Лада состав: Состав команды «Лада»

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в которой κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет собой показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) вычисляется как:

ET = 1 — (τDA / τD)

где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения для обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь, зависит от κ -квадрат, J (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неточности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорно.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора посредством вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может находиться в диапазоне от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит к изменению рассчитанного расстояния только на 26 процентов, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для отклонения в квадрате κ . Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния, возможно, до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если вообще возможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием методов резонансной спектроскопии переноса энергии и дифракции рентгеновских лучей в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предлагается теорией Ферстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Большая неопределенность существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадратов требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, а это условие вряд ли будет достигнуто.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность из-за фактора ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ -квадрат) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

где θ (T) — угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A) — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, который может быть определен FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни распада флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии по механизму Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрических форм и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой прямой или инвертированный микроскоп можно дооснастить для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть объединены с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами визуализации с флуоресцентным резонансным переносом энергии, представлена ​​на Рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культивирования тканей оснащен стандартной вольфрамово-галогенной лампой на столбе для исследования и записи. ячейки, использующие стандартное светлое поле, фазово-контрастное или дифференциально-интерференционное ( DIC ) освещение.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа крепится стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье, обеспечивающая широкополосную флуоресценцию и получение изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального освещения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

• Концентрации донорных и акцепторных флуорофоров должны тщательно контролироваться. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
• Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
• Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
• Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
• При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
• Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть присоединены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
• Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Чтобы феномен флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставил значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается сопутствующим уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансного переноса энергии, обычный подход заключается в использовании отношения двух значений, I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между донорно-акцепторными парами и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным гашением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется установившимся режимом флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны в пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (а)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками.

Среди факторов, которые потенциально могут повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может происходить самотушение, что влияет на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные доказательства, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях метод фотообесцвечивания доноров менее сложен, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение в тушении излучения донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод коррекции обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентной резонансной передаче энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра эмиссии акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал эмиссии донора (нежелательные длины волн) проходит через эмиссионный фильтр.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением , которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение средней продолжительности жизни, когда они записываются как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут иметь различное время жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресценции, классифицируются как во временной области ( импульсный , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется из фазового сдвига и глубины демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной областей для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями флуоресцентного резонансного переноса энергии являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки с помощью множества биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни донора в возбужденном состоянии, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся режиме. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Несмотря на то, что существуют различные методы измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись с трудом, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers and Michael W.Davidson — Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии — обзор

3.1.3.1.2 Флуоресцентная спектроскопия

Общие принципы объяснения флуоресцентной спектроскопии здесь не приводятся. Его можно найти в специальных учебниках [48], и его краткое изложение представлено на рис. 3.17.

Рисунок 3.17. Общий принцип флуоресцентной спектроскопии.(A) Представление основных переходов между двумя синглетными состояниями молекулы. На остальной части этого рисунка синяя и зеленая стрелки (темно-серая и серая стрелка в печатных версиях) представляют собой поглощение света и его излучение за счет флуоресценции, соответственно. Оранжевая стрелка (светло-серая стрелка в печатных версиях) представляет релаксацию энергии за счет безызлучательных процессов. Для простоты теоретически запрещенный переход в более низкоэнергетическое триплетное состояние «T» не был представлен, но он лежит в основе излучения фосфоресценции.(B) Схематическое изображение флуоресцентного спектрофотометра. (C) Химическая структура и абсорбция (синяя кривая (темно-серая в печатных версиях)) — эмиссионные (зеленая кривая (серая в печатных версиях)) спектры флуоресцеина.

Наиболее распространенными флуоресцентными фрагментами являются органические флуорофоры (кумарины, флуоресцеины, родамины, оксазины и цианины в порядке увеличения длины волны флуоресцентного излучения), хелаты лантаноидов или флуоресцентные наночастицы (см. Главу 6.9).

Два наиболее интересных аспекта для целей этой книги состоят в измерении динамической релаксации светового излучения, позволяющем определять характерные времена жизни флуоресценции, и в определении расстояния между двумя флуорофорами (наложенными на одном или двух различных молекул), используя эффект резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

FRET обычно предназначен для определения расстояния (а также ориентации) между флуоресцентным донором ( D ) и акцептором ( A ). Эффективность безызлучательной передачи энергии между D и A зависит от следующего:

1.

Относительная ориентация D и A , которые рассматриваются как диполи

2.

Степень перекрытия спектров между спектром излучения флуоресценции D и спектром поглощения A

3.

Расстояние r между D и A

Если спектральное перекрытие между флуоресценцией D и поглощением A равно нулю, передачи энергии не будет, даже если D и A очень близки. Если есть спектральное перекрытие, то передача энергии масштабируется как величина, обратная шестой степени — , что типично для диполь-дипольных взаимодействий между небольшими молекулами (см. Главу 2.1). Тогда эффективность передачи энергии определяется как

(3.34) E = R06R06 + r6

В этом уравнении R ₀ — это критическое расстояние, на котором эффективность передачи энергии снижается до 50% от максимальное значение при r = 0.

В теории Ферстера R ₀ пропорционально квантовому выходу донора ( ϕ ) и интегралу спектрального перекрытия, Дж, , между излучениями. спектр D и спектр поглощения A :

(3.35) R0 = (8,8 × 10-25) · K2 · ϕ · Jn4

, где K учитывает взаимную ориентацию D и A . n — показатель преломления используемого растворителя.

Перед проведением экспериментов FRET с определенной молекулярной системой необходимы следующие предварительные эксперименты:

1.

Квантовый выход донора должен быть измерен в растворителе, используемом для экспериментов FRET.

2.

Спектры флуоресценции D и спектры поглощения A должны быть измерены при концентрациях, используемых в эксперименте FRET для вычисления интеграла перекрытия J .

Эффективность FRET показана на рис. 3.18 для различных значений R ₀ .

Рисунок 3.18. Эффективность резонансной передачи энергии флуоресценции как функция расстояния между D и A для R ₀ = 1 (), 2 ((серый в печатных версиях)) и 5 ​​((темно-серый в версии для печати)) нм.

На схемах в верхней части представлены изменения расстояния между D (обозначено звездочкой) и A (обозначено диском) по отношению к конформационному изменению.

Справедливость уравнения. (3.35) был критически протестирован для дансил- (Pro) _n -нафтилпептидов, проявляющих конформацию спирали полипролина II типа. Вдоль этой спирали расстояние между донором нафтила и акцептором дансила можно точно регулировать числом пролинов в аминокислотной последовательности [49].

FRET был использован для исследования многих механизмов реакции. Типичным примером является выяснение индуцированного вирусами слияния липидов, межфазного явления, имеющего фундаментальное значение в медицинских науках [50].

Флуоресцентная спектроскопия особенно полезна для исследования взаимодействий между биомакромолекулами, такими как белки, и их партнерами по связыванию. Действительно, взаимодействие может изменить локальную полярность вокруг флуорофора и, следовательно, локальные дипольные моменты. Это вызывает изменение положения либо самого низкого энергетического уровня (самая высокая занятая молекулярная орбиталь), либо / или энергетического уровня молекулярной орбитали возбужденного состояния (например, самая низкая незанятая молекулярная орбиталь) и, следовательно, изменение поглощения спектр, но еще более заметное изменение в спектре излучения.

В качестве примера рассмотрим собственные флуоресцентные аминокислоты в белках. Соответствующие флуоресцентные группы представляют собой боковые цепи триптофана (Trp в трехбуквенном коде аминокислот), тирозина (Tyr) и фенилаланина (phe). Среди этих боковых цепей Trp имеет самый высокий квантовый выход эмиссии. Максимум спектра поглощения расположен при 280 нм, а максимум излучения — при 340 нм в воде. Но этот максимум излучения смещается в сторону более коротких длин волн (синее смещение), если Trp находится в гидрофобной внутренней части белка, и смещается в сторону более высоких длин волн, когда белок разворачивается (см. Главу 2.9).

Интенсивность флуоресценции также можно изменить с помощью процессов гашения. График отношения интенсивности флуоресценции в отсутствие гасителя, F ₀ , к интенсивности флуоресценции F в присутствии концентрации гасителя [ Q ] обычно дает прямую линию:

(3,36 ) F0F = 1 + KS · [Q]

Наклон этого так называемого уравнения Штерна – Фольмера дает константу гашения K _S , которая напрямую связана со временем жизни флуоресцентной группы в отсутствие тушителя τ и бимолекулярной константы скорости процесса тушения k _q , согласно

(3.37) Ks = kq · τ

Экспериментально полученное значение k _q часто сравнивают с константой скорости диффузии для бимолекулярного процесса k _d = 2,0 × 10 ¹⁰ л моль ^-1 с ^-1 . Когда k _q > k _d , процесс закалки ограничен диффузией, и процесс закалки является «статическим». Это означает, что существует комплексное образование между флуоресцентной молекулой в основном состоянии и гасителем.Процесс гашения также может быть «динамическим», подразумевая образование комплекса между флуоресцентной молекулой в возбужденном состоянии и гасителем.

Наконец, еще одно интересное применение флуоресцентной спектроскопии состоит в проведении анализов конкурентного связывания. Флуоресцентной молекуле (теперь называемой «рецептором» R ) сначала разрешается взаимодействовать с известной молекулой C ( C для «конкурента»), которая действует как гаситель и, как известно, связывается с известным область рецептора.Затем интересующий лиганд, L , титруют в рецепторном растворе; если интенсивность флуоресценции изменяется, C замещается L , что означает, что L связывается с рецептором в месте, близком к C . Хорошо известными примерами конкурентов флуоресценции альбуминов являются варфарин и ибупрофен, которые действуют как маркеры сайтов для сайта I (расположенного в субдомене IIA альбуминов) и сайта II (расположенного в субдомене IIIA альбуминов), соответственно [51].

Теперь мы сосредоточимся на реализации флуоресцентной спектроскопии на поверхностях.

композиция — Шестой лад — Томас Флиппин

«Это будет нашим ответом на насилие: делать музыку интенсивнее, красивее и преданнее, чем когда-либо прежде». -Леонард Бернштейн

В прошлом месяце меня осенило в душе: вместо того, чтобы писать ансамблевую пьесу, которую меня попросили написать для студентов из Сент-Луиса, я написал статью, связанную с недавней стрельбой в подростка из Сент-Луиса Майкла Брауна.Эта тема говорила мне больше, чем изначально планировалось, и когда художники могут делать то, что они хотят, а не то, что их просят, работа обычно более значима. Самонадеянный?

Я начал исследовать события и открыл для себя рэп-песни Майкла Брауна. Многие из них были вульгарными, но я решил взять мелодию, которую он использовал, и построить целую пьесу на этих восьми нотах. Целью было не прославить его грубый рэп, а представить его на слух. Была надежда, что подростки со всего города выполнят это, и все сообщество сможет собраться вместе, независимо от расового и социально-экономического характера, чтобы поразмышлять над ситуацией исцеляющим и вдумчивым образом. Смелый?

Две недели спустя у меня было кое-что… то, чем я очень горжусь . Есть чтение Дюбуа, чтобы контекстуализировать расовый аспект, и я дал игрокам возможность поднимать или не поднимать руки, когда они заканчивают игру, в надежде, что они смогут обсудить свой выбор. Дело в том, что добросовестные люди могут — и имеют — разные мнения о Фергюсоне, но я чувствовал, что все оценят то, что я пытался сделать. Наивный?

Но моя точка зрения как жителя Нью-Йорка не предполагала, насколько напряженными и вызывающими разногласия сейчас ситуация в Сент-Луисе.И есть много факторов, влияющих на успеваемость подростков: администраторы, учителя, ученики и родители — все должны быть за это. Тогда есть все виды соображений для представляющей организации: будем ли мы отчуждать членов? Считаться сторонником этого поляризующего вопроса? Как СМИ будут изображать это (например, «Ведущий демонстрирует вульгарную рэп-песню»)? Мы вели хорошую борьбу, даже изменяя аспекты пьесы, чтобы успокоить возражения (, это совершенно другая тема, ), но в конце концов трудности с выполнением пьесы так, как задумано, стали огромными. Отказ.

ОБНОВЛЕНИЕ: Итак, если сначала у вас ничего не получится, попробуйте, попробуйте еще раз. Я вернулся к чертежной доске, и благодаря удаче, изяществу и упорному труду некоторых людей, которым я благодарен, премьера произведения состоится в Duo Noire в Альянсе галерей черного искусства в Сент-Луисе. Теперь можно начинать настоящую работу. Погашение.

Биография инструктора | 7th Fret Guitar Studios

Darin Au

Дарин окончил Phi Beta Kappa со степенью B.А. в музыке из Университета Редлендса. Он получил степень магистра музыки в области композиции в Университете Северного Техаса. здесь находится один из крупнейших музыкальных колледжей страны, в который входят среди его выпускников много профессионалов в области музыки и лауреатов премии «Грэмми». Его сочинения и аранжировки исполнялись по всей территории США. США, по всей Европе и в Азии, в том числе мировая премьера его опубликовал работу Chasing Dragons на престижном фестивале Guitar Foundation of America в 2000 году.Его произведения исполнялись несколькими профессиональными гитарными ансамблями, в том числе Нью-Йоркским гитарным квартетом, гитарным квартетом Сан-Франциско и европейским гитарным квартетом Guitar4utation. Бенджамин Вердери, заведующий кафедрой гитары Йельского университета, на протяжении многих лет также использовал ряд композиций и аранжировок Дарина в своем обучении (Мауи ’09) и на семинарах (включая National Guitar Summer Workshop в Сиэтле ’03). Дарин также получил множество Награды и почести.Он много выступал в США и среди его местных заслуг — концерты и запись компакт-дисков с рок / регги. группа Thick Tubes, а также выступления на радио и телевидении с Капоно Бимером. Его композиции и записи также были услышаны в постановках Молодежного театра Гонолулу. Он занимал преподавательские должности в Академии Sacred Hearts Academy и Гавайский университет в Маноа.В течение 11 лет, с 2005 по 2016 год, Дарин занимал должность Заведующий музыкальным отделением Академии в школе Пунаху. В 2017–2018 годах он будет катализатором K-12 Learning Commons, исследуя творческие пути для всех в сообществе Пунахоу, чтобы учиться и демонстрировать свои работы. За последние несколько лет он проводил семинары по обучению творчеству на конференции «Школы будущего», конференции Гавайской ассоциации музыкального образования (HMEA), а также для учителей и родителей в школе Пунаху.Его последняя книга — «Начинающие ансамбли для следующего поколения гитаристов». «Погоня за драконами» была на компакт-диске «Погоня за светом» 2010 года, выпущенном SFGQ. «Dawning at Sunset», его трёхчастная сольная композиция для классической гитары, вошла в альбом Иэна О’Салливана «Born and Raised» в 2013 году. Этот компакт-диск был номинирован на премию Na Hoku Hanohano Гавайской академии звукозаписи в номинации «Инструментальный альбом года». Совсем недавно его композиция для гитарного ансамбля «Bailarina en un paisaje abstracto» была представлена ​​на конференции HMEA 2017 в совместных усилиях гастролирующего гитарного ансамбля средней школы Мэривейл (Феникс, Аризона) и ансамбля классической гитары II школы Пунаху. .В 2015 году он был назначен в совет директоров Hawaii Pops в качестве главы комитета по образованию. Он также входит в Совет NAfME по обучению игре на гитаре в качестве представителя Западного дивизиона на 2015–2018 годы.

Джейсон Номура

Джейсон получил степень бакалавра наук. в средней школе общей музыки Образование в UH-Manoa, где он получил множество наград. Входит в те отличием был сертификат за заслуги перед местным CMENC (Национальная ассоциация музыкальных педагогов), в котором он работал Президент.Помимо занятий классической гитарой, Джейсон изучал за эти годы был в нескольких рок-группах, а сейчас уже в трех; два кавер-группы, игра на гитаре / клавишах и пение, а также его оригинал проект, Мантра. Джейсон окончил среднюю школу Кадена, которая входит в состав ВВС США Кадена. Авиабаза на Окинаве, Япония, где он получил множество музыкальных наград. в том числе лучший оркестр / хор, первый председатель почетного оркестра / хора, и стипендия за производительность.В настоящее время работает по совместительству на факультете Пунахоу преподает, что еще, гитара! Джейсон был на 7-м ладу с Август 2009 г.

Мэтью Лав

Мэтт имеет степень бакалавра искусств. в исполнении классической музыки из Нового Консерватория Англии, где он учился на стипендии. В дополнение к свою курсовую работу по музыкальному исполнению, он также проявлял большой интерес к Прохождение ряда курсов по музыкальному образованию и композиции.Мэтт окончил Пунаху, где получил «Луи Б. Джазовая премия Армстронга »и престижной премии« Музыкальный департамент ». награда присуждается только в те годы, когда отдел находит выдающиеся ученик. Находясь в Пунаху, он выступал как в Симфоническом оркестре. и Jazz Band все четыре года.Он также активно выступал с его панк-группа, p.p.e., где он играл на басу и пел. Он был соавтором и записал два полноформатных альбома группы. С его возвращения в Гонолулу, Мэтт преподает уроки контрабаса в частном порядке, группа уроки игры на гитаре на 7-м ладу, и их можно увидеть выступающими в различных местных постановки по городу.Он также выступает с Джейсоном Номура в их местная альтернативная рок-группа Mantra, а также сочиняет и записывает собственную оригинальную музыку:
matthewcodylove.com

Кимберли Ошита

Кимберли владеет M.M. в исполнении на гитаре от штата Калифорния Университет Нортриджа и степень бакалавра искусств в исполнении на гитаре от Университет штата Аризона, где она закончила с отличием.Кимберли работал ассистентом преподавателя в Калифорнийском государственном Нортридже и в качестве инструктора по подготовке к игре на гитаре в Университете штата Аризона Программа. Она обучает игре на гитаре детей и взрослых в возрасте от 5 лет и старше. вверх, более 8 лет. Недавно она вернулась на Гавайи после учился классической гитаре в Европе в течение двух лет у Хуберта Каппеля (Германия) и Лоренцо Микели (Италия).В то время как в Университете штата Аризона Кимберли участвовала в джазовые мастер-классы и игра на электрогитаре, микросинте и струнных фортепиано в ансамбле экспериментальной музыки Университета штата Аризона. Кимберли очень любит преподавать и играть музыку, и любит делиться процесс открытия музыки с другими.Она сейчас играет электрогитара в паре экспериментальных рок-проектов.