался Чухлов.
Мамаев и Кокорин дружат 10 лет
Фото: «Инстаграм»
Не остался в стороне и Эдгард Запашный. Именитый дрессировщик чрезвычайно возмущён происходящим, поскольку считает пьяную драку футболистов очень подлым поступком, оправдания которому нет.
«Мамаев и Кокорин! Два зажравшихся козла: мы только стали забывать про их существование, как они решили напомнить о себе самым гнусным способом! Оскорблять человека, который намного старше вас, да ещё и по национальному признаку, а после этого нанести удары сначала стулом, а потом, при поддержке целой группы, накинуться на него — это даже не просто позор, а уродство!» — резко высказался Запашный.
А вот бывший тренер «Краснодара» Игорь Шалимов пока не понял, на чьей стороне находится. Мужчине жаль как спортсменов, так и пострадавших, поэтому он предоставляет право выбора наказания судье.
«Я до сих пор в шоке. Скажу так: если поставить себя на место пострадавшего водителя, я бы сделал всё, чтобы они получили максимально жёсткое наказание. А если поставить себя на места Кокорина и Мамаева — мне их жаль», — вздохнул Шалимов.
Стоит отметить, что после огласки вокруг этого дела на семьи Александра и Павла посыпалось бессчётное количество обвинений. И если отчим Кокорина публично извинился перед всеми и предпочёл закрыть тему, то жена Мамаева, Алана, до сих пор пожинает плоды поступков мужа. Отчим Кокорина и жена Мамаева заступились за них после скандала
На Алану посыпались угрозы: незнакомый мужчина принялся шантажировать её, требуя деньги. Якобы, если девушка не выплатит компенсацию, то Павел должен повеситься в тюрьме, а вся публика узнает, что Алана — эскортница. Правда, Мамаева не спешит «откупаться» от обидчиков, поскольку понимает, что за ней нет никаких грешков, а её супруг — вполне благоразумный мужчина.
Алане поступают угрозы от неизвестных
Фото: «Инстаграм»
На жену Мамаева посыпались многочисленные обвинения
Фото: «Инстаграм»
Напомним, 30-летний Павел Мамаев и 27-летний Александр Кокорин устроили две пьяные драки в ночь на 8 октября. Сначала футболисты, изрядно выпив спиртного, избили водителя, который сделал из замечание, а затем нанесли серьёзные увечья чиновнику Денису Паку. Сейчас поговаривают, что спортсменам будет тяжело откупиться от правосудия, поскольку следователем по их делу стал Алексей Гурменко — ярый болельщик «Спартака». Тюрьма и разводы с женами: чем для Кокорина и Мамаева обернулась пьяная драка?
Следователем по делу спортсменов стал болельщик «Спартака»
Фото: Соцсети
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка браузера на прием файлов cookie
Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.
Немецкая 6-я Армия «Мамаев курган» Tristar 35024
Decydujcy wpyw на ksztatowanie си organizacji Ораз taktyki niemieckiej piechoty Przed wybuchem II wojny wiatowej Miay г jednej Strony dowiadczenia wypywajce г poprzedniej wojny wiatowej, эль того Prace teoretyczne powstajce ж latach 20. Я 30. XX wieku, które czsto podkrelay konieczno postrzegania niemieckiej piechoty яко narzdzia prowadzenia wojny ofensywnej. Wpywao to zarówno na wyposaenie, jak i organizacj niemieckiej dywizji piechoty, która w toku kampanii wrzeniowej z 1939 roku liczya 3 puki piechoty, z których kady dzieli si na 3 bataliony piechoty, kompani artylerii oraz kompaninyДо этого прихода лицне единостки wsparcia, midzy innymi: puk artylerii z 4 dywizjonami artylerii (w tym jednym cikiej), batalion przeciwpancerny, batalion saperów czy batalion cznoci. W sumie dywizja piechoty tzw. I fali mobilizacyjnej liczya ок. 17.700 ludzi i posiadaa znaczcy komponent artyleryjski, ale te bya obficiie wyposaona w bro maszynow. Posiadaa te nowoczesne i wydajne – jak na owe czasy – rodki cznoci i dowodzenia. W toku wojny dywizje piechoty ulegay transformacji – w 1943 r. cz z nich zostaa przeksztacona w dywizje grenadierów pancernych.Натомяст 1943 г.р. стандартова dywizja „tradycyjnej” piechoty liczya ok. 12.500 ludzi (не ок. 17.700 ludzi jak w 1939 r.), zmniejszono te w niej component artyleryjski – zwaszcza artylerii cikiej – natomiast znaczco poprawiono obron przeciwpancern. Przyjmuje si, e w toku caej II wojny wiatowej w Wehrmachcie suyo ok. 350 dywizji piechoty.
Битва под Сталинградом Jest do powszechnie uznawana za najkrwawsz, pojedyncz bitw II wojnie wiatowej. Зостаа стоцона помидзы Арми Червон, воинским прошлым Оси – зваща Вермахта – на фронте wschodnim w okresie od sierpnia 1942 r.до лутего 1943 року. Doszo do niej w wyniku realizacji przez Wehrmacht planu o kryptonimie Fall Blau, który mia na celu opanowanie poudniowych obszarów ZSRR, dojcie do Kaukazu oraz zajcia pól ropononych Majkopu czy Baku. Jednak в току реализации этого плана, wyniku midzy innymi interwencji Адольфа Гитлера, jednym z gównych celów operacji stao си zajcie miasta Сталинград. Decyzja ta okazaa si nazistowskich Niemiec jedn z najgorszych w dziejach II wojny wiatowej. Batalia stalingradzka przerodzia si bowem w koszmarnie krwawe i bardzo cikie walki miejskie, w czasie których walczono o kady dom czy ulic, a linia frontu przebiegaa nierzadko przez pokoje czy klatki schodowe w blokach mieszkalnych! Finalnie, w jej wyniku Wehrmacht poniós wielk klsk, a do radzieckiej niewoli dostaa si ca 6.Armia wraz z feldmarszakiem Friedrichem Paulusem. Szacuje si, e w to caej bitwy stalingradzkiej, wojska pastw Osi straciy ok. 850.000 onierzy – zabitych, rannych i wzitych do niewoli. Битва под Сталинградом oznaczaa równie zwrot w wojnie na froncie wschodnim, która zacza od tego momentu przybiera obrót korzystny dla ZSRR.
Co oprócz modelu bd potrzebowa do jego sklejenia?
Рекомбинантные аналоги и их антитромботическая активность in vitro
Биопрепараты. 2022 янв; 10 (1): 11.
Natalia A. Перепеченова
3 Лаборатория токсикологии In Vitro Филиала Института биоорганической химии имени Шемякина и Овчинникова Российской академии наук, Пущино, Проспект Науки, 6, 142290 Москва, Россия; ур.liam@1151_aktan
Маттео Ди Минно, академический редактор
3 Лаборатория токсикологии In Vitro, Филиал Института биоорганической химии имени Шемякина и Овчинникова Российской академии наук, Пущино, проспект Науки, 6, 142290 Москва, Россия; ur.liam@1151_aktanПолучено 15 ноября 2021 г .; Принято 17 декабря 2021 г.
Abstract
Успех в лечении венозной тромбоэмболии и острых коронарных синдромов прямыми ингибиторами тромбина стимулировал исследования, направленные на поиск нового антикоагулянта из гематофагов. В данном исследовании проведено сравнение гирудина-1 из Hirudomedicinalis (десирудин), являющегося первым известным и наиболее хорошо изученным природным антикоагулянтом, с рекомбинантными аналогами гемадина из пиявки Haemadipsa sylvestris , вариегина из клеща . Amblyomma variegatum и анофелин из Anopheles albimanus . Эти полипептиды были выбраны благодаря их высокой специфичности и сродству к тромбину, а также их отличительным механизмам ингибирования.Нами разработана универсальная схема биотехнологического получения этих рекомбинантных пептидов в качестве фармацевтических субстанций. Антикоагулянтную активность этих пептидов сравнивали с использованием анализа тромбинамидолитической активности и удлинения времени свертывания (тромбиновое время, протромбиновое время и активированное частичное тромбопластиновое время) в плазме мыши и человека. Полученные предварительные результаты позволяют предположить, что гемадин является ближайшим аналогом рекомбинантного гирудина-1, активного вещества лекарственного препарата Иприваск (Aventis Pharmaceuticals, США) для профилактики тромбоза глубоких вен у пациентов, перенесших плановое эндопротезирование тазобедренного или коленного сустава.
Напротив, вариегин можно рассматривать как природный аналог бивалирудина (Ангиомакс, The Medicines Company), синтетического производного гирудина-1, сертифицированного для лечения пациентов, перенесших чрескожное коронарное вмешательство, и пациентов с нестабильной стенокардией после чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики.
Ключевые слова: антикоагулянт, прямой ингибитор тромбина (DTI), гемадин, вариегин, гирудин-1, анофелин, гепарин, интеин, тест времени свертывания
1.Введение
Нарушения в системе свертывания крови вследствие дисбаланса процессов свертывания, фибринолиза и воспаления приводят к образованию тромбов в сосудах. Артериальный тромбоз является основной причиной ишемического инсульта и острого инфаркта миокарда, тогда как венозный тромбоз может привести к тромбозу глубоких вен (ТГВ), легочной эмболии (ТЭЛА) и нестабильной стенокардии [1]. Крупные ортопедические операции, в том числе операции по замене тазобедренного или коленного сустава или операции по поводу перелома шейки бедра, связаны с высоким риском артериального и венозного тромбоза ТГВ/ТЭЛА. Антитромботические препараты, нацеленные на компоненты как артериальных, так и венозных тромбов, включают антиагреганты, антикоагулянты и фибринолитики [2]. Терапия комбинацией различных препаратов является необходимым этапом лечения артериальных и венозных тромбоэмболий [3,4]. Прямые и непрямые антикоагулянты являются основой профилактики и лечения венозной тромбоэмболии (ВТЭ) [5,6]. Первые непосредственно ингибируют сериновые протеазы каскада свертывания крови, а вторые препятствуют образованию предшественников протромбина и других факторов свертывания [7,8].Основная проблема любого антитромботического средства заключается в том, что его введение резко увеличивает вероятность геморрагических осложнений. Поэтому ключевыми критериями при разработке новых антикоагулянтов являются не только высокая эффективность и специфичность, но и безопасный фармакологический профиль. Общая проблема антитромботической терапии заключается в сложности достижения оптимального баланса между эффективностью и безопасностью, особенно в отношении кровотечения.
До недавнего времени нефракционированный гепарин и варфарин (Coumadin, Bristol-Myers Squibb Company, New York, NY, USA) были основным методом лечения венозной тромбоэмболии [9].Однако осложнения гепаринотерапии включают не только кровотечения, но и гепарин-индуцированную тромбоцитопению (ГИТ) и остеопороз [10]. Поэтому при высокой вероятности ГИТ предпочтение отдается лечению низкомолекулярными гепаринами и прямыми антитромбин III-независимыми ингибиторами тромбина, такими как дабигатрана этексилат (Pradaxa, Boehringer Ingelheim Pharma, GmbH & Co.KG), аргатробан. , и производные гирудина-1, природного ингибитора тромбина из медицинской пиявки Hirudomedicinalis (бивалирудин, торговая марка Angiomax, The Medicines Company и десирудин, торговая марка Iprivask, Aventis Pharmaceuticals и др.) [7,11,12,13]. Гирудин-1 и его рекомбинантное производное лепирудин (Refludan, Schering AG, лицензия Berlex Laboratories, Inc., США и Канада; Pharmion ® , все другие страны) были первым природным ингибитором тромбина, одобренным Европейским Агентство по оценке лекарственных средств (EMA) и Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для лечения гепарин-индуцированной тромбоцитопении и связанной с ней тромботической болезни [14,15,16]. Эффективность и безопасность как гирудина-1, так и лепирудина были предложены для профилактики и лечения ВТЭ.Однако частые геморрагические нежелательные явления (смерть, ампутация конечностей, кровотечения из мест уколов и ран, внутричерепное кровотечение и сильное кровотечение) позже наблюдались в трех крупных клинических испытаниях, названных Гепарин-ассоциированная тромбоцитопения (ГАТ) 1,2 и 3, у пациентов, получавших лепирудин [17]. Благодаря результатам этих исследований FDA сузило область применения лепирудина в 2000 г. [18]. Впоследствии лепирудин был снят с продажи в 2012 г. [19]. Однако рекомбинантный аналог гирудина-1, десирудин (Revasc Canyon Pharmaceuticals, Великобритания, или Iprivask, Aventis Pharmaceuticals, США) по-прежнему был одобрен для профилактики тромбоза глубоких вен у пациентов, перенесших плановую операцию по замене тазобедренного или коленного сустава в ряде случаев. стран, с некоторыми ограничениями [20].В настоящее время синтетический бивалирудин (Ангиомакс, The Medicines Company, США) является наиболее перспективным антикоагулянтом среди аналогов гирудина-1 при лечении ВТЭ [21,22,23].
Бивалирудин был сертифицирован и долгое время использовался для лечения пациентов с гепарин-индуцированной тромбоцитопенией (ГИТ) или с гепарин-индуцированной тромбоцитопенией и тромбозным синдромом (ГИТТС) или с риском ее возникновения, которым проводится чрескожное коронарное вмешательство, а также пациентов с нестабильной стенокардией. после чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики [24,25].Хотя бивалирудин в настоящее время не полностью одобрен FDA для использования у детей, он широко используется для системной антикоагуляции во время терапии детей, которым требуется экстракорпоральная мембранная оксигенация (ЭКМО) [26,27,28]. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) предоставило бивалирудину исключительные права на педиатрию на основании проспективного открытого многоцентрового исследования в одной группе, представленного в ответ на письменный запрос FDA на исследование применения бивалирудина в педиатрические пациенты в возрасте от рождения до 16 лет [29].
Принимая во внимание существенные различия в уровне развития сердечной системы у взрослых пациентов и детей, бивалирудин проявляет предсказуемый и сходный характер действия [29,30].
Этот опыт стимулировал исследования различных гематофагов как вероятного источника специфических белковых ингибиторов тромбина [31]. Таким образом, к настоящему времени идентифицирован ряд антикоагулянтов, и многие из них обладают антитромбиновой активностью, сходной с активностью гирудина-1. Среди известных природных ингибиторов, обладающих высокой специфичностью и сродством к тромбину, в качестве объектов исследования были выбраны следующие пептиды: гемадин из индийской пиявки Haemadipsa sylvestris , вариегин из иксодового клеща Amblyomma variegatum и анофелин из малярийного комара. Анофелес белый .Все вышеперечисленные полипептиды являются высокоспецифичными двухвалентными ингибиторами тромбина. Известно, что тромбин является полифункциональным ферментом, содержащим типичный активный центр сериновой протеазы и многочисленные сайты связывания различных субстратов, в том числе фибриноген-связывающий экзосайт-1, гепарин-связывающий экзосайт-2 и ряд дополнительных субсайтов [32]. Анофелин проявляет уникальный обратносвязывающий механизм взаимодействия с тромбином: он связывается с теми же сайтами, что и гирудин-1 (активный центр и экзосайт-1), но в обратной ориентации [33].Напротив, вариегин блокирует активный центр и экзосайт-1 по тому же механизму, что и гирудин-1 и гирулог-1 [34]. Особенностью гемадина является то, что он связывается с активным центром тромбина и экзосайтом-2, но никак не блокирует функционально важный экзосайт-1 [35].
В наших предыдущих статьях мы сообщали о производстве рекомбинантного гирудина-1 и анофелина, антикоагулянта, из малярийного комара Anopheles albimanus [36,37]. Согласно опубликованным данным, твердофазный синтез пептидов до сих пор остается единственным эффективным методом получения вариегина [38].Рекомбинантный аналог гемадина был получен в лабораторных условиях посредством его периплазматической экспрессии в E. coli в виде слияния с белком, связывающим мальтозу, с последующим его расщеплением протеазой фактора Ха [39]. В ходе данного исследования мы разработали полупрепаративную биотехнологическую процедуру интеин-опосредованного получения рекомбинантных гемадина и вариегина фармацевтической чистоты с возможностью масштабирования до крупных промышленных уровней.
Наше исследование направлено на оценку потенциала рекомбинантных аналогов гемадина, анофелина и вариегинина в сравнении с рекомбинантным гирудином-1 с использованием некоторых классических методов изучения антитромботической активности in vitro.
2. Материалы и методы
2.1. Химические препараты, ферменты и материалы
Экспрессионные конструкции готовили с использованием плазмидных векторов pAL2-T (Евроген, Москва, Россия), pTWIN1 (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США) и pERIG [37], ДНК-полимеразы Encyclo ( Evrogen), эндонуклеазы рестрикции NdeI, BamHI и LguI и ДНК-лигаза T4 (Thermo Fisher Scientific, Burlington, ON, Канада). Белки очищали хроматографически на колонках XK 16/20 (лабораторный процесс), HiScale 50/40 и HiScale 50/20 (полупрепаративный процесс) со смолами Q Sepharose XL и Q Sepharose HP (Cytiva, Danaher Corporation, Вашингтон, округ Колумбия, США), колонка Kromasil 300-10-C18 RP-HPLC (Kromasil, Nouryon, Bohus, Швеция) и колонка BPG 140/750 со средой Bio-Gel P-2 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния, США). Тромбин (HYPHEN BioMed, Neuville-sur-Oise, Франция) и S-2238 (Chromogenix, Милан, Италия) использовали для определения антитромбиновой активности. В тестах на коагуляцию с плазмой мышей использовали тромбин-тест, АЧТВ-тест и тромбопластин производства НПО «РЕНАМ» (Москва, Россия). В тестах на коагуляцию с плазмой человека использовали реагенты Thromborel-S, Pathromtin SL и Test Thrombin производства Siemens Healthcare Diagnostic (Эрланген, Германия). Рекомбинантный гирудин-1 и анофелин получали по ранее опубликованному протоколу [36,37].Другие реагенты, используемые в этом исследовании, были приобретены у компаний Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США) и Panreac (Барселона, Испания).
2.2. Бактериальные штаммы и средние
бактериальный штамм
Escherichia COLI
One Shot ™ TOP10 [F- MRRA Δ ( MRRA RMS- MRR-HSD BC- MCR BC) Φ80 LAC ZΔM15 Δ LAC A1 Rec A1 ARA D139 Δ ( Araleu ) 7697 GAL U GAL K RPS L (STRR) End L (STRR) END A1 NUP G] Из инвоогена (Waltham, Massachusetts, USA) использовали в качестве хозяина для конструирование и амплификация рекомбинантных плазмид.
2.4. Ферментация во встряхиваемых колбах штаммов-продуцентов слитых белков GyrA-Hae и Var-GyrA
E. coli Для трансформации штамма E. coli BL21 (DE3) использовали векторы экспрессии pERIG-Hae и pERVar-IG. Трансформированные клетки высевали на чашки с агаром LB с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и выращивали при 37°С в течение 14 ч с получением отдельных колоний.После этого несколько колоний переносили в колбу Эрленмейера со 100 мл жидкой среды LB, содержащей 2 % ( w / v ) глюкозы и ампициллина (100 мкг/мл), и выращивали при 37 °C на орбитальной среде Certomat S II. шейкере (Sartorius, Göttingen, Germany) при 180 об/мин в течение 16 ч для получения ночной культуры с OD600 = 3,5. Эту культуру (2% против / против ) использовали для инокуляции 100 мл среды LB с 0,2% ( w / против ) глюкозы и ампициллина (100 мкг/мл), которые инкубировали на шейкере. при 180 об/мин и 37°С в течение 6 часов.Этот инокулят использовали для подготовки рабочего (WCB) и основного банка клеток (MCB) для каждого штамма для длительного хранения при -80 °C.
Оптимальные условия выращивания для каждого штамма были определены при малом культивировании клеток во встряхиваемых колбах. Запас WCB высевали на чашки с агаром LB. Инокулят готовили путем переноса нескольких колоний в колбу со 100 мл жидкой среды LB, содержащей 2% ( w / v ) глюкозы и ампициллина (100 мкг/мл), и выращивали при 37°C в течение 6 часов.Эту прекультуру (2% против / против ) инокулировали в колбы со 150 мл среды LB с 0,2% ( против / против ) глюкозы и ампициллина (100 мкг/мл). При достижении культурами плотности OD600 = 0,8–0,9 к ним добавляли 0,4 мМ ИПТГ и выращивали еще 4 ч при 23 или 37 °С. Уровень экспрессии белков GyrA-Hae и Var-GyrA оценивали с помощью анализа SDS-PAGE (см. ниже). Выбранные условия поддерживали в процессе встряхивания в колбах культуры штамма-продуцента общим объемом 1 л.Затем клетки осаждали центрифугированием при 3900×90×105 g 90×106 в течение 20 мин при 4°C в центрифуге Avanti J-30I (Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США).
2.5. Очистка и расщепление слитых белков GyrA-Hae и Var-GyrA
Для выделения слитых белков мы разработали унифицированную лабораторную схему, основанную на анионообменной хроматографии. 2 г клеточной биомассы ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,4, содержащем 5 мМ EDTA и 1 мМ PMSF в соотношении 1:10 w / v , и дезинтегрировали с помощью ультразвукового гомогенизатора Q700 Sonicator ( QsonicaLlc, Ньютаун, Коннектикут, США) в течение 15 мин при 4 °C (время включения 2 с, время выключения 10 с, мощность 25 Вт, частота 25 кГц).Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 19000× g в течение 20 мин при 4°C в центрифуге Hermle Z383K (HERMLE Labortechnik GmbH, Вехинген, Германия). Супернатант собирали, разбавляли в 4 раза 50 мМ трис-HCl-буфером, рН 8,5, 5 мМ ЭДТА и фильтровали через мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм (Millipore, Billerica, MA, USA). Отфильтрованный раствор наносили на колонку ХК 16/20 с 20 мл среды Q Sepharose XL, уравновешенной 50 мМ трис-HCl-буфером, рН 8,5, 5 мМ ЭДТА. Целевой белок элюировали линейным градиентом 15 CV от 0 до 500 мМ NaCl в 50 мМ трис-HCl-буфере, рН 8,5, 5 мМ ЭДТА, со скоростью потока 60 см/ч. Хроматографические фракции разделяли с помощью анализа SDS-PAGE, а фракции, содержащие целевой белок, объединяли. Полученный раствор разбавляли буфером Tris-HCl 50 мМ, 5 мМ ЭДТА, pH 9,0 до конечной концентрации белка 0,5 ± 0,1 мг/мл.
Расщепление слитого белка GyrA-Hae анализировали в диапазоне рН от 6,0 до 7,0 с шагом 0.2 при 23, 30 и 37 °С в течение 48 часов. Расщепление белка Var-GyrA анализировали при рН 8,5 при 23, 30 и 37 °С в присутствии различных концентраций ДТТ (5, 10, 25 и 50 мМ) в течение 48 часов. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. Здесь и на последующих этапах результаты оценивали с помощью SDS-PAGE и белковых измерений по методу Лоури [41].
2.6. Периодическая ферментация
Периодическую ферментацию штаммов E. coli BL21(DE3)/pERIG-Hae и BL21(DE3)/pERVar-IG проводили в ферментере объемом 75 л (Electrolux Fermentation, Novaferm, Falkenberg, Швеция) с начальный рабочий объем 50 л, как описано ранее [37].
2.7. Полупрепаративная очистка гемадина и вариегина
Для разработки универсальной схемы полупрепаративной очистки были увеличены этапы очистки и расщепления гибридного белка. Клеточную биомассу массой 100 г, полученную путем периодической ферментации с подпиткой, дезинтегрировали обработкой ультразвуком в ультразвуковом гомогенизаторе Labsonic P с проточной ячейкой (Sartorius, Геттинген, Германия) в течение 90 мин при 4 °C (время импульса 5 с). , длительность импульса 10 с, мощность 50 Вт, частота 25 кГц).Супернатант клеток получали центрифугированием при 7500×90×105 g 90×106 в течение 40 мин при 10°С в центрифуге Avanti J-30I, затем разбавляли в четыре раза и доводили до рН 8,5. Слитый белок очищали на колонке HiScale 50/40 с 500 мл среды Q Sepharose XL, как описано выше (линейный градиент 15 CV, скорость потока 150 см/ч).
Для расщепления слитого белка GyrA-Hae рН элюата после анионообменной хроматографии (IEX) доводили до 6,0 и инкубировали при 37 °C в течение 48 часов. Для расщепления слитого белка Var-GyrA элюат после анионного IEX инкубировали с 50 мМ DTT при 37 °C в течение 48 часов. Эффективность расщепления оценивали с помощью аналитической ОФ-ВЭЖХ (см. ниже).
Очистку целевого пептида из смеси расщепленных гибридных белков проводили с использованием анионообменной хроматографии и ВЭЖХ с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ). Раствор, содержащий продукты расщепления гибридных белков, пятикратно разбавляли 10 мМ буфером MES, рН 5,4, и доводили до рН 5.1. Осажденные белки удаляли центрифугированием при 7500×90×105 g 90×106 в течение 40 мин при 10 °С и последующей фильтрацией через целлюлозные фильтры с размером пор 4–12 мкм (Macherey-Nagel, Дюрен, Германия). Фильтрат наносили на колонку HiScale 50/20 с 200 мл среды Q Sepharose HP, уравновешенной 10 мМ MES, pH 5,1, и целевой пептид элюировали линейным градиентом pH 10 CV 20 мМ буфера ацетата натрия с 50 мМ NaCl, pH 4,8 и pH 3,6 при скорости потока 150 см/ч.Материал, элюированный с колонки, разделяли с помощью аналитической ОФ-ВЭЖХ и объединяли фракции, содержащие целевой полипептид.
На следующем этапе проводили очистку методом ОФ-ВЭЖХ на колонке Kromasil 300-10-C18 (размер частиц 10 мкм, 250 × 50 мм). В объединенный элюат после анионного IEX добавляли ацетонитрил и трифторуксусную кислоту до конечных концентраций 5% и 0,1% соответственно и загружали в колонку. Материал элюировали градиентом ацетонитрила от 6 до 50% в 0.1% TFA (8CV со скоростью потока 150 см/ч) и разделяли с помощью аналитической ОФ-ВЭЖХ.
Обессоливание очищенного пептида осуществляли с помощью эксклюзионной хроматографии. Фракции, содержащие целевой пептид с чистотой выше 99% после ОФ-ВЭЖХ, объединяли и загружали на колонку BPG 140/750 с 7 л смолы Bio-Gel P-2. Хроматографию проводили в 5 мМ буфере бикарбоната аммония, рН 8,0, со скоростью потока 20 см/ч. Фракции, содержащие целевой пептид, объединяли и лиофилизировали в сублимационной сушилке/лиофилизаторе VirTisAdVantage Plus XL (SP Scientific, Уорминстер, Пенсильвания, США).
2.8. Измерение антитромбиновой активности прямого ингибитора тромбина In Vitro
2.

Гирудин-1, анофелин, гемадин и вариегин исследовали на их способность ингибировать амидолитическую активность α-тромбина человека в отношении специфического хромогенного субстрата S2238 (HD-фенилаланил-L-пипеколил-L-аргинин- p -нитроанилина дигидрохлорид) [37]. Полипептиды растворяли в реакционном буфере (50 мМ Tris-HCl буфер, pH 8.4, с 150 мМ NaCl и 0,1% ПЭГ 6000) для исходного раствора 1 мМ, а затем разбавляли до различных концентраций: от 10 пМ до 100 нМ для гемадина и гирудина, от 10 пМ до 10 мкМ для анофелина и вариегина. Анализы проводили в 96-луночных титрационных микропланшетах с использованием многорежимного считывателя микропланшетов Synergy HTX (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) с двойным модулем ввода реагентов. Исходные растворы субстрата и тромбина разводили в реакционном буфере.
В кинетических анализах прочного связывания все пептиды инкубировали с 500 пМ тромбином (0.03 единицы mNIH) в 100 мкл смеси в течение 30 мин при 37 °C и 300 об/мин на орбитальном термошейкере PST-60HL (Biosan, Рига, Латвия). Анализы проводили с различными концентрациями ингибитора в трех повторностях: в диапазоне от 0,5 пМ до 10 нМ (5 х 10 -4 -20 х [Е 0 ]) для гирудина и гемадина или в диапазоне от 2,5 пМ до 1 мкМ (5 × 10 -3 -2000 × [E 0 ]) для анофелина и вариегина. Реакции запускали программным добавлением реакционного буфера и хромогенного субстрата (1 мМ исходный раствор) с помощью инъектора в различных соотношениях до конечной концентрации субстрата 50, 100, 200, 300, 400 или 500 мкМ до конечного объема. 200 мкл.Анализы медленного связывания проводили при постоянной концентрации субстрата (100 мкМ) и предварительно инкубировали в течение 2 минут при 37 °C с различными концентрациями ингибитора (так же, как и в анализах сильного связывания). К смеси добавляли α-тромбин (500 пМ) для инициирования реакций. В обоих экспериментах планшет с реакционными смесями инкубировали при 37 °С в течение 120 мин и измеряли скорость образования р -нитроанилина при 405 нм.
2.8.2. Кинетический анализ ингибирования тромбина
Результаты анализов прочного и медленного связывания использовали для составления кинетических графиков накопления p -нитроанилина в зависимости от концентраций ингибитора и субстрата.Кривые доза-реакция процентного ингибирования тромбина через 120 мин по сравнению с логарифмической функцией концентрации ингибитора при 100 мкМ субстрата использовали для определения значений полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) с использованием программного обеспечения OriginLab версии 9.1.0. (Корпорация OriginLab, Нортгемптон, Массачусетс, США) [38]. Скорость в отсутствие ингибитора рассматривали как контрольную точку (0% ингибирования).
Кинетические константы ингибирования тромбина рассчитывали в соответствии с уравнением Моррисона для сильносвязывающих конкурентных ингибиторов.На основании кривых доза-реакция скорости как функции концентрации ингибитора кажущаяся константа ингибирования Kiʹ была рассчитана с использованием нелинейного регрессионного анализа в программном обеспечении OriginLab. Полученные значения Kiʹ были нанесены на график в зависимости от концентрации субстрата с использованием линейной регрессии для получения константы ингибирования Kiʹ.
2.8.3. Тесты на коагуляцию в плазме мышей
102 7–8-недельных самцов мышей ICR, свободных от специфических патогенов, были получены из Лабораторного животноводческого комплекса «Пущино» (БИБХ, Пущинский филиал Института биоорганической химии имени Шемякина и Овчинникова). Российской академии наук).Кровь брали из нижней полой вены под анестезией (телазол-ксилазин в соотношении 1:2 против / против ) с помощью пробирки для взятия крови, содержащей цитрат в соотношении 9:1 ( против / против , плазма /цитрат). Плазму получали после центрифугирования цитратно-кровяной смеси в течение 15 мин при 1600×90×105 g 90×106 при 23 °С.
Каждый пептид растворяли в PBS до концентрации 1 мг/мл, а затем разбавляли PBS до трех исходных концентраций: 1, 10 и 100 мкг/мл.Все протестированные соединения смешивали с объединенной плазмой в соотношении 9:1 при 23 °C непосредственно перед экспериментом до тестовых концентраций: 0, 0,1, 1, 10 и 100 мкг/мл. Тромбиновое время (ТВ), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и протромбиновое время (ПВ) определяли с помощью Тромбин-теста, АЧТВ-теста и тромбопластина от НПО «РЕНАМ» (Москва, Россия) по методике руководство производителя реагента. Все измерения проводились в течение 3 мин не менее 5 раз с помощью коагулометра CL 4, (BehnkElektronik, Нордерштедт, Германия).
2.8.4. Тесты на коагуляцию в плазме человека
Венозную кровь собирали у здоровых добровольцев в пробирки для сбора крови Vacuette с цитратом натрия (9NC цитрат натрия, 3,2%, 4 мл, Greiner Bio-One GmbH, Австрия) в соотношении 9:1 ( v / v , плазма/цитрат). Образцы крови центрифугировали при 1400×90×105 g 90×106 в течение 40 минут при 23 °C, объединяли, разделяли на аликвоты и хранили в течение 3 дней при -40 °C до проведения анализа. Объединенную плазму использовали сразу или в течение 3 ч после оттаивания при 37°С.
Каждый пептид растворяли в 50 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,4, до 1 мг/мл, а затем разбавляли до различных концентраций (0,1, 1, 10 и 100 мкг/мл) при 23 °C и смешивали с объединенная плазма в соотношении 9:1 непосредственно перед экспериментом для проверки концентраций 0, 0,01, 0,1, 1 и 10 мкг/мл. Тесты TT, APTT и PT были выполнены в соответствии с руководством производителя реагента. Все измерения проводили в течение 3–4 мин не менее 5 раз с помощью коагулометра Start 4 (DiagnosticaStago, Париж, Франция).
2.9. Аналитические методы
Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) проводили по Лэммли [37,42]. Аналитическую обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФ-ВЭЖХ) и масс-спектрометрический анализ проводили, как описано ранее [37].
2.10. Статистический анализ
Statistica for Windows и программное обеспечение PRISM версии 8 использовались для статистического анализа. Результаты выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. Достоверность различий при множественных сравнениях определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа, критерия Крускала-Уоллиса и U-критерия Манна-Уитни.Уровень значимости определялся как 90×105 p 90×106 ≤ 0,05.
3. Результаты
3.1. Производство рекомбинантных гемадина и вариегина
3.

Для получения гемадина из наземной пиявки Haemadipsa sylvestris и вариегина из бонтового клеща Amblyomma variegatum использовали технологию, основанную на саморасщепляющейся N- и C-концевой метке слияния интеина ( Рисунок S1). Гемадин представляет собой полипептид из 57 аминокислот с молекулярной массой 6251.88 Da (номер доступа к базе данных NCBI/Protein {«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»CAA79672″,»term_id»:»298109″,»term_text»:»CAA79672″}} CAA79672) (рисунок S1a). Для получения гемадина мы использовали исходную конструкцию рН-зависимого С-концевого расщепления на основе мини-интеина GyrA из Mycobacterium xenopi (рис. S1b) [37]. Варьегин представляет собой пептид из 32 аминокислот с молекулярной массой 3607,94 Да (номер доступа к базе данных NCBI/Protein {«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»P85800″,»term_id»:» 1621″,»term_text»:»P85800″}}P85800) (рис. S1a).Варьегин содержит N-концевой сериновый остаток, что препятствует его получению с помощью С-концевой расщепляющей конструкции, поскольку интеиновая аффинная метка легко отщепляется от таких экстеинов при культивировании штамма-продуцента [43]. Следовательно, для этой цели мы использовали тиол-индуцированную конструкцию N-концевого расщепления на основе мини-интеина Mxe GyrA (рис. S1c).
Синтетические гены гемадина и вариегина были сконструированы с использованием химико-ферментативного синтеза и клонированы в плазмидные векторы pERIG и pTWIN1 для получения векторов экспрессии pERIG-Hae и pERVar-IG соответственно (рис. S1c, d, таблица S1).
3.1.2. Культивирование штаммов, продуцирующих слитые белки, содержащие гемадин и вариегин
Вектор экспрессии pERIG-Hae кодирует белок GyrA-Hae (35,4 кДа), состоящий из гемадина, слитого с C-концом CBD-меченого мини-интеина Mxe GyrA. Вектор экспрессии pERVar-IG кодировал белок Var-GyrA (31,6 кДа), состоящий из вариегина, слитого с N-концом CBD-меченого мини-интеина Mxe GyrA.
Мы оценили накопление слитых белков GyrA-Hae и Var-GyrA в трансформированных штаммах E.coli BL21(DE3) в течение 6 ч культивирования во встряхиваемых колбах при 23 или 37 °С после индукции ИПТГ. Мы сравнили уровни биосинтеза слитых белков (рис. S2). Культивирование штаммов-продуцентов в течение 4 ч при 37 °С было оптимальным условием для накопления гибридного белка. Удлинение индукционного периода до 5 или 6 ч не способствовало достоверному увеличению накопления белка. Культивирование штаммов-продуцентов проводили при общем объеме 1 л. Относительный уровень экспрессии гибридного белка и выход клеточной биомассы достигали 27.84 ± 0,69% и 5,6 ± 0,2 г/л для GyrA-Hae и 30,18 ± 0,52% и 5,8 ± 0,3 г/л для Var-GyrA в этих условиях.
3.1.3. Очистка гемадина
Как и гирудин-1, гемадин содержит три внутримолекулярные дисульфидные связи. В процессе культивирования штамма-продуцента E. coli BL21(DE3)/pERIG-Hae гибридный белок GyrA-Hae экспрессировался в растворимой форме, что является косвенным свидетельством правильного формирования этих связей в гемадиновой . Белок GyrA-Hae обогащали методом анионообменной хроматографии из надосадочной фракции, полученной при деструкции 5 г клеточной биомассы (а). Наши предыдущие эксперименты показали, что самый высокий уровень его С-концевого расщепления для слитых белков на основе Mxe GyrA достигается при 48-часовой инкубации при pH 6,0, выше 30 °C и достигается в присутствии тиолового реагента [37]. . В случае с гибридным белком GyrA-Hae мы воздержались от использования такого тиолсодержащего реагента, поскольку это могло привести к восстановлению, по-видимому, правильных дисульфидных связей в гемадине. Мы проанализировали расщепление слитых белков в диапазоне рН от 6,0 до 7.0, с шагом 0,2 при 23, 30 и 37 ° C в течение 48 ч (b и рисунок S3). Наибольшая эффективность расщепления была зарегистрирована после 48-часовой инкубации при рН 6,0 или 6,2; уровень расщепления достиг 58,20 ± 1,51% при 23 ° C (среднее значение ± SD между pH 6,0 и 6,2), 74,73 ± 0,50% при 30 ° C и 85,73 ± 1,35% при 37 ° C. Целевой полипептид после расщепления имел молекулярную массу 6251,52 Да, точно совпадающую с теоретическим расчетом для гемадина с тремя дисульфидными связями (в, г).
Очистка гемадина.( a ) SDS-PAGE анализ очистки и расщепления слитого белка GyrA-Hae. M, маркеры молекулярной массы; дорожка 1, сырой клеточный лизат; дорожка 2, супернатант клеток; дорожка 3, клеточный дебрис; дорожка 4, очищенный слитый белок GyrA-Hae после IEX аниона; дорожки 5–6 – продукты расщепления белков слияния при рН 6,0 и 37 °С в течение 24 ч (дорожка 5) и 48 ч (дорожка 6). Стрелки указывают на слитый белок GyrA-Hae (A) и остаточный белок CBD-GyrA (B). ( b ) Схема расщепления белка GyrA-Haefusion в диапазоне pH 6.от 0 до 7,0 при 23, 30 и 37 °С в течение 24 и 48 часов. * указывает p ≤ 0,05 для сравнения времени инкубации между 24 и 48 часами по критерию Манна-Уитни; # указывает p ≤ 0,05 для сравнения температуры инкубации между 23 и 37 °C в соответствии с тестом Крускала-Уоллиса. ( c ) Анализ RP-HPLC расщепления белка GyrA-Haefusion в течение 48 часов при pH 6,0 и 37 ° C. Стрелки указывают на гемадин ( 1 ) и остаточный белок CBD-GyrA ( 2 ). ОФ-ВЭЖХ на колонке YMC-Pack C8 (Octyl) (30 нм, 3 мкм, 150 × 2,1 мм), элюирование градиентом ацетонитрила (8–64%) в 0,1% ТФУ со скоростью 0,3 мл/мин. ( d ) Масс-спектр ESI-TOF гемадина.
Ферментация штамма E. coli BL21 (DE3)/pERIG-Hae была увеличена из шейкерных колб объемом 300 мл до промышленного ферментера объемом 75 л. В результате периодической ферментации объемом 50 л было получено 780 г влажной клеточной биомассы (15,6 ± 0,8 г/л). Относительное содержание слитого белка GyrA-Hae составляло 27.80 ± 1,23% от общего белка клетки. Разработанный протокол позволил выделить гемадин из 100 г клеточной биомассы за производственный цикл. После очистки с помощью анионообменной хроматографии гибридный белок расщепляли в выбранных условиях (48 ч при рН 6,0 и 37 °С) при перемешивании при 300 об/мин. Такой технологический прием ускорил динамику расщепления гибридных белков: через 24 ч инкубации достигалась эффективность 82,30%, а через 48 ч – до 86,90%. На следующем этапе процедура включала анионный IEX с градиентом pH, RP-HPLC и SEC для очистки гемадина от нерасщепленного слитого белка, CBD-меченого мини-интеина и клеточных белков. Эта полупрепаративная схема позволила нам выделить 497 мг гемадина фармацевтической чистоты (выше 98,0%) из 100 г клеточной биомассы (77,5 мг белка на литр клеточной культуры; таблица S2). Фактический выход достиг 68,57% от теоретически возможного.
3.1.4. Очистка Вариегина
Гибридный белок Var-GyrA, синтезированный штаммом-продуцентом E. coli BL21(DE3)/pERVar-IG в растворимой форме, был обогащен из супернатантной фракции, полученной разрушением 5 г клеточной биомассы ( а).Известно, что N-концевое отщепление интеиновой метки от гибридного белка наиболее эффективно в среднещелочных условиях и в присутствии тиолового реагента [44]. Мы проанализировали расщепление слитого белка Var-GyrA при pH 8,5 в присутствии DTT (5, 10, 25 и 50 мМ) при 23, 30 и 37 ° C (b и рисунок S4). Наивысшая эффективность расщепления (96,92 ± 1,03%) была достигнута при инкубации в течение 48 ч при рН 8,5, температуре 37 °С и 50 мМ ДТТ. Инкубация при более низких концентрациях ДТТ и при другой температуре была менее эффективной. Таким образом, оптимальные условия расщепления Var-GyrA оказались такими же, как рекомендованные NEB для N-концевого расщепления таких гибридных белков.
Очистка вариегина. ( a ) SDS-PAGE анализ очистки и расщепления слитого белка Var-GyrA. M, маркеры молекулярной массы; дорожка 1, сырой клеточный лизат; дорожка 2, супернатант клеток; дорожка 3, клеточный дебрис; дорожка 4, очищенный белок Var-GyrAfusion после анионного IEX; дорожки 5–6 – продукты расщепления белков слияния при рН 8.5 и 37 °C с 50 мМ DTT в течение 24 ч (дорожка 5) и 48 ч (дорожка 6). Стрелки указывают слитый белок Var-GyrA (A) и остаточный белок CBD-GyrA (B). ( b ) Схема расщепления белка Var-GyrAfusion при pH 8,5 и 23, 30 и 37 °C в течение 24 и 48 часов в присутствии 5, 10, 25 и 50 мМ DTT. * указывает p ≤ 0,05 для сравнения времени инкубации между 24 и 48 часами по критерию Манна-Уитни; # указывает p ≤ 0,05 для сравнения температуры инкубации между 23 и 37 °C в соответствии с тестом Крускала-Уоллиса. ( c ) Анализ RP-HPLC расщепления белка Var-GyrAfusion в течение 48 ч при pH 8,5 и 37 ° C с 50 мМ DTT. Стрелки указывают на вариегин ( 1 ) и остаточный белок CBD-GyrA ( 2 ). ОФ-ВЭЖХ на колонке Y.C-Pack C8 (Octyl) (30 нм, 3 мкм, 150 × 2,1 мм), элюирование градиентом ацетонитрила (8–64%) в 0,1% ТФУ со скоростью 0,3 мл/мин. ( d ) ESI-TOF масс-спектр вариегина.
Целевой продукт расщепления имел молекулярную массу 3608,57 Да, что совпадает с молекулярной массой вариегина без N-концевого формилметионина (в, г).Отсутствие среди продуктов расщепления N-формил-Мет-вариегина (3739 Да) можно объяснить высокой эффективностью N-концевого процессинга in vivo белков, содержащих серин в положении P1’ [45].
Ферментация штамма E. coli BL21(DE3)/pERVar-IG была увеличена от 300-миллилитровых встряхиваемых колб до 75-литрового промышленного ферментера. В результате ферментации с подпиткой объемом 50 л было получено 745 г клеточной биомассы (14,9 г/л). Уровень экспрессии слитого белка Var-GyrA составил 32,8 ± 0.6% от общего клеточного белка. Для очистки вариегина использовали протокол, разработанный для выделения гемадина. После очистки с помощью анионообменной хроматографии гибридный белок расщепляли в выбранных условиях (48 ч при рН 8,5, 37 °С, 50 мМ ДТТ) при перемешивании при 300 об/мин. Эффективность расщепления достигала 92,3% в течение 24 ч и 93,9% в течение 48 ч. Таким образом, стадия расщепления слитых белков была оптимизирована и ускорена, как и при очистке гемадина. Последующая очистка вариегина включала ту же трехэтапную процедуру, что и в случае гемадина.
Эта полупрепаративная схема позволила нам выделить 189 мг вариегина фармацевтической чистоты (выше 98%) из 100 г клеточной биомассы (28,2 ± 3,6 мг белка на литр клеточной культуры; таблица S4). Фактический выход достиг 72,02% от теоретически возможного.
3.2. Антитромбиновая активность
3.2.1. Ингибирование амидолитической активности тромбина
Гирудин-1, анофелин, гемадин и вариегин являются двухвалентными, прочно связывающимися конкурентными ингибиторами тромбина [33,34,35,46]. Их антитромбиновую активность оценивали с помощью амидолитического теста, а результаты использовали для построения кривой доза-реакция ингибирования тромбина в зависимости от концентрации ингибитора (37).
Кривая доза-реакция ингибирования амидолитической активности тромбина гирудином-1, гемадином, анофелином и вариегином. Анализ прочного связывания проводили с 500 мкМ тромбина, 100 мкМ S-2238 и различными концентрациями ингибитора.
Рассчитанные значения IC50 и констант ингибирования K i представлены в .Аффинность каждого пептида увеличивалась статистически незначимым образом после инкубации с тромбином, что типично для быстрых ингибиторов прочного связывания (рис. S5). Значения гирудина-1 и анофелина были аналогичны определенным ранее [36]. Рассчитанные значения для гемадина и вариегина совпадают с оценками других авторов [37]. Как и ожидалось, гемадин оказался наиболее сходным с гирудином-1 по антитромбиновой активности.
Таблица 1
Показатели антитромбиновой активности гирудина-1, гемадина, анофелина и вариегина.
Тромбин ингибитор | Время преинкубации | IC50 * | Ингибирование константы K I | |
---|---|---|---|---|
Hirudin-1 | 0 мин | 21,47 ± 0,49 PM | ||
30 мин | 28.01 ± 0.36 PM | 217 ± 25 FM | ||
Haemadin | 0 мин | 0 мин | 22,03 ± 0,57 вечера | |
30 мин | 33.![]() | 237 ± 25 фМ | ||
Анофелин | 0 мин | 6,35 ± 0,14 нМ | ||
30 мин | 60468 | 6.78 ± 0,04 нм | 99,4 ± 11.54 PM | |
Variegin | 0 мин | 0 мин | 14,55 ± 1,88 нм | |
30 мин | 18,39 ± 0,61 нМ | 371,6 ± 22,5 пМ |
3.

Антикоагулянтную активность гирудина-1, анофелина, гемадина и вариегина оценивали с помощью анализов активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ) и тромбинового времени (ТВ) свертывания крови. проводили in vitro в мышиной и человеческой плазме.Межвидовые различия в профиле коагуляции между человеком и мышами являются общеизвестным фактом, который является существенным ограничением в интерпретации результатов, полученных в экспериментах по коагуляции на мышах или крысах и людях [47,48]. В большинстве исследований эффективная концентрация антитромботических средств для мышей может быть на один-два порядка выше, чем эффективная доза для человека. Его эффекты обусловлены разным уровнем коагуляции и реактивностью фибринолитической системы. Преобразование доз для человека в дозы, эквивалентные животным, основано на площади поверхности тела.Для простоты пересчета мы использовали 10-кратный коэффициент пересчета доз (Dm/Dh = 10) [49].
Все вещества продемонстрировали дозозависимое удлинение времени свертывания крови, которое было одинаковым для плазмы крови человека и мыши с учетом коэффициента корреляции. Влияние всех пептидов на внутренние пути активации свертывания крови (тест АЧТВ) было статистически значимым (удлинение почти в 2 раза), но только при концентрациях более 1 мкг/мл (в плазме мыши) или 10 мкг/мл (в плазме человека). плазма) — более 150 нМ гирудина-1 и гемадина 1.5 нМ анофелина и 270 нМ вариегина (а, б, таблицы S4–S9). Активация внешних путей свертывания крови (РТ-тест) достигалась при концентрациях более 10 мкг/мл (более 1,5 нМ гирудина-1 и гемадина, 15 нМ анофелина и 2,7 нМ вариегина). Дозозависимый эффект гирудина-1, анофелина, гемадина и вариегина на удлинение времени свертывания тромбина (тест ТТ) в плазме мыши и человека был одинаковым при одинаковых дозах с учетом 10-кратного коэффициента преобразования.
Результаты анализа коагуляции в плазме мыши ( a , c , e ) и человека ( b , d , f ). Влияние гирудина-1, анофелина, гемадина и вариегина на активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) ( a , b ), протромбиновое время (PT) ( c , d ) и тромбиновое время (TT ) ( e , f ). Все эксперименты проводили в пятикратной повторности. Данные представлены как среднее значение по группе ± стандартное отклонение. *** указывает p ≤ 0,001 по сравнению с контролем (солевым раствором), ** указывает p ≤ 0,01 по сравнению с контролем и * указывает p ≤ 0.05 по сравнению с контролем по критерию Крускала-Уоллиса; ## означает p ≤ 0,01 по сравнению с концентрацией 0,1 мкг/мл (для мышей) и 0,01 мкг/мл (для человека), а # означает p ≤ 0,05 по сравнению с концентрацией 0,1 мкг/мл (для мышей). ) и 0,01 мкг/мл (для человека) по тесту Крускала–Уоллиса; @@ обозначает p ≤ 0,01 по сравнению с концентрацией 100 мкг/мл (для мышей) и 10 мкг/мл (для человека), а @ обозначает p ≤ 0,05 по сравнению с концентрацией 100 мкг/мл (для мышей).
) и 10 мкг/мл (для человека) согласно тесту Крускала-Уоллиса.Синяя пунктирная линия указывает на 50%-ное увеличение значения по сравнению с контролем (физиологическим раствором). Красной пунктирной линией обозначен предел времени измерения значений параметров коагуляции (180 с).
4. Дискуссия
Каскад свертывания крови представляет собой сложную систему последовательных реакций активации ферментов с различными отрицательными и положительными обратными связями, включая тромбин-опосредованную петлю обратной связи [50,51]. Тромбин участвует во многих биологических процессах.Известно, что через экзосайт-1 тромбин взаимодействует со своими партнерами биологическими белками, такими как фибриноген, фибрин, тромбомодулин и рецептор тромбина. Через экзосайт-2 тромбин взаимодействует с гепарином, кофактором гепарина II, антитромбином III, доменом kringle-2 в протромбине и тромбоцитарным гликопротеином Ib (Gp1b) [52]. Поэтому связывание ингибиторов с этими сайтами одновременно блокирует активный центр, влияя не только на конечный этап каскада свертывания крови (образование фибринового сгустка), но и на другие опосредованные тромбином процессы и активацию петли обратной связи. Например, оба экзозита в разной степени вовлечены в протеолитическую активацию FV, которая принимает участие в образовании протромбиназного комплекса, необходимого для усиления пути свертывания крови [53]. Именно экзосайт-1 играет критическую роль в распознавании сайта расщепления в FV, и если он заблокирован, то существенно влияет на инициацию активации FV. Взаимодействие с экзосайтом-2 происходит только на заключительном этапе активации ФВ и, блокируя его естественные лиганды, протромбиновый фрагмент 2 и гепарин, лишь незначительно влияет на активацию ФВ при большом избытке эффекторов.Аналогичная ситуация наблюдается и с ролью экзозитов в активации петли обратной связи FVIII/тромбин [54]. Из-за сложных аллостерических механизмов регуляции, запускаемых связыванием эффекторов с тем или иным сайтом тромбина, невозможно точно предсказать последствия взаимодействия и четко идентифицировать процессы, запускаемые торможением. Например, дабигатрана этексилат и аргатробан являются высокоселективными ингибиторами активного центра.
Однако дабигатрана этексилат ингибирует связывание экзосайта-1 с γA/γA-фибрином или фактором Va и никак не влияет на взаимодействие экзосайта-2 с Gp1b [55].В то же время аргатробан усиливает взаимодействие тромбина со всеми этими эффекторами. Связь между экзосайтами, вызванная связыванием эффектора (ингибитора или природного партнера), была описана для активации протеина С, природного антикоагулянта: связывание лигандов с экзосайтом-2 ослабляло опосредованное экзосайтом-1 связывание тромбина с тромбомодулином [56] .
Основной задачей при разработке новых антикоагулянтов является достижение правильного баланса между эффективностью и безопасностью.Известно, что препараты, удовлетворяющие этому критерию, обладают лучшим профилем безопасности и более широким диапазоном терапевтических доз. Интерес к новым высокоспецифическим ингибиторам тромбина из кровососущих животных и насекомых можно объяснить успехами антитромботической терапии производными гирудина-1 из Hirudomedicinalis . Так, препарат на основе гирудина-1 десирудин, или иприваск (Canyon Pharmaceuticals, Inc.), используется для профилактики проксимального тромбоза глубоких вен у пациентов, перенесших тотальное эндопротезирование тазобедренного или коленного суставов [23].Бивалирудин является активным ингредиентом лекарственного препарата Ангиомакс (The Medicines Company), одобренного для терапии больных с гепарин-индуцированной тромбоцитопенией [24].
Гирудин-1 является первым известным и наиболее хорошо изученным природным двухвалентным ингибитором тромбина с константами ингибирования около 200 фМ. Структура гирудина-1 включает [1,2,3,4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47]-коровый домен, который связывается с активным центром тромбина и неструктурирован [55,56,57,58,59, 60,61,62,63,64,65]-хвост, который взаимодействует с фибриноген-связывающим экзосайтом-1 тромбина [57].В виде изолированных пептидов оба этих фрагмента ингибируют опосредованное тромбином расщепление фибриногена и образование сгустка, но со значительно меньшей эффективностью по сравнению с полной молекулой (N- и С-концевые фрагменты ингибируют образование фибринового сгустка со значением Ki около 0,1–0,7 мкМ). ) [58]. Тромбин может расщеплять гирудин-1 по трем связям Lys-X (две связи расположены внутри N-концевого ядра, а другая расположена между N-концевым доменом и С-концевым хвостом) и тем самым инактивировать ингибирование.С-концевой [53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64]-фрагмент гирудина-1 блокирует фибриноген-свертывающую активность тромбина с Ki 0,15 мкМ и был используют для конструирования двухвалентного ингибитора тромбина, гирулог-1 или бивалирудина со значением Ki 1,3 нМ. Он был слит с синтетической N-концевой последовательностью (D-Phe)-Pro-Arg-Pro, которая прочно блокирует активный центр тромбина через полимерный линкер из четырех глицильных остатков [59]. Тем не менее, благодаря наличию связи Arg-Pro бивалирудин быстро расщепляется тромбином и его антитромботическое действие устраняется [60].
Все полипептиды в нашей исследовательской статье — гемадин из пиявки Haemadipsa sylvestris , вариегин из клеща Amblyomma variegatum и анофелин из комара Anopheles albimanus — являются уникальными высокоспецифичными, прочно связывающимися ингибиторами тромбина. структурными и функциональными свойствами и перспективны для антитромботической терапии. Гемадин со значением Ki около 200 фМ обладает сходным механизмом ингибирования тромбина и связывается с активным центром и экзосайтом-2, но не влияет на его экзосайт-1-зависимые биологические функции [39,61].Это связано с отсутствием у гамаедина способности ингибировать важный активный интермедиат тромбина — мейзотромбин — и, соответственно, функции, которые он выполняет [62,63]. Гемадин также расщепляется тромбином по связи Lys42-Ile, но полученный фрагмент остается конкурентным ингибитором тромбина со значением Ki 5 нМ [61]. Анофелин представляет собой безцистеиновый двухвалентный ингибитор тромбина со значением Ki около 30–100 пМ, но с уникальным механизмом ингибирования: он связывается с активным центром и экзосайтом-1, но в обратной ориентации [33,64].[32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45]-фрагмент блока тромбинового экзосайта-1 и [50,51,52,53] -тетрапептид взаимодействует со своим активным центром.
Хотя N-концевой фрагмент анофелина из 31 а.о. не обладает антитромбиновой активностью, благодаря своему отрицательному заряду он может способствовать правильному образованию комплекса с тромбином. Сайты расщепления Lys/Arg-X тромбином в анофелине расположены вне его функциональных областей, что означает, что можно ожидать незначительной инактивации, опосредованной тромбином.Вариегин (32 а.о.) является наименьшим среди двухвалентных ингибиторов тромбина природного происхождения, идентифицированных на сегодняшний день [38]. Природный вариегин характеризуется высокой специфичностью и прочным связыванием тромбина ( К i = 10,4 пМ). В отличие от природного вариегина, его синтетический аналог (s-вариегин) не гликозилирован по Tyr14, что приводит к 30-кратному снижению его сродства к тромбину (антиамидолитическая активность с повышением значения K i до 300 пМ). Тем не менее, s-вариегин в этом отношении как минимум в 20 раз превосходит обычные антикоагулянты, такие как бивалирудин ( K i = 2.
9 нМ), аргатробан ( К i = 3,2 нМ) и дабигатрана этексилат ( К i = 4,5 нМ) [38, 65]. В отличие от бивалирудина, вариегин остается быстрым, прочно связывающимся ингибитором тромбина, но с неконкурентным механизмом и Ki 14 нМ после опосредованного тромбином расщепления [34]. Поэтому от вариегина следует ожидать более пролонгированного действия. Высокая степень гомологии между С-концевыми фрагментами бивалирудина и вариегина, их сравнимый молекулярный размер и сходный бивалентный механизм ингибирования тромбина свидетельствуют о сходстве их фармакологических и иммуногенных характеристик.
Изучение антитромботической активности in vitro является лишь первым шагом в сравнении выбранных антикоагулянтов. Амидолитический тест позволяет оценить только сродство пептидов к тромбину и не учитывает никаких дополнительных эффектов. Тест тромбинового времени также отражает разницу в сродстве всех пептидов к тромбину. Полученные результаты являются ожидаемыми и хорошо коррелируют с результатами амидолитического теста. Однако результаты тестов АЧТВ и ПВ неожиданны и труднообъяснимы без изучения молекулярных механизмов действия ингибиторов.Определение АЧТВ является основным методом оценки активации внутреннего пути свертывания крови, поскольку позволяет оценить дефицит факторов I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII [51]. Этот метод в основном используется для изучения прямых ингибиторов тромбина. Тест ПТ отражает запуск внешнего пути свертывания крови и используется для диагностики дефицита факторов I, II, V, VII и X, а также для изучения непрямых ингибиторов тромбина (витамин К-зависимая группа) [51].Особо следует отметить, что вариегин, будучи значительно более слабым ингибитором тромбина по сравнению с гирудином-1, показывал практически одинаковые результаты в тех же эффективных концентрациях. Возможно, это можно объяснить отсутствием тромбин-опосредованной инактивации вариегина. Тот факт, что анофелин показал себя в этих тестах как самый слабый ингибитор [5], нельзя объяснить исключительно особенностями механизма взаимодействия с тромбином.
Возможно, что в отличие от других ингибиторов анофелин не запускает внутренние антикоагулянтные механизмы.
Таким образом, гемадин и вариегин обладают уникальными свойствами, включая высокую антитромбиновую активность in vitro, и могут рассматриваться как перспективные антикоагулянты для клинического применения наряду с гирудином-1 и бивалирудином. Особое внимание следует обратить на отсутствие корреляции между прямой антитромбиновой активностью вариегина и его влиянием на процессы свертывания крови. «Небольшие, но эффективные» прямые ингибиторы тромбина, такие как вариегин, могут занять место среди современных антикоагулянтов как ближайший (но гораздо более активный) природный аналог бивалирудина.
5. Выводы
Полученные предварительные результаты показывают, что гемадин является аналогом рекомбинантного гирудина-1, а вариегин — бивалирудином, синтетическим производным гирудина-1, сертифицированным для лечения пациентов с гепарин-индуцированной тромбоцитопенией. Однако антитромботический потенциал и профиль безопасности могут быть адекватно оценены только в ходе исследований in vivo на различных моделях венозных тромбозов.
Дополнительные материалы
Следующие материалы доступны в Интернете по адресу https://www.mdpi.com/article/10.3390/biomedicines10010011/s1, таблица S1. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для конструирования искусственных генов гемадина и вариегина; Рисунок S1. (а) Аминокислотные последовательности гемадина и вариегина. (б) Схема построения вектора экспрессии pERIG-Hae. (c) Схема построения вектора экспрессии pERVar-IG. ( d ) слитые белки GyrA-Hae и Var-GyrA. CBD, хитин-связывающий домен; Mxe GyrA, мини-интеин из Mycobacterium xenopi ; А, аланин; Н, гистидин; Н, аспарагин; С, цистеин.Рисунок S1. (а) Аминокислотные последовательности гемадина и вариегина. (б) Схема построения вектора экспрессии pERIG-Hae. (c) Схема построения вектора экспрессии pERVar-IG. ( d ) слитые белки GyrA-Hae и Var-GyrA. CBD, хитин-связывающий домен; Mxe GyrA, мини-интеин из Mycobacterium xenopi ; А, аланин; Н, гистидин; Н, аспарагин; С, цистеин. Рисунок S2. Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов E. coli BL21(DE3)/pERIG-Hae (a,b) и E.coli BL21(DE3)/pERVar-IG (в, г). ( а , в ) SDS-PAGE анализ накопления слитых белков GyrA-Hae ( а ) и Var-GyrA ( в ) во время культивирования штамма-продуцента. M, маркеры молекулярной массы; Дорожка 1, неиндуцированный сырой клеточный экстракт; дорожки 2–7, сырые клеточные экстракты после индукции в течение 1–6 ч при 23 °C; дорожки 8–13, сырые клеточные экстракты после индукции в течение 1–6 ч при 37 °C. 15%-SDS-PAGE (b, d). Динамика накопления гибридных белков GyrA-Hae (б) и Var-GyrA (г) при культивировании штаммов-продуцентов.* указывает p ≤ 0,05 относительно 37 °C в соответствии с U-критерием Манна-Уитни. Рисунок S3. Оптимизация расщепления слитого белка GyrA-Hae. (а, в, д) расщепление после 24-часовой инкубации в диапазоне рН от 6,0 до 7,0 при 23 °С (а), 30 °С (б) и 37 °С (д).
(б, г, е) расщепление после 48-часовой инкубации в диапазоне рН от 6,0 до 7,0 при 23 °С (б), 30 °С (г) и 37 °С (е). M, маркеры молекулярной массы; дорожка 1, очищенный GyrA-Hae после анионного IEX; дорожка 2, расщепление при рН 6,0; дорожка 3, расщепление при рН 6,2; дорожка 4, расщепление при рН 6.4; дорожка 5, расщепление при рН 6,6; дорожка 6, расщепление при рН 6,8; дорожка 7, расщепление при рН 7,0. 15%-SDS-PAGE. Стрелки указывают на слитый белок GyrA-Hae (A) и остаточный белок CBD-GyrA (B). Рисунок S4. Оптимизация расщепления слитого белка Var-GyrA при рН 8,5 и 23 °С (а), 30 °С (б) и 37 °С (в) в течение 24 и 48 ч в присутствии ДТТ.М, маркеров молекулярной массы ; дорожка 1, очищенный Var-GyrA после анионного IEX; дорожка 2, расщепление 5 мМ ДТТ в течение 24 ч; дорожка 3, расщепление 10 мМ ДТТ в течение 24 ч; дорожка 4, расщепление 25 мМ ДТТ в течение 24 ч; дорожка 5, расщепление 50 мМ ДТТ в течение 24 ч; дорожка 6, расщепление 5 мМ ДТТ в течение 48 ч; дорожка 7, расщепление 10 мМ ДТТ в течение 48 ч; дорожка 8, расщепление 25 мМ ДТТ в течение 48 ч; дорожка 9, расщепление 50 мМ ДТТ в течение 48 часов.
15%-SDS-PAGE. Стрелки указывают на белок Var-GyrAfusion (A) и остаточный белок CBD-GyrA (B). Таблица S2. Материальный баланс очистки гемадина. Таблица S3. Материальный баланс очистки от вариегина. Рисунок S5. Дозозависимая кривая ингибирования амидолитической тромбиновой активности гирудином-1 (а), гемадином (б), анофелином (в) и вариегином (г) без предварительной инкубации (ингибирование медленного связывания) и после 30 мин инкубации (плотное ингибирование). ингибирование связывания) с тромбином. Все анализы проводили с 500 мкМ тромбина, 100 мкМ S-2238 и различными концентрациями ингибитора.* указывает p ≤ 0,05 для значений IC50 относительно значений 30-минутной инкубации в соответствии с тестом Крускала-Уоллиса. Таблица S4. Влияние на АЧТВ в тестах с плазмой мыши. Таблица S5. Влияние на PT в тестах с плазмой мыши. Таблица S6. Влияние на ТТ в тестах с плазмой мыши. Таблица S7. Влияние на АЧТВ в тестах с плазмой человека. Таблица S8. Влияние на PT в тестах с плазмой человека.
Таблица S9. Влияние на ТТ в тестах с плазмой человека.
Вклад авторов
Концептуализация, Р.SE и MAK; методология, М.А.К., Э.А.Т. и Д.Д.Л.; формальный анализ и МАК; расследования, Э.Р.С., Г.А.С., А.М.И., Я.А.П., Н.И.Н., В.А.П., Н.А.П., И.Н.К., Э.С.С., А.Н.М. (Андрей Н. Мамаев), Е.В.Г. и МАК; ресурсы, А.Н.М. (Андрей П. Момот), R.S.E. и И.А.Д.; написание — подготовка первоначального проекта, A.P.M., E.A.Z., Y.A.A., E.A.T. и МАК; написание — обзор и редактирование, E.A.T. и МАК; визуализация, Э.А.Т. и М.А.К. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках гранта 13-04-00731.
Заявление Институционального контрольного совета
Все процедуры и манипуляции с животными были одобрены Институциональным комитетом по контролю и использованию животных (IACUC), протокол № 703/20 от 15 марта 2020 г. С животными обращались в соответствии с Руководством по уходу и использованию. лабораторных животных (8-е издание, National Academy Press). Биологическая испытательная лаборатория-филиал Института биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова, г. Пущино, Московская область, Россия, где проводились эксперименты, имеет аккредитацию AAALAC [66].Все процедуры и манипуляции с людьми-добровольцами были одобрены локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО АГМУ Минздрава России (протокол № 5 от 25 июня 2012 г.). В соответствии с недавним пересмотром Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2013 г.) перед началом исследования все добровольцы дали информированное согласие на использование биологического материала.
Заявление об информированном согласии
Информированное согласие было получено от всех участников исследования.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сноски
Примечание издателя: MDPI остается нейтральным в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и институциональной принадлежности.
Список литературы
1. Али М.Р., Салим Хоссейн М., Ислам М.А., Сайфул Ислам Арман М., Сарвар Раджу Г., Дасгупта П., Ношин Т.Ф. Аспект тромболитической терапии: обзор. науч. Мир J. 2014; 2014: 586510. doi: 10.1155/2014/586510.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]2. Хирш Дж., Эйкельбум Дж.В., Чан Н.К. Пятьдесят лет исследований антитромботической терапии: достижения и разочарования. Евро. Дж. Стажер. Мед. 2019;70:1–7. doi: 10.1016/j.ejim.2019.10.023. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3. Бартоломью Дж. Р. «Обновление в лечении венозной тромбоэмболии». Кливленд Клин. Дж. Мед. 2017;84:39–46. doi: 10.3949/ccjm.84.s3.04. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4. Смит С.А. Антитромботическая терапия. Верхняя. Компаньон Аним.Мед. 2012;27:88–94. doi: 10.1053/j.tcam.2012.08.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5. Бадиредди М., Мудипалли В.Р. Профилактика тромбоза глубоких вен. СтатПерлс; Остров сокровищ, Флорида, США: 2021. [Google Scholar]6. Бекаттини К., Аньелли Г.













Необычно высокие значения B для аморфных порошков на основе Fe, полученных методом газового распыления: AIP Advances: Vol 6, No 5
I. INTRODUCTION
Section:
ChooseTop of pageABSTRACTI.INTRODUCTION << II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОЦЕДУРА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ... IV. ВЫВОДЫ ССЫЛКИ НА СТАТЬИ Хорошо известно, что аморфные ленты на основе железа с превосходными магнитомягкими свойствами коммерчески используются для распределительных трансформаторов и бытовой электроники в качестве магнитных сердечников. 1–5 1. Р. Колано, К. Крыковски, А.К. Буриан, М. Полак, Дж. Шиновски и П. Зацкевич, IEEE.Trans. Magn 49 , 1367-1371 (2013). https://doi.org/10.1109/TMAG.2012.22347572. С. Юректен, А. Кара и К. Мардикян, в ICRERA , (октябрь 2013 г.), стр. 534-536.3. Г. Мамаев, И. Болотин, А. Щербаков, С. Мамаев, С. Пучков и И. Теняков, в Particle Accelerator Conference , 1 (май 1997 г.), стр.


Недавно мы успешно приготовили гетероаморфный порошок на основе Fe с высоким содержанием Fe 81 ат.% (т.е. Fe 81 Si 1,9 B 5,7 P 11,4 ) после исследования оптимального добавления металлоидные элементы. В этой работе мы намерены уточнить магнитные свойства, такие как B s , потери в сердечнике ( P cv ) и характеристика DC-суперпозиции сердечника из гетероаморфных порошков. Также будет обсуждаться промышленная осуществимость ядра.
II. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Раздел:
ВыбратьВерх страницыРЕФЕРАТЫ.ВВЕДЕНИЕII.МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА <
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
Раздел:
Выборный вариант PAGEABSTRACTI.IntRoductioniii.experiMental Transcriei.Results и Descormentio .



ТАБЛИЦА I.физические свойства сердцевины из аморфного порошка на основе Fe.
BS (T) BS (T) | H C ‘(A / M) | P CV KW / M 3 ) | K H (кВт / кг 3 ) | KE (KWS 2 / M 3 ) | ||
---|---|---|---|---|---|---|
Fe 81 Si 3 В 6 П 10 | 1.![]() | 25.2 | 25.2 | 625 | 5,2 × 10 -3 | 1,2 × 10 -8 |
Fe 81 SI 1.5 B 5 P 12.5 | 1,59 | 18.4 | 463 | 4.1 × 10 -3 8 6.4 × 10 -9 | | |
Fe 81 SI 1.9 B 5.7 P 11.4 | 1.57 | 14.9 | 372 | 3.![]() 8 | 90 × 10 -9 | |
Fe 96 SI 9 B 10 P 5 | 1.45 | 12.8 | 324 | 1,8 × 10 -3 8 1,5 × 10 -8 -8 8 | |






Ультраструктура семенников мексиканской плодовой мухи (Diptera: Tephritidae) | Анналы энтомологического общества Америки
Аннотация
Семенник Anastrepha ludens (Loew) имеет особое гистологическое строение, отличающееся от основного морфологического строения.Орган состоит из единственного мешковидного фолликула, содержащего все зоны развития мужских половых клеток. Основание фолликула видоизменено в виде семенного пузырька, в котором созревают сперматозоиды. В стенке яичка имеется перитонеальная оболочка из крупных клеток, тесно связанная с трахеолами. Главной особенностью этих клеток является цитоплазма, полная зерен пигмента. Брюшина расположена на сплошном слое мышц, ранее не отмеченном в морфологии насекомых. Существует апикальный фолликулярный эпителий, поддерживаемый толстой базальной мембраной, и эпителий в основании яичка, образующий камеру, в которой сперматозоиды высвобождаются из кист. Большая часть зрелых сперматозоидов находится внутри глубоких складок клеток базального эпителия.
В анатомии циклоррафовых двукрылых часто обнаруживаются серьезные структурные модификации, которые отличают этих насекомых от базовой морфологии класса Insecta. Эти модификации и приспособления можно обнаружить не только в их наружном скелете, но и в большинстве внутренних органов, таких как пищеварительный тракт, нервная система, мышцы и репродуктивные органы.
Немногие исследователи работали над гистологией и ультраструктурой семенников двукрылых.Bairati (1967) описал строение семенников Drosophila melanogaster Meigen, и большинство доступных по этому вопросу исследований относятся к этому роду, но в основном относятся к структуре и развитию зародышевых клеток, как у Hardy et al. (1979), Томпсон (1980), Гаравито (1982), Либрих (1982), Култхарт и Сингх (1988), Ван (1992) и Джоли (1994). Мужские зародышевые клетки Culicidae также изучались несколькими авторами. Wandall (1986) представил ультраструктуру сперматоцитов в семенниках Aedes aegypti L. Ндиайе и др. (1996) изучали сперматогенез у 18 видов комаров, тогда как Ndiaye et al. (1997) обнаружили ультраструктурное разнообразие сперматид. Tu (1998) изучал ультраструктуру репродуктивных тканей самцов A. aegypti , инфицированных вирусом денге. Даллай и др. (1996), Мамаев и др. (1996) и Dallai et al. (1997) сообщили об ультраструктуре сперматозоидов Cecidomyiidae. Leloup (1974) описал формирование семенников Calliphora erythrocephala (Meigen), а Bao et al.(1989) представили морфогенез акросомы, образованной комплексом Гольджи, у Ceratitis capitata (Wiedemann) (Tephritidae). Dallai and Afzelius (1991) описали жгутик спермы Dacus oleae (Gmelin) (Tephritidae) и D. melanogaster (Drosophilidae). Сперматозоиды последних двух видов обладают центриолями, содержащими девять триплетов микротрубочек, которые окружают два центральных синглета микротрубочек. Также относящийся к этой работе Friedlander (1999) описал сеть висцеральных мышц, которая проходит через фолликулы и выводящий проток в семенниках Omorgus freyi (Haaf) (Coleoptera: Trogidae).
Первоначальный интерес к этой работе возник из-за наблюдений, показывающих, что семенники этого вида имеют перистальтические сокращения. Это привело к гипотезе о том, что в стенке семенника имеется мышечный слой, о котором ранее не сообщалось ни у одного насекомого. Цель состояла в том, чтобы описать гистологическую и субмикроскопическую структуру яичка Anastrepha ludens (Loew) и понять его особое строение, слои, вовлеченные в его стенку, и где расположены мышцы, которые позволяют ему двигаться.
Материалы и методы
Anastrepha ludens были выращены на искусственном рационе (Bautista-Martínez et al. 1994). Живые органы препарировали и исследовали в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4). Для световой микроскопии делали серийные продольные и поперечные срезы семенников, фиксированных в растворе Дюбоска-Бразила (Pantin, 1964), обезвоженных этанолом и заливающих парафином. Срезы толщиной 5 мкм получали с помощью ротационного микротома (American Optical, Buffalo, NY) и окрашивали гематоксилином и эозином.
Для просвечивающей электронной микроскопии использовали стандартный метод (Bozzola and Russell 1992). Семенник вскрывали в солевом растворе, фиксировали 2 ч в 3% глутаральдегиде в 0,2 М фосфатном буфере (рН 7,4) и 4 раза промывали в фосфатном буфере. Затем орган обрабатывали в течение 1 ч 1% четырехокисью осмия и промывали дистиллированной водой в течение 30 мин. После обезвоживания в этаноле (30–100%) и трехкратной промывки пропиленоксидом семенники заливали смесью смолы Spurr и отверждали при 60°C в течение 6 часов.Срезы, полученные на ультрамикротоме (Reichert, Австрия), окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Исследование проводили под просвечивающим электронным микроскопом (JEOL 100-B, Токио) при напряжении 70 кВ.
Результаты
Семенники расположены под латеральными участками пятого тергума брюшка. Они связаны с железистым комплексом тонкими семявыносящими трубками (рис. 1, А). Добавочные железы представляют собой трубчатые структуры с закрытым концом. В центральной части группы 10 коротких трубочек, по бокам от комплекса отходят одна простая и одна раздвоенная длинная трубка.Из области схождения желез и семявыносящих протоков кзади выходит толстый семявыбрасывающий проток. Ее диаметр становится тоньше по мере приближения трубки к баллону эякуляторной помпы. Этот кутикулярный насос является модификацией эктодермического семявыбрасывающего протока и образован сферической луковицей и большой аподемой, к которой прикрепляются сильные мышцы. Эти мышцы-компрессоры прижимают аподему к луковице быстрыми сокращениями, вытесняя семенную жидкость, хранящуюся в эякуляторной луковице, которая соединена с основанием полового члена выводящим протоком.Задняя добавочная железа со слепой ветвью окружает терминальный тракт семявыбрасывающего протока (рис. 1А).
Рис. 1.
Половые органы самца Anastrepha ludens. (A) Вид сверху на 3D-модель внутренней репродуктивной системы; правое яичко не показано. (Б) Схема гистологии семенника в продольном разрезе
Рис. 1.
Мужские репродуктивные органы Anastrepha ludens. (A) Вид сверху на 3D-модель внутренней репродуктивной системы; правое яичко не показано.(Б) Схема гистологии яичка в продольном срезе
Зрелое яичко представляет собой длинный мешок с узким верхушечным концом. Его максимальная ширина приходится на базальную четвертую часть мешка. Задний или базальный конец образует переднюю складку, открывающуюся в семявыносящий канал. Средние размеры ( n = 100) органа: длина 1,12 мм (СОС = 0,0087), ширина 0,32 мм (СОС = 0,0035). Семенники у этого вида имеют желтую окраску, настолько интенсивную, что их можно увидеть сквозь тергальную пластинку.Эта окраска однородна по всей поверхности, и ее интенсивность не различается у разных насекомых. С последнего дня окукливания появляется желтая окраска. Цвет светлый, когда самец мухи выходит из пупария; нормальная интенсивность достигается через 24 часа. При малом увеличении на поверхности яичка можно увидеть 25 округлых равноудаленных ядер, каждое из которых представляет собой клетку брюшины (рис. 1В). Семенники окружены большим количеством трахей, большинство из которых расположены поперечно.
Как и у других двукрылых мускоидов, семенник мексиканской плодовой мухи состоит из уникального длинного фолликула (рис. 1Б). Его стенка, как видно при световой микроскопии, по-видимому, образована двумя клеточными слоями, названными Snodgrass (1935) tunica externa и tunica interna . Стенка органа (рис. 2 А) фактически образована перитонеальной оболочкой, слоем мышц, базальной мембраной, фолликулярным эпителием, сеткой трахеол и эпителием в основании фолликула (рис.1Б).
Рис. 2.
Ультраструктура стенки яичка Anastrepha ludens. (A) Поперечный срез слоев, образующих стенку яичка. (B) Деталь внешнего слоя. (C) Стенка яичка, фолликулярный эпителий и сперматогонии в поперечном срезе. (D) Зерна в брюшине разной плотности. (E) Трахеола инвагинирована в клетку брюшины. (F) Поперечный срез стенки яичка и заднего эпителия. (G) Продольный разрез мышечного слоя. бм, базальная мембрана; эл, внешний слой; fe, фолликулярный эпителий; г, зерна; ми, митохондрии; мю, мышца; п, ядро; ps — перитонеальная оболочка; ре, задний эпителий; сд, сперматиды; sg, сперматогонии; tb, трахеобласт; тр, трахеола; z, мышечные z-тяжи
Рис. 2.
Ультраструктура стенки семенника Anastrepha ludens. (A) Поперечный срез слоев, образующих стенку яичка. (B) Деталь внешнего слоя. (C) Стенка яичка, фолликулярный эпителий и сперматогонии в поперечном срезе.(D) Зерна в брюшине разной плотности. (E) Трахеола инвагинирована в клетку брюшины. (F) Поперечный срез стенки яичка и заднего эпителия. (G) Продольный разрез мышечного слоя. бм, базальная мембрана; эл, внешний слой; fe, фолликулярный эпителий; г, зерна; ми, митохондрии; мю, мышца; п, ядро; ps — перитонеальная оболочка; ре, задний эпителий; сд, сперматиды; sg, сперматогонии; tb, трахеобласт; тр, трахеола; z, мышечные z-полосы
Самая внешняя структура стенки яичка представляет собой ультратонкий неклеточный слой, сильно отличающийся от расположенной ниже клеточной мембраны (рис. 2Б). Брюшная оболочка всегда образована 25 крупными клетками. Ядра имеют на срезах овальные очертания, а их гетерохроматин образует скопления (рис. 2В). Цитоплазма заполнена округлыми зернами, содержащими желтый пигмент, придающий органу характерную окраску. Эти зерна имеют разную степень компактности (рис. 2Г). Некоторые из них кажутся обернутыми мембраной с легким материалом внутри. Другие не обернуты, а образованы волокнистым более плотным материалом. Однако большинство зерен имеют плотные округлые тела.Среди зерен имеются окружающие их складки оболочки.
Многие трахеолы глубоко впячиваются в клетки брюшины. Каждая кутикулярная трубочка окружена своим трахеобластом. Протоплазма трахеолярной клетки скудная, ядро прикреплено к внутренней трубке. Трахеобласт окружен большой складкой перитонеальной клеточной мембраны, через которую трахеоле удалось проникнуть (рис. 2Е). Сеть трахеол разветвляется на разных уровнях в перитонеальном и мышечном слоях, но никогда не достигает фолликулярного эпителия. Следующий слой является не только частью стенки яичка, но и слоем, который позволяет органу выполнять свои перистальтические движения. Это непрерывный слой кольцевидных мышц с четкими и равноудаленными Z-полосами (рис. 2 F и G). Эта мышечная ткань присутствует во всей стенке яичка под перитонеальной оболочкой. Ядра мышечных клеток на срезах выглядят плоскими и длинными, они окружены митохондриями и очень скудной протоплазмой (рис. 2F), что типично для мышечных клеток.
Под мышечным слоем находится базальная мембрана (рис. 2А), которая на вид волокнистая и ламинированная. В апикальной области семенника толщина этой неклеточной оболочки составляет почти четверть мышечного слоя, тогда как в задней части фолликула оболочка заметно тоньше. В толстых участках базальной мембраны ее волокна отделены друг от друга (рис. 3 А).
Рис. 3.
Стенка семенника и мужские половые клетки Anastrepha ludens. (А) Многослойная базальная мембрана фолликулярного эпителия. (B) Фолликулярные клетки и сперматогонии в продольном разрезе. (C) Продольный разрез мышечного слоя и заднего эпителия. (D) Сперматозоиды инвагинируют в дистальные складки заднего эпителия. (E) Сперматогонии в гермарии. (F) Цистоцит, покрывающий сперматиды. (G) Косой срез сперматиды. бм, базальная мембрана; в, центриоль; су, цистоцит; fe, фолликулярный эпителий; г, зерна; ми, митохондрии; мю, мышца; п, ядро; ps — перитонеальная оболочка; ре, задний эпителий; сд, сперматиды; sg, сперматогонии; sz, сперматозоиды
Рис.3.
Стенка семенника и мужские зародышевые клетки Anastrepha ludens. (А) Многослойная базальная мембрана фолликулярного эпителия. (B) Фолликулярные клетки и сперматогонии в продольном разрезе. (C) Продольный разрез мышечного слоя и заднего эпителия. (D) Сперматозоиды инвагинируют в дистальные складки заднего эпителия. (E) Сперматогонии в гермарии. (F) Цистоцит, покрывающий сперматиды. (G) Косой срез сперматиды. бм, базальная мембрана; в, центриоль; су, цистоцит; fe, фолликулярный эпителий; г, зерна; ми, митохондрии; мю, мышца; п, ядро; ps — перитонеальная оболочка; ре, задний эпителий; сд, сперматиды; sg, сперматогонии; сз, сперматозоиды
В верхних двух третях фолликула расположен эпителий из клеток, форма которых нечетко выражена, на толстой базальной мембране; их цитоплазма содержит большое количество митохондрий, а ядра большие и округлые (рис. 3Б). Эти клетки крупные в гермарии, где сперматогонии очень близко к ним, но их размер уменьшается вниз (рис. 1Б), где сперматогонии окружены цистоцитами. В семенниках половозрелых мух этот эпителий почти не заметен, так как клетки мельчают и даже исчезают по мере созревания сперматогоний.
В базальной трети фолликула расположен эпителий, образованный крупными клетками, осевшими на тонкой базальной мембране (рис. 1Б и 3В).Этот эпителий представляет собой массив, четко отличающийся от других гистологических элементов в стенке яичка. Эти клетки покрывают внутреннюю заднюю поверхность фолликула, вблизи его отверстия в сторону семявыносящего протока, и имеют структуры, предполагающие активную функцию синтеза и секреции, такие как эндоплазматический ретикулум, митохондрии, меж- и внутриклеточные вакуоли, а также многоскладчатую дистальную поверхность. . В пространство, окруженное этими клетками, клетки кисты вскрываются, освобождая сперматозоиды, которые могут сохранять здесь жизнеспособность длительное время. Свободные сперматозоиды часто глубоко проникают в дистальные складки клеток (рис. 3Г).
Мешковидный фолликул заполнен мужскими половыми клетками в несколько стадий развития, от сперматогоний в верхушке до зрелых сперматозоидов в основании (рис. 1Б). Световой микроскоп показывает различные зоны, в которых происходит сперматогенез: гермарий, зону роста, зону созревания и зону трансформации. У этого вида нет ни одной апикальной клетки, как это было описано для хирономид (Snodgrass, 1935) и асилид (Carson, 1954).
В гермарии, расположенной в верхушке фолликула, свободные сперматогонии располагаются в виде крупных округлых клеток с ядрами, занимающими большую часть объема клетки (рис. 3Д). Здесь сперматогонии находятся в постоянном делении.
В зоне роста ниже гермария клетки дифференцируются в виде сперматогоний и цистоцитов. Сперматогонии окружены цистоцитами, и эта ассоциация образует кисты. Когда покрытые оболочкой сперматогонии продолжают свои митотические деления, они называются сперматоцитами. Сперматоциты представляют собой диплоидные клетки, которые пролиферируют внутри цист, пока не достигнут зоны созревания, где каждая клетка проходит через два мейотических деления с образованием четырех гаплоидных сперматид.
Процесс, называемый спермиогенезом, происходит в зоне трансформации, где сперматиды трансформируются в сперматозоиды внутри кист (рис. 3Е). Это явление происходит за счет постепенного сжатия ядра и увеличения сперматиды с образованием жгутика спермия.В вершине сперматиды имеется коническая акросома, окруженная микротрубочками (рис. 3Ж). Центриоль появляется рано в сперматидах. Помимо центриоли вдоль жгутика расположены два спиральных митохондриальных производных.
Обсуждение
Внутренняя репродуктивная система самцов Cyclorrapha имеет структурные модификации, которые могут быть постоянными для всего подотряда. Если это так, то настоящее описание может быть использовано в качестве справочного материала при изучении других мух.
Цитоплазма клеток брюшины полна зерен, содержащих желтые электронно-плотные вещества, предположительно питательные вещества, хранящиеся там временно, на пути из крови к трансформирующим половым клеткам.
Как показано здесь, в стенке яичка между брюшиной и эпителием есть мышцы. Эта уникальная особенность может быть связана с унифолликулярной структурой этого яичка. В отличие от мультифолликулярных яичек, тонкие фолликулы которых допускают пролиферацию и рост клеток и кист, которые толкают друг друга, относительно большой и широкий одиночный мешковидный фолликул A.ludens необходимо двигаться для транспортировки клеток из гермария в начало семявыносящего протока (рис. 1). В отличие от этого мышечного слоя мышцы в семеннике жука O. freyi (Friedlander 1999) находятся не в стенке органа, а на перегородках фолликулов и выводящем протоке. Поскольку мышечный слой отсутствует у большинства насекомых, он не рассматривается в обобщенной морфологической схеме (Weber, 1933, Snodgrass, 1935, Chapman, 1998), но может присутствовать в семенниках других двукрылых.
Фолликулярные клетки можно спутать с соседними сперматогониями (рис. 3В), но их прикрепление к базальной мембране подтверждает, что они формируют эпителий. По-видимому, фолликулярный эпителий связан с развитием половых клеток. Об этом можно судить по тому, что эпителиальные клетки достигают наибольшего размера в гермарии, где сперматогонии свободны, а ниже, в фолликуле, где сперматогонии сгруппированы в кисты, фолликулярные клетки образуют плоский слой на базальной мембране.
Отсутствие одной апикальной клетки предполагает наличие комплекса апикальных клеток в верхушке фолликула. Предположительно апикальные клетки могли быть смешаны со сперматогониями в верхушке гермария, хотя в данном исследовании их дифференцировать не удалось. Клетки, заполняющие нижнюю часть гермария (рис. 3Е), должны быть сперматогониями, потому что они находятся в активном размножении, чего нельзя ожидать от апикальных клеток.
Задний эпителий, по-видимому, не участвует в развитии половых клеток, так как половые клетки, достигнув этого уровня, уже превращаются в свободные и подвижные сперматозоиды. Эндоплазматический ретикулум, митохондрии, вакуоли и множественная складчатая дистальная поверхность представляют собой структуры, указывающие на активную синтезирующую и/или секреционную функцию этого эпителия. Описанные выше признаки позволяют предположить, что задний эпителий мог происходить от vas efferens, трансформированного здесь в особый семенной пузырь, где хранятся половые клетки до их транспорта в эякуляторный аппарат. Внезапное высвобождение сперматозоидов сразу после того, как они достигают пузырька, свидетельствует о том, что эпителиальные клетки секретируют вещество, разрушающее оболочку кисты.Свободные сперматозоиды глубоко проникают в дистальные складки этого эпителия (рис. 3Г). Возможно, такое поведение может быть связано с интенсивной подвижностью сперматозоидов.
Каталожные номера
Bairati
,A
Строение и ультраструктура полового аппарата самца Drosophila melanogaster Meig. 1. Яичко.
З. Целльфорш Микроск. Анат
56
–99
.76
.1967
.
Bao
,S N
,I
Quagio-Grassiotto
иH
Dolder
.Образование акросомы у Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae).
Цитобиос
93
–100
.58
.1989
.
Баутиста-Мартинес
,N
,G
Вехар-Кота
иJ L
Каррильо-Санчес
. .
Боззола
,J J
иL D
Рассел
. .
Carson
,H L
Сравнительное исследование апикальной клетки семенника насекомого.
Ж. Морфол
141
–155
.77
.1954
.
Coulthart
,MB
иRS
Singh
. Различная степень генетического полиморфизма в семенниках и мужских добавочных железах Drosophila melanogaster и Drosophila simulans .
Биохим. Жене
153
–164
.26
.1988
.
Даллай
,Р
иБ А
Афзелиус
.Жгутик сперматозоидов Dacus oleae (Gmelin) (Tephritidae) и Drosophila melanogaster (Drosophilidae) (Diptera).
Междунар. J. Морфолл насекомых. Эмбриол
215
–222
.20
.1991
.
Dalli
,R
,P
,
P
Lupetti
,F
FRATI
,B A
Afzelius
иB MAMAEV
MAMAEV
.Сперматозоиды из надтриб Lasiopteridi и Stomatosematidi (Insecta, Diptera, Cecidomyiidae) Ультраструктурные данные и филогения подсемейства Cecidomyiinae.
Зоол. Скр
51
–60
.25
.1996
.
Dalli
,R
,P
,
P
Lupetti
,F
FRATI
,B M
Mamaev
иB A
Afzelius
. Характеристики сперматозоидов пяти видов галлиц (Diptera, Cecidomyiidae).
Acta Zool
33
–37
.78
.1997
.
Friedlander
,M
Внутрифолликулярная висцеральная мускулатура семенников Omorgus freyi (HAAF) (Coleoptera: Trogidae).
Междунар. J. Морфолл насекомых. Эмбриол
5
–11
.28
.1999
.
Garavito
,RM
Ультраструктура соединения перегородок , визуализированная в неокрашенных и окрашенных препаратах семенников Drosophila melanogaster .
Дж. Ультраструктур. Рез
344
–353
.80
.1982
.
Hardy
,R W
,K T
Tokyuasu
,DL
Lindsley
иM
2 Garavito 90.
Центр зародышевой пролиферации в семенниках Drosophila melanogaster .
Дж. Ультраструктур. Рез
180
–190
.69
.1979
.
Joly
,D
Длина сперматозоидов Drosophilidae (Diptera) оценивается по длине семенников и сосудов.
Междунар. J. Морфолл насекомых. Эмбриол
85
–92
.23
.1994
.
Leloup
,AM
Морфогенез половых желез у Calliphora erythrocephala. Описательное исследование.
Cellule
51
–93
.70
.1974
.
Liebrich
,W
Щелевые контакты в цистах сперматоцитов Drosophila hydei testis.
Междунар. Дж. Инвертебр. Воспр. Дев
243
–245
.5
.1982
.
Мамаев
,Б
,Р
Даллай
, иБ А
Афзелиус
.Жгутиковые аксонемы с 10 дублетами микротрубочек в сперматозоидах галлиц (Diptera, Cecidomyiidae).
Acta Zool
153
–160
.77
.1996
.
Ндиайе
,М
,X
Маттей
иОТ
Тиав
.Сперматогенез у комаров (Diptera: Culicidae).
J. Submicrosc. Цитол. Патол
375
–384
.28
.1996
.
Ндиайе
,М
,X
Маттей
иОТ
Тиав
.Ультраструктурное разнообразие манжетки сперматид комаров (Diptera: Culicidae).
Acta Zool
47
–49
.78
.1997
.
Thompson
,JN Jr
Стерильность и структура семенников у гибридов с использованием мужских рекомбинационных линий Drosophila melanogaster .
Генетика
221
–226
.51
.1980
.
Tu
,WC
Ультраструктурные исследования репродуктивной системы самцов Aedes aegypti (Diptera: Culicidae), инфицированных вирусом денге 2.
J. Med. Энтомол
71
–76
.35
.1998
.
Wandall
,A
Ультраструктурная организация сперматоцист в семенниках Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).
J. Med. Энтомол
374
–379
.28
.1986
.
Wang
,F
Ламинин в мужских половых клетках Drosophila .
J. Cell Biol
977
–988
.119
.1992
.© 2001 Энтомологическое общество Америки
M1070 Gun Truck № по каталогу: 8552 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: май 2022 г. |
10 февраля 2022 г. | |
German Panzer Crew Set № по каталогу: 84419 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: май 2022 г. |
3 марта 2022 г. | |
ПЛА ZTZ-99A MBT № по каталогу: 84518 Масштаб: 1-35 Дата выпуска: май 2022 г. ![]() |
2 марта 2022 г. | |
Leopard C2 (канадский ОБТ) № по каталогу: 84503 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: апрель 2022 г. |
10 февраля 2022 г. | |
Coyote TSV (Tactical Support Vehicle) № по каталогу: 84522 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: март 2022 г. |
3 января 2022 г. | |
пз.Kpfw.VI Sd.Kfz.182 Tiger II Porsche раннего производства, Vehicle Fgst.Nr.280009 № по каталогу: 84558 Масштаб: 1-35th Дата выпуска: март 2022 г. |
2 марта 2022 г. | |
Советский танк БТ-2 (поздний) № по каталогу: 84516 Масштаб: 1-35 Дата выпуска: февраль 2022 г. ![]() |
3 января 2022 г. | |
Fieseler Fi-156 C-3/TROP Storch № по каталогу: 80181 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: январь 2022 г. |
30 ноября 2021 г. | |
немецкий Sd.Kfz.186 Jagdtiger (производство Porsche) № по каталогу: 84564 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: январь 2022 г. |
30 ноября 2021 г. | |
German Panzer Crew Set № по каталогу: 84419 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: ноябрь 2021 г. |
30 октября 2021 г. | |
German Infantry The Barrage Wall № по каталогу: 84416 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: октябрь 2021 г. ![]() |
30 октября 2021 г. | |
Немецкая 6-я армия Мамаев курган № по каталогу: 84415 Масштаб: 1-35 Дата выпуска: октябрь 2021 г. |
30 октября 2021 г. | |
M911 C-HET с прицепом Talbert 64T № по каталогу: 85524 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: октябрь 2021 г. |
30 сентября 2021 г. | |
Российская Береговая ПКР 4К51 «Рубеж» с П-15 № по каталогу: 82937 Масштаб: 1-72nd Дата выпуска: октябрь 2021 г. |
30 октября 2021 г. | |
Платформа высокомобильного оружия Jackal 2 № по каталогу: 84521 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: октябрь 2021 г. |
2 сентября 2021 г. | |
Бронированная эвакуационная машина Bergepanzer 3 Buffel № по каталогу: 84565 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: сентябрь 2021 г. |
27 июня 2021 г. | |
MRAP Вездеход (MATV) Utility № по каталогу: ???? Масштаб: 1–35 Дата выпуска: сентябрь 2021 г. |
27 июня 2021 г. | |
Легкий танк ZTQ-15 № по каталогу: ???? Масштаб: 1–35 Дата выпуска: сентябрь 2021 г. |
21 июня 2021 г. | |
Российская 130-мм артиллерийская установка береговой обороны А-222 Берег № по каталогу: 82938 Масштаб: 1-72nd Дата выпуска: июль 2021 г. |
31 июля 2021 г. | |
немецкий Sd.Kfz.179 Bergepanther Ausf.G № по каталогу: 84553 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: июнь 2021 г. |
30 мая 2021 г. | |
Румынский TACAM T-60 № по каталогу: 84556 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: май 2021 г. |
31 марта 2021 г. | |
German 20mm Flak 38 Early with Waffen SS Crew № по каталогу: 84418 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: апрель 2021 г. |
27 февраля 2021 г. | |
Курск Спасение из кармана № по каталогу: 84417 Масштаб: 1-35 Дата выпуска: апрель 2021 г. |
27 февраля 2021 г.![]() |
|
Leopard C2 MEXAS с TWMP № по каталогу: 84557 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: апрель 2021 г. |
27 февраля 2021 г. | |
немецкий танк Pz.BeobWg V Ausf.A № по каталогу: 84534 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: март 2021 г. |
30 января 2021 г. | |
7-тонный самосвал LKW № по каталогу: 85520 Масштаб: 1-35th Дата выпуска: февраль 2021 г. |
1 января 2021 г. | |
German Sd.Kfz.171 Panther Ausf.G — Early Version № по каталогу: 84551 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: январь 2021 г. |
30 ноября 2020 г.![]() |
|
немецкий танк Pz.Kpfw.III/IV auf Einheitsfahrgestell № по каталогу: 80150 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: декабрь 2020 г. |
31 октября 2020 г. | |
PLA 59-D Medium Tank № по каталогу: 84541 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: декабрь 2020 г. |
31 октября 2020 г. | |
Немецкий Sd.Kfz.179 Bergepanther Ausf.G Последняя версия № по каталогу: 84554 Масштаб: 1–35 Дата выпуска: декабрь 2020 г. |
19 декабря 2019 г. |
Кровельные материалы на основе синтетических каучуков с добавками — отходы
[1]
В. Ломовской А. и др. Методы исследования релаксационных явлений полимеров в высокоэластичном состоянии (динамические методы), Учебно-методическое пособие, Министерство образования и науки Российской Федерации, Москва (2010).
[2] А.Труфанов Н.Н. Исследование термомеханических свойств тонких пленок УФ-отверждаемых пленок // XII Всероссийский съезд по фундаментальным проблемам теоретической и прикладной механики. 4 (2019) 207–209.
[3]
Н. Е. Кочкина, Н.Д. Лукин, Н.Р. Андреев, Исследование кинетики термодеструкции и прочностных характеристик нанокомпозитных материалов на основе Na-монтмориллонитового крахмала, полученных в вибромельнице, Успехи современной науки и образования. 5 (2016) 174-182.
[4] М.В. Коршунов, Я.Д. Самуйлов, А.Я. Самуйлов, Химическая переработка поликарбонатов в среде двухатомных спиртов, Вестник Технологического университета. 21 (2017) 48-52.
[5]
Э. Алифанов В., Полимерные кровельные и гидроизоляционные материалы с повышенным содержанием продуктов переработки каучука, не требующие вулканизации, в кн.: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук, Московский гос. Ломоносова Академия тонкой химической технологии, Москва, (2004).
[6] А.Н. Гайдадин, И.П. Петрюк, Анализ методов определения кинетических параметров термодеструкции полимеров на основе данных динамической термогравиметрии // Полимерные материалы пониженной горючести: Материалы VI Международной конференции. (2011) 7-8.
[7]
А. Н. Гайдадин, И.П. Петрюк, Я.В. Зарудный, Анализ методов расчета кинетических параметров термодеструкции термопластов на основе полиолефинов, Известия Волгоградского государственного технического университета. 75 (2011) 106-109.
[8] В.Мамаев В., Определение кинетических параметров термического разрушения горючих материалов, Научный вестник НИИГД Респиратор. 53 (2016) 47-56.
[9]
С. И. Буйло, В.В. Белозеров, Ю.В. Прус, Комбинированная термогравиметрическая и акустико-эмиссионная диагностика стадий термодеструкции веществ и материалов. 3 (2008) 71-74.
[10]
М.А. Хасков, Д.А. Мельников, А.И. Гуляев, Л.А. Дементьева, Использование методов термического анализа для изучения процесса и продуктов микрофазового разделения в системах на основе термореактивных олигомеров, в кн.: Роль фундаментальных исследований в реализации Стратегических направлений развития материалов и технологий их переработки на период до 2030 г. материалы V Всероссийской научно-технической конференции. Федеральное государственное унитарное предприятие «Всероссийский научно-исследовательский институт авиационных материалов».(2019) 352-362.
DOI: 10.18577/2071-9140-2019-0-3-9-13
[11] Н.Т. Кахраманов, Р.В. Гурбанова, Ю.Н. Кахраманлы, Состояние проблемы получения, исследования и применения кремнийорганических полимеров, Евразийский союз ученых. 27 (2016) 112-118.
[12]
Н. Р. Прокопчук, Исследование термостойкости полимеров методом дериватографии, Известия АН БССР. Серия химических наук. 4 (1984) 119-121.
[13] В.М. Шаповалов, В.П. Дубодель, И.И. Злотников, С.Ю. Хрищанович, О.Е. Пантюхов, М.Н. Долгачева, В.В. Талецкий, Разработка и исследование битумно-полимерных композиций с использованием вторичных полимеров, Горная механика и машиностроение. 4 (2016) 54-61.
[14]
Т. Акопова, В.С. Осипчик, Ю.В. Олихова, Т.П. Кравченко, Л.Х. Нгуен, Модификация эпоксидной композиции олигосилсесквиоксанами, Пластмасса. 1-2 (2015) 41-44.
[15] Л.Б. Кандырин, Е.В. Тараненко, П.Н. Тимошков, В.Н. Кулезнев, Свойства эпоксидных композиций, модифицированных кремнийорганическими эфирами, Известия высших учебных заведений. Серия: Химия и химическая технология. 50 (2007) 36-41.
[16]
М. Н. Абдикаримов, А.Ш. Кусаинова, К.К. Махмутова, И.Я. Садчиков, Термомеханические исследования кровельных материалов и клеевых мастик, Легкая промышленность Казахстана-Алматы. 4 (1995) 40-47.
[17] М.Н. Абдикаримов, З.Д. Абдыкадырова, А.С. Кусаинов, И.И. Мустаев Г. Влияние наполнителей на физико-механические и термомеханические свойства кровельных материалов // Тезисы докладов науч.-техн. конф. «Композиционные полимерные материалы. Переработка и применение в народном хозяйстве». Ижевск. (1990). 27.
[18]
М. Н. Абдикаримов, З.Д. Абдикадырова, А.Ш. Кусаинова В.А. Армированные мастичные кровельные материалы на основе некондиционных отходов производства и исследование их эксплуатационных свойств // Тезисы докладов респ. научно-техн. конф. «Рациональное использование промышленных отходов с применением экологически чистых технологий в текстильном, кожевенно-обувном производствах легкой промышленности». Джамбул, Алма-Ата. (1990) 69-70.
[19]
М.Н. Абдикаримов, Б.А. Жубанов, Р.Х. Тургумбаева, Ш.А. Сабырбаева, С.М. Байболов, Исследование влияния природных глин и металлургических отходов на физико-механические свойства кровельных материалов на основе синтетических каучуков, в: Тезисы докладов Международного симпозиума «Химическая наука как основа развития химической промышленности Казахстана в XXI веке».