Лада состав: Состав команды «Лада»

Разное

Содержание

Состав Лада сезон 2021-2022 Pribalt.info

Гл.Главный тренер — Валерий Белов

Вратари

игрок

возраст

лет 

рост  вес  страна
1 Забродин Артём 21 180 82 Россия
37 Носов Глеб 21 184 70 Россия
1 Трушков Александр 24 181 81 Россия

Защитники

11 Бобряшов Никита 25 188 93 Россия
26 Булатов Тимур 27 183 96 Россия
57 Валиуллов Даниил 23 189 84 Россия
3 Воробьёв Иван 24 190 93 Россия
75 Герцик Владислав 21 180 88 Россия
48 Глазков Иван 29 192 100 Россия
4
Дубинин Роман
26 178 80 Россия
7 Евсеенков Александр 35 174 84 Россия
20 Ислямов Надир 23 189 85 Россия
70 Козловский Юрий 27 177 92 Россия
54 Петров Дмитрий 21 187 82 Россия
65 Поляков Никита 22 182 83 Россия
87 Усманов Игорь 20 190 90 Россия

Нападающие

88 Альшевский Ярослав 30 183 73 Россия
9 Альшевский Станислав 30 180 78 Россия
8 Артемов Артём 24 181 95 Россия
71 Белозёров Андрей 25 180 88 Россия
46 Бодров Евгений 33 187 86 Россия
89 Бочкарёв Валерий 23 174 74 Россия
94 Владимиров Николай 26 184 96 Россия
19 Дёмин Павел 22 176 77 Россия
59 Зиазов Айрат 30 180 86 Россия
29 Мокин Михаил 29 174 74 Россия
81 Назаров Михаил 24
185
93 Россия
66 Первов Антон 24 186 91 Россия
92 Рангаев Станислав 19 187 75 Россия
75 Романов Иван 23 185 90 Россия
22 Свинцицкий Никита 27 185 87 Россия
88 Стешенко Степан 19 186 87 Россия
16 Томилин Артём
30
188 92 Россия
19 Червоненко Владислав 22 175 84 Россия
97 Чередниченко Сергей 19 185 94 Россия

РСКГ | LADA Sport ROSNEFT

Руководитель:

— —

Официальный сайт:

Город:

Тольятти

Число побед РСКГ:

38

Стартовый номер:

8

Автомобиль:

LADA Granta

Класс:

Туринг-Лайт

Стартовый номер:

10

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Супер-продакшн

Стартовый номер:

11

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

11

Автомобиль:

LADA Granta

Класс:

Туринг-Лайт

Стартовый номер:

30

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

37

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Супер-продакшн

Стартовый номер:

99

Автомобиль:

LADA Granta

Класс:

S1600

Стартовый номер:

10

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Супер-продакшн

Стартовый номер:

11

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

11

Автомобиль:

LADA Granta

Класс:

Туринг-Лайт

Стартовый номер:

30

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

37

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Супер-продакшн

Стартовый номер:

50

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Супер-продакшн

Стартовый номер:

71

Автомобиль:

LADA Granta

Класс:

S1600

Стартовый номер:

10

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Супер-продакшн

Стартовый номер:

11

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

30

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

37

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Супер-продакшн

Стартовый номер:

50

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Супер-продакшн

Стартовый номер:

95

Автомобиль:

LADA Granta

Класс:

S1600

Стартовый номер:

11

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

30

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

37

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Супер-продакшн

Стартовый номер:

50

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Супер-продакшн

Стартовый номер:

95

Автомобиль:

LADA Granta

Класс:

S1600

Стартовый номер:

11

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

19

Автомобиль:

LADA Kalina II NFR

Класс:

Национальный

Стартовый номер:

20

Автомобиль:

Kia Rio III

Класс:

S1600

Стартовый номер:

30

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

34

Автомобиль:

Kia Rio III

Класс:

Национальный

Стартовый номер:

37

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Супер-продакшн

Стартовый номер:

50

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Супер-продакшн

Стартовый номер:

4

Автомобиль:

Audi RS 3 LMS SEQ

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

30

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

4

Автомобиль:

Audi RS 3 LMS SEQ

Класс:

Туринг

Стартовый номер:

30

Автомобиль:

LADA Vesta

Класс:

Туринг

«Лады» приоритет: бесшумной подводной лодке нашли место службы | Статьи

Первой серийной бесшумной подводной лодке «Кронштадт» проекта 677 («Лада») нашли место службы. Новейшая дизельная субмарина может остаться на Балтике или войти в состав Северного флота. «Лада» является одним из самых амбициозных проектов ВМФ России. Постройка субмарин сильно затянулась из-за долгой разработки революционной энергоустановки. Пока в них устанавливают обычные дизель-электрические двигатели. Производимый подлодкой уровень шума не превышает показатели обычных звуков моря, отметили эксперты. А уникальная гидроакустическая станция и вооружение позволяют ей уничтожать корабли, суда и подводные объекты противника.

Трудный проект

В настоящее время прорабатывается вопрос размещения новейшей дизельной подводной лодки, рассказали «Известиям» источники в военном ведомстве. Это первая серийная субмарина проекта 677 «Лада». После приема в состав ВМФ корабль останется на Балтийском флоте. Хотя не исключено, что он совершит переход и пополнит состав Северного флота. Ранее сообщалось о том, что «Кронштадт» направят на Тихий океан. Но, по словам собеседников издания, пока от такого решения отказались.

В марте этого года Главнокомандующий ВМФ России адмирал Николай Евменов заявил, что в ближней перспективе флот получит две лодки проекта 677 — «Кронштадт» и «Великие Луки». В планах построить еще две. Решение о дальнейших закупках, по его словам, примут по итогам практической эксплуатации серийных образцов.

Контракт на постройку третьей и четвертой серийных субмарин Минобороны заключило с «Адмиралтейскими верфями» два года назад. Но его практическая реализация пока не началась. Гендиректор предприятия Александр Бузаков заявил, что и в этом году новые подлодки проекта «Лада» заложены не будут. Как и все предыдущие, строить их планируется не с перспективной воздухонезависимой энергетической установкой (ВНЭУ), а с обычной дизель-электрической.

Подводная лодка «Кронштадт» проекта 677 («Лада»)

Фото: Global Look Press/MOD Russia

Пока в составе ВМФ находится только головная подлодка «Санкт-Петербург», построенная в 2010-м. В прошлом году после многолетней эксплуатации на Северном флоте ее перевели в Кронштадт на техобслуживание и модернизацию.

Готовящаяся к передаче флоту в 2022 году первая серийная субмарина — «Кронштадт» — была заложена почти 16 лет назад и строилась по усовершенствованному проекту. По сравнению с «Санкт-Петербургом» на ней усовершенствовали навигационную систему и установили более тихую и мощную электродвигательную установку. Также добавили возможность применять крылатые ракеты «Калибр» из торпедных аппаратов. Такие же изменения будут внедрены и на «Великих Луках» — лодка пока еще не спущена на воду.

По заявлениям разработчиков, из-за новых технических решений заметность «Лад» уже ниже, чем у серийно строящихся сейчас дизель-электрических подводных лодок (ДЭПЛ) проекта 636.3 «Варшавянка». После установки воздухонезависимой энергоустановки их шумность окажется ниже фонового уровня в море. То есть обнаружить их будет практически невозможно.

— Сегодня на Балтийском флоте у нас в строю находится фактически только одна лодка «Дмитров», построенная в 1980-е годы, — рассказал «Известиям» военный историк Дмитрий Болтенков. — Год назад туда была направлена еще «Санкт-Петербург», но она всё это время стоит в Кронштадте. Очевидно, там есть необходимость в новых субмаринах. Они нужны в том числе для обеспечения испытаний надводных кораблей, в частности их противолодочного оборудования. Бывало, для этих целей в акваторию приходилось перегонять лодки Северного флота.

Подводная лодка «Дмитров»

Фото: РИА Новости/Александр Гальперин

По словам эксперта, Северный флот тоже нуждается в новых многоцелевых подводных лодках. Там несут службу несколько субмарин проекта «Варшавянка», которые уже далеко не новые. Но на Балтике этот вопрос стоит острее, отметил Дмитрий Болтенков. В последние годы другие государства региона, в том числе входящие в НАТО, активно развивают свои подводные силы. Поэтому, по его словам, вывести Балтийский флот на новый уровень было бы весьма актуально.

Безвоздушные сложности

Главным достоинством новейших «Лад» разработчиками заявлялась ее передовая ВНЭУ на водородных топливных элементах. С ней подводная лодка могла бы двигаться, не всплывая на поверхность, до трех недель. По этому показателю она приблизилась бы к АПЛ. Но разработка мощной и безопасной ВНЭУ является сложнейшей научно-технической задачей.

В 1950-е годы в России построили около 30 дизель-электрических подводных лодок с замкнутым циклом работы, не требовавших всплытия для подзарядки. Но обеспечить тогда надежность и безопасность энергоустановки не удалось, и от их использования быстро отказались.

Современные «Лады» планировалось оснастить двигателем с электрохимическим генератором разработки ЦКБ МТ «Рубин». Водород планировалось не хранить на борту в баках высокого давления, а вырабатывать из дизельного топлива и кислорода. Такая схема более безопасна и обеспечивает низкий уровень шума. Но разработка двигателя пока не завершена, что привело к задержкам постройки лодок.

В 2019 году сообщалось, что создание ВНЭУ было приостановлено из-за отсутствия финансирования. Но в том же году Минпромторг и «Рубин» подписали новый контракт на продолжение разработки, который планируется завершить к середине 2020-х.

Подводная лодка «Кронштадт» проекта 677 («Лада»)

Фото: РИА Новости/Ирина Мотина

Свою версию воздухонезависимой двигательной установки проектируют и в АО «СПМБМ «Малахит». Там предлагается использовать газотурбинный двигатель замкнутого цикла, который можно задействовать как в надводном, так и в подводном положении.

Мировой тренд

Строительство неядерных лодок, способных неделями оставаться под водой, заметно активизировалось в XXI веке. Сейчас некоторые морские соседи нашей страны уже обладают одной или несколькими субмаринами такого типа. Среди них Турция, Швеция и Япония.

В мире используется сразу несколько технологий ВНЭУ. Но ни одна из них пока не предполагает полного отказа от дизель-электрической установки. Они лишь временно заменяют ее при движении под водой.

Водородные топливные элементы, похожие по принципу действия на перспективный двигатель «Лад», используются на германских подводных лодках проектов 212 и 214. Эти субмарины уже стали популярным экспортным продуктом и производятся для флотов Италии, Норвегии, Турции, Греции и Южной Кореи. Подобный же механизм будет использован на испанских ДЭПЛ типа S-80.

Подводные лодки типа «Сорю»

Фото: wikipedia.org

На шведских лодках типа «Готланд» в роли ВНЭУ применен двигатель Стирлинга. Такую же систему используют японские разработчики на проекте «Сорю». В прошлом году в Японии первыми в мире спустили на воду перспективную ДЭПЛ с литий-ионными аккумуляторами. Легкие и энергоемкие они обеспечивают ей возможность оставаться под водой неделями при поддержании высокой скорости хода.

Быстрый прогресс в аккумуляторных технологиях вызвал начало разработки полностью электрических субмарин. На них можно будет отказаться от установки двигателей внутреннего сгорания. Но пока ни один из таких проектов не реализован.

КХЛ в сезоне 2016-2017: «Лада».

Представляем последнего участника сезона КХЛ-2016/17 от дивизиона Харламова и всей Восточной конференции — тольяттинский клуб «Лада». Автозаводцы, считавшиеся одним из грандов российского хоккея в девяностые, пытаются вернуть утраченные позиции.

Новенькая эмблема «Лады» – с латинской литерой L – как бы намекает на то, что тольяттинцы выходят на мировой уровень. Такие же намеки регулярно озвучивают представители отечественного автопрома. «Волга» – это наш «Мерседес», не иначе. КХЛ же вовсю хочет догнать и перегнать Америку. Посему «Лада» – в популярном тренде.
Проводить «тюнинг» будет тренер с европейскими внешностью, паспортом и психологией, рожденный, однако в Советском Союзе. На берегах Волги латвийские «главные» в моде.

Эмоциональный Скудра заряжает энергией «Торпедо», а нордический Аболс наводит порядок в «Ладе». Неудивительно, что в Тольятти играют два латыша – защитник Сотниекс да вратарь Масальскис, который составит конкуренцию Илье Ежову.

Аболсу, конечно, Масальскис ближе, но, если быть объективным, первым номером «Лады» – и одним из ее лучших игроков – должен стать именно Ежов. Лидерами же в других линиях видятся легионеры – американский защитник Аронсон да шведский центрфорвард Йоханссон.

КХЛ в сезоне 2016-2017. Представление команд. «Лада» (Тольятти)

Год основания: 1976
Домашняя арена: «Лада-Арена» (6 000 зрителей)
Чемпион: 2 (1994, 1996)
Финалист: 4 (1993, 1995, 1997, 2005)
Результаты выступлений в КХЛ: 2014/15 – 24-е место; 2015/16 – 26-е место
Приобретения: в. Ежов (СКА), з. Сотниекс («Динамо» Р), з. Аронсон («Милуоки», АХЛ), з. Корягин, з. Синицын, н. Филатов (все – «Динамо» М), н. Демагин («Северсталь»), н. Йоханссон («Фэрьестад», Швеция), н. Шенфельд («Металлург» Мг)
Потери: в. Касутин («Торпедо»), в. Масальскис, в. Семенов, з. Виклунд («Куньлунь»), з. Д. Воробьев («Салават Юлаев»), з. Паутов (ХК «Сочи»), з. С. Романов («Югра»), з. Путилов («Торпедо», У-К, ВХЛ), з. Флад («Зальцбург», Австрия), н. Гурьянов («Даллас», НХЛ), н. Затович («Брно», Чехия), н. Магогин («Северсталь»), н. Никитенко (завершил карьеру)
Селекция: ***
Лидер: Микаэль Йоханссон
Букмекерский коэффициент на победу в Кубке Гагарина-2017: 101,00 (25-е место)

Ориентировочный состав
Вратари:
33 Илья Ежов
31 Эдгарс Масальскис
77 Алексей Семенов

Правые защитники:
4 Тейлор Аронсон
63 Алексей Волгин
70 Глеб Корягин
44 Дмитрий Синицын

Левые защитники:
81 Кристапс Сотниекс
24 Владимир Маленьких
13 Ефим Гуркин
57 Александр Большаков

Правые нападающие:
29 Александр Бумагин (к)
12 Антон Шенфельд
59 Сергей Демагин
23 Александр Стрельцов
14 Рафаэль Ахметов

Центральные нападающие:
85 Микаэль Йоханссон
21 Антон Крысанов
22 Виктор Комаров
32 Василий Стрельцов
36 Алексей Мастрюков

Левые нападающие:
28 Никита Филатов
18 Георгий Белоусов
71 Станислав Бочаров
19 Семен Валуйский
27 Александр Мокшанцев

Главный тренер: Артис Аболс

LADA Sport подводит итоги года и презентует новый состав команды. Прямой репортаж » LADA Vesta | Лада Веста

Сегодня, 17 декабря 2019 года, компания LADA Sport подведет итоги гоночного сезона 2019 года команды LADA Sport ROSNEFT, которая участвует в раллийных и туринговых гонках различных серий на автомобилях LADA. Также на мероприятии будет представлен новый состав команды LADA Sport ROSNEFT на сезон 2020 года. Как проходила презентация и другие подробности с мероприятия читайте и смотрите в репортаже официального Лада Клуба.

Напомним в сезоне 2019 года команда LADA SPORT ROSNEFT участвовала в следующих соревнованиях: Рождественская гонка (состоится 13 января), ралли (чемпионат России по ралли и монокубок LADA Rally Cup), Российская серия кольцевых гонок (в классах «Туринг», «Супер-Продакшн», «S-1600»), картинг. Для каждого вида гонок были подготовлены разные автомобили LADA и разные составы команд.

В Гонке Чемпионов принимали участие именитые автоспортсмены со всей России. Все они вели борьбу на 170-сильных седанах Лада Веста. В монокубке LADA Rally Cup былаподготовлена новая 160-сильная Гранта, а для ралли — новая Гранта с двигателем мощностью 195 л.с.. Команда LADA SPORT ROSNEFT в раллийных соревнованиях была представлена экипажем в составе Юрий Аршанский (пилот) и Александр Андреев (пилот). В РСКГ в классе S-1600 команда выступила на новых автомобилях LADA Granta R1 с двигателем мощностью 155 л.с.. Состав команды: Михаил Митяев и Владимир Шешенин. В классе «Супер-продакшн» в РСКГ пилоты команды LADA SPORT ROSNEFT Владислав Незванкин и Юрий Петухов сражались на автомобилях LADA Vesta 1.6Т с 225-сильным мотором. В классе «Туринг» пилоты Кирилл Ладыгин и Михаил Грачев выступили на 350-сильных Вестах. В картинговых соревнованиях команду LADA SPORT ROSNEFT представили 10 пилотов.

Кроме того, АВТОВАЗ в сезоне 2019 года дал возможность журналистам ведущих автомобильных СМИ лично протестировать гоночные Весты. Для этого был организован «Кубок журналистов». Первое место в соревнованиях оказалось у Максима Ахтямова, представляющего портал drive.ru, второе место у главного редактора журнала «Авторевю», а третье место у главного редактора АвтоMail.ru Юрия Урюкова. Как проходил «Кубок журналистов» можно прочитать здесь — http://www.ladavesta.net/news/1202-lada-vesta-sport-bitva-zhurnalistov-na-170-silnyh-vestah.-onlayn-reportazh.html

На подведение итогов сезона 2019 года и презентацию команды LADA SPORT ROSNEFT собрались руководство компаний LADA SPORT и АВТОВАЗа, представители СМИ и автоспортсмены. Также на мероприятии присутствует представитель официального Лада Клуба Павел Атрощенко.

Свой репортаж готовит корпоративный канал ВАЗ-ТВ. Сюжет в прямой эфир выйдет только завтра.

Само мероприятие организаторы решили провести непосредственно на производстве LADA SPORT. Именно здесь создаются и выпускаются мелкими сериями спортивные версии автомобилей LADA для общих дорог и гоночные болиды LADA.

Поэтому в преддверии презентации мы успели немного пройтись по цеху и посмотреть как собирают спортивные LADA. Все очень чисто и аккуратно. Более того, сразу видно, что здесь следят за качеством.


Здесь же на производственной площадке выставлены гоночные автомобили LADA. Причем все эти автомобили принимали участие в нынешнем гоночном сезоне.

На импровизированной сцене начинается подведение итогов прошедшего сезона.

Сначала всем присутствующим показали итоговое видео об участии команды LADA SPORT ROSNEFT в гонках.

Далее началось чествование участников гонок. Сначала награды вручили картингистам команды LADA SPORT ROSNEFT.


Теперь на сцену вышли участники «Кубка журналистов». Награды вручает Сергей Ильинский.

На сцене пилоты монокубка LADA Rally Cup.

Самому быстрому раллисту подарили автомобиль Лада Веста Спорт.

Далее награждают пилотов Российской серии кольцевых гонок (РСКГ). Сначала на сцену вышли пилоты, выступавшие в классе «S-1600» Михаил Митяев и Владимир Шешенин. Награды им вручил Фабьен Гульми.

В классе «Супер Продакшн» команду LADA SPORT ROSNEFT защищали Владислав Незванкин и Андрей Петухов. Награды им вручил главный дизайнер LADA Стив Маттин.

Маттин отметил, что в этом году суммарно пилоты команды LADA SPORT ROSNEFT завоевали 100 подиумов. Главный дизайнер поблагодарил спортсменов за столь высокий результат и пожелал дальнейших успехов в автоспорте.

В классе «Туринг» команду LADA SPORT ROSNEFT защищали Кирилл Ладыгин и Михаил Митяев.

За достижения в автоспорте Фабьен Гульми вручил ветеранам автоспорта ключи от автомобилей Лада Веста. Автомобили достались Ладыгину, Шешенину, Воронову, Панфиловву, Митяеву и Петухову.


Призовые автомобили находятся здесь же. Спортсмены не преминули сфотографироваться на фоне своих именных машин.

Представлена команда LADA SPORT ROSNEFT на сезон 2020 года.

В РСКГ команда LADA SPORT ROSNEFT будет представлена:
Класс «Туринг»
автомобиль: Lada Vesta
пилоты: Кирилл Ладыгин и Михаил Митяев

Класс «Супер-продакшн»
автомобиль: Lada Vesta
пилоты: Андрей Петухов и Владислав Незванкин

Класс «Туринг-лайт»
автомобиль: Lada Granta
пилоты: Владимир Шешенин и Леонид Панфилов (дебютант)

В раллийных гонках команду представят Воронов, Еникеев.

В соревнованиях по картингу цвета команды будут защищать Панфилов, Шепет, Примак, Незванкин, Орлов, Северюхин, Мозин.

Фото на память со Стивом Маттином.

Общее фото пилотов команды LADA SPORT ROSNEFT.

Памятное фото с чемпионов Ледовых гонок.

Награждают стариков автоспорта


Фото с Леонидом Панфиловым.

Фото с Владимиром Шешениным.

Фото с бывшим главредом Авто mail.ru, одним из тройки победителей гонки журналистов Юрием Урюковым.

На этом официальная часть мероприятия завершилась.

Новость обновляется.

Кузовной ремонт в Казани – КАН АВТО

Кузовной ремонт автомобиля подразумевает работы, целью которых является восстановление внешнего вида и геометрических параметров кузова, а также лакокрасочного покрытия. В ходе этих работ устраняются даже небольшие внешние дефекты — царапины, сколы. В состав группы компаний КАН АВТО входят четыре центра кузовного ремонта: один из них, площадью 6 500 кв. м., крупнейший в Поволжье.

Виды кузовных работ

Существует несколько разновидностей ремонта кузовной части. Работы по реставрации внешнего вида автомобиля:

  • Восстановление геометрии кузова. Это сложная процедура, требующая тщательного анализа нарушенных геометрических показателей кузова. Если поврежденные элементы не подлежат восстановлению, их заменяют новыми деталями, используя резку и сварку.
  • Рихтовка. Так называется удаление локальных вмятин путем вытягивания, которое производится с помощью специальных приспособлений, таких как контропоры, молотки для рихтовки и вытягивания и т. д. Используется в случае, когда степень повреждения кузовного элемента позволяет обойтись без его замены.
  • Абразивная полировка. Эту манипуляцию с применением абразивов крупной и средней зернистости выполняют в случае повреждения ЛКП, частично снимая краску и шпатлевку, выравнивая поверхность и подготавливая ее к дальнейшим работам.
  • Покраска. Одним из ее главных нюансов является колеровка — подбор цвета кузовной эмали таким образом, чтобы вновь окрашенный участок не выделялся на общем фоне.
  • Полировка. Выполняется для сглаживания мест перехода после частичной покраски, а также для придания блеска потускневшей поверхности. Манипуляция производится с помощью полировочной машинки и мелкозернистых паст.

Кузовные работы требуют опыта, профессионального подхода и наличия специального оборудования. Не стоит выполнять самостоятельно без должных навыков и инструментов, иначе проблему можно усугубить. Цены на ремонт кузова автомобиля зависят от характера и степени повреждений, а также от необходимых восстановительных работ.

Этапы ремонта кузова в КАН АВТО

Сложный кузовной ремонт авто проводится в несколько этапов:

  1. Арматурные работы. В перечень работ входят:

    • разборка поврежденной части кузова;
    • дефектовка кузовных элементов;
    • составление перечня нужных запчастей и расходников.

    Арматурщиками используются специальные инструменты, в том числе пневматические ножи, обеспечивающие высокую точность резки.

  2. Жестяные работы. На этом этапе мастера полностью восстанавливают геометрию кузова, удаляют сколы, выправляют вмятины и перекосы. От качества работы жестянщиков во многом зависит правильность траектории движения отремонтированного автомобиля.
  3. Подготовка к покраске. В процессе подготовительных работ снимают старую краску, покрывают детали шпатлевкой, обрабатывают абразивами разной зернистости. Для защиты от коррозии элементы грунтуют.
  4. Покраска — заключительный этап ремонта кузова автомобиля. Цели покраски:

    • защита кузовной части от вредных воздействий;
    • привлекательный экстерьер.

    Работники центров кузовного ремонта КАН АВТО, расположенных в Казани, качественно выполнят работы любой сложности. Адреса ЦКР указаны в разделе «Контакты». Запишитесь по телефону или оставьте заявку на сайте.

    Ориентировочные цены указаны в прайсе, окончательная стоимость услуг будет названа после полного осмотра транспортного средства и составления перечня необходимых кузовных работ.

«Это будет очень тяжелая Олимпиада. Нам в лицо улыбаются, а у самих камень за пазухой»

С женской сборной России по гандболу Евгений Трефилов выиграл четыре чемпионата мира и Олимпиаду в Рио-де-Жанейро. Однако на Играх в Токио нашей командой будет руководить другой наставник. Трефилов отправляется туда в непривычной для себя роли.

— Евгений Васильевич, как вы себя чувствуете в роли тренера-консультанта?

— Никак. Странное чувство. Непривычно мне это. Еду на Игры в Токио, но буду жить отдельно от команды.

— Почему?

— Квоты такие. Например, федерация хотела включить в состав сборной еще одного массажиста, но нам не разрешили. Я аккредитован на Олимпиаде как вице-президент ФГР.

— Раньше вы мне говорили, что врачи запрещают вам ехать в Японию. На дворе — пандемия коронавируса, а у вас была операция на сердце…

— Я перенес за свою жизнь не одну операцию, а несколько. Через какую дырку может пролезть ко мне этот коронавирус — одному Богу известно. Может, завтра упаду на крыльце дома и не встану. Но сидеть без дела не привык. Мне скучно. Поэтому решил лететь в Токио. В Москве сдам три теста на коронавирус.

— Когда вылетаете в столицу Японии?

— Точную дату пока не знаю. Сначала мы с Сергеем Николаевичем Шишкаревым, (президент Федерации гандбола России — прим. Sportbox.ru) приедем в Новороссийск — на открытие нового зернового причала. Оттуда отправимся в Абрау-Дюрсо…

— Неужели на дегустацию шампанских вин?

— Нет, дегустировать ничего не будем! Я не по этому делу. Когда-то в юности так сильно перебрал, что мне было плохо. Помню, подумал: только бы мама не увидела меня в таком состоянии. Стыдно стало. С тех пор мало пью, знаю свою меру… В Абрау-Дюрсо новый спортивный комплекс построили. Опять же мы едем открывать. В общем, из Краснодарского края полетим в Москву, а потом — в Токио.

— В составе нынешней сборной России — восемь олимпийских чемпионок Рио. Это хорошо или плохо? Не затянулся ли процесс смены поколений?

— Выбор состава — прерогатива главного тренера. Он отвечает за результат, а я могу только посоветовать. Но, если честно, включил бы в состав двух-трех других спортсменок. Однако я — консультант и вмешиваться в работу Алексеева не хочу.

Открыть видео

—  Какие у вас отношения с Алексеем Александровичем?

— Он был моим помощником в сборной, мы работали вместе. Два года назад, когда я ушел из команды (сердечко стало шалить), Алексеев остался. Он помогал испанцу Амбросу Мартину. А когда Мартина сняли, то занял его место. Отношения с Алексеем у меня рабочие. Я по-другому строил учебно-тренировочный процесс, по-другому вел игру команды, но это нормально. Конечно, подмывает вставить свои пять копеек. Но молчу. Даже не поехал на предолимпийский сбор в Сочи.

— Почему?

— Чтобы не маячить, как говорил Высоцкий. Не мешать. В сборной должен быть один главный тренер. А то девчонки могут ориентир потерять. Помню, как в далеком 1982 году сборная СССР по футболу играла на чемпионате мира в Испании. Бесков там был главным тренером, а ему в подмогу навязали еще двоих — Лобановского и Ахалкаци. Каждый из троих тянул одеяло на себя. Получился Змей Горыныч трехглавый. В команде группировки возникли, обиды. В общем, ничего хорошего не вышло. Учтите, что у нас женский коллектив, а это — особая статья. Работать тренером с женщинами — это все равно что подложить под себя гранату и выдернуть чеку. Мы только потеем с ними одинаково, а в остальном — совершенно разные люди.

—  В двух контрольных матчах перед Олимпиадой сборная России проиграла Нидерландам и Швеции. Вас такой факт не настораживает?

— Не надо придавать двум этим поражениям большого значения. Лучше проиграть в товарищеских матчах, чем на Олимпиаде. В Голландии Лена Михайличенко играла после тяжелейшей травмы — у нее до этого колено было развалено. Я как-то Лену назвал «сопля зеленая», и она запомнила. Ну, а что, Михайличенко еще и 20 лет нет, у нее все впереди. В спорте самое страшное — это испытание славой. После Рио-де-Жанейро наши девчонки слегка зазнались. И что? На Европе через два года стали вторыми.

— Серебряные медали — разве это плохо?

— Мне хотелось золота.

Открыть видео

— На что реально можно рассчитывать в Токио?

— Скажу осторожно: на удачное выступление. Не забывайте, у наших спортсменов отобрали флаг и гимн. Плюс ковидные ограничения. Это будет очень тяжелая Олимпиада. Нам в лицо улыбаются, а у самих камень за пазухой. Будет и предвзятое отношение. Я понимаю, что любить Россию никто не обязан. Главное — чтоб не вредили.

— Фаворит № 1 в женском гандболе — сборная Норвегии?

— Да. Норвежки очень сильны. Францию и Голландию я бы тоже отнес к числу фаворитов. И еще сборную Швеции. Впрочем, настраиваться надо на любого соперника. Чуть дашь слабину — тебя сожрут.

— Вам хочется вернуться на тренерский мостик?

— Конечно. Лукавить не буду. Но понимаю, что здоровье уже не то. Надо давать дорогу молодым. Меня сейчас вот что волнует. У нас из Краснодара, где я работаю, забрали несколько перспективных девчонок. Им по 13-15 лет. Родители мне нагло врали. Обманули. Сказали, что их дочки решили завязать с гандболом. А потом узнал, что эти девочки спокойно тренируются, только в другом городе — в Астрахани. Их просто переманили, а родителям посулили финансовую выгоду. Вот что с этим делать — не знаю. Люди стали повернуты на деньгах, а порядочность и честность как-то незаметно уходят в прошлое.  

Общие сведения о ладах и износе ладов


Рис. 1. Измерение лада на ширину короны (А) и высота (B), а также размер зазубрины (C) и глубиной хвостовик (D).
Рис. 2. Вмятины и ямки на ладу. Причины. проблемы с интонацией, создает дребезжание струн, препятствует плавным изгибам струны.
Рис.3. Плоский лад также создает хрип и интонацию. проблемы.
Рис. 4. Восстановление лада с помощью специализированный инструмент.
Фиг.5. Полный перерыв. дает гитаре новую жизнь.

От состояния ваших ладов будет зависеть как хорошо играет твоя гитара. Каждый раз, когда вы прижимаете струны к лады, трение между ними тонко изменяет форму ладов, вызывая их изнашивать. Со временем этот контакт металла с металлом может привести к образованию струны. погремушка и интонация. Величайший повреждение ладов вызвано капо, особенно под простые струны.

Износ ладов является обычным побочным продуктом играть на вашем инструменте.Как гитарист это важно уметь оценивать лад Повреди и пойми какие варианты ты придется это исправить. Большой вопрос, может ли Я ремонтирую лады или пора заменить их? Давайте исследуем тему, начиная с сам провод.

Из чего сделаны лады? Хотя на ладони часто называют «никелевым серебром», это не на самом деле содержат серебро. Скорее, это обычно состоит из 18 процентов никеля, 80 процентов медь и небольшое количество других материалы, такие как цинк, свинец и кадмий.Действительно Хорошая проволока для ладов содержит больше цинка и меньше меди. Один из моих любимых брендов — Jescar, и их Формула NS — 62 процента меди, 18 процентов. никель и 20 процентов цинка. Потому что это сложнее чем традиционный лад, он служит дольше.

Другой вариант — нержавеющая сталь. Нержавеющая со сталью очень сложно работать, но она длится значительно дольше, чем традиционные ладонь. Однако лады из нержавеющей стали бывают с здоровенным ценником. Большинство мастеров заряжать более чем вдвое, чтобы перезарядить гитару нержавеющей сталью, потому что она почти разрушает их инструменты и работа занимает намного больше времени делать.В конечном итоге это может быть идеальный решение для вашей гитары, так как вы можете больше никогда не придется менять лады!

Каковы размеры ладов? Fretwire входит в разнообразие размеров и форм. Рис. 1 иллюстрирует четыре элемента, которые определяют конкретный стиль ладов. Они шириной и высота короны , размер зубца , и глубина хвостовика .

Заводная головка — это открытая часть беспокойствоКогда вы волнуете ноту, вы нажимаете шнурок до самого верха короны. Нравиться ряд крючков, зубцов прикрепляют лад к гриф. Ширина зазубрины определяет ширину лада и тангажа определяет глубина ладовой прорези, т. е. насколько далеко лада проникает в гриф.

Размер и форма каждого из них четыре элемента специально разработаны для разных игровых предпочтений и типов гитары. Ширина короны может варьироваться от от сверхузкого (0,053 дюйма) до сверхвысокого размера (.118 дюймов). Высота лада может быть любой. от короткого 0,032 дюйма до высокого 0,060 дюйма. В ширина зубцов и глубина хвостовика также варьируются от 0,019 дюйма до 0,040 дюйма.

Все эти размеры имеют конкретное назначение и являются важными соображениями, когда выбирая лады. Например, более широкие лады могут производить более сильный тон, но поскольку они износ, интонация гитары «смещается» дальше чем с узкими ладами. Но узкая проволока имеет его недостатки тоже: узкие лады не вызывают ваша интонация так сильно дрейфует, но они изнашиваются быстрее широких ладов.

Высокие лады прослужат дольше, чем они потребуются. подлежит замене. Однако я не рекомендую их для тех, кто играет с крепкий хват. Если крепко сжимать шею во время игры или использования каподастра струны будут тяните резко во время игры. С другой стороны, более короткие лады изнашиваются быстрее (особенно если вы используете каподастр) и его нужно заменить чаще.

Размер зазубрин и хвостовика сильное воздействие на гриф гитары, и если вы решили установить новые лады, это очень важно использовать правильный размер.Если зазубрины и хвост слишком узкие или неглубокие для прорезей лады не будут надежно сидеть в грифе. Это заставляет их поднимать выходить, когда погода меняется и дает неровные лады и много шумных или мертвых заметки. Когда зазубрины и запах тоже широкие, они могут треснуть и расколоть гриф, или даже заставить шею изгибаться назад. В случае заднего лука вам придется повторно ладить гитара.

Подведем итог: шея должна иметь лады правильного размера, подходящие под размер грифа и игрок.В противном случае вы получите очень дорогой бардак!

Можно ли отремонтировать вмятины на ладах? Вмятины всегда создают проблемы с ладами. Но означает ли обнаружение вмятин, что вам нужно заменить лады или перекроить вариант?

Это может произойти в любом случае, и ответ зависит от глубины вмятины. Когда вмятины глубокие, ваша техника должна быть удалите слишком много материала с все лады правильно отремонтировать проблемные. Когда высота ладов ниже.038 «и это имеет глубокие ямки и вмятины, есть вероятность повторного лада в порядке.

Посмотрите на Рис. 2 и обратите внимание на глубокие ямки. в этих ладах. Эти вмятины слишком глубоки, чтобы ремонт, поэтому лады необходимо заменить.

Вмятины и ямки — не единственная причина заменить лады. Плоские места на ладьях еще один виновник. Чтобы лад работал правильно, у него должна быть куполообразная корона. Если корона плоская, как в Рис. 3 , это приведет к тому, что погремушка и интонация. Как вмятины и ямки, если лад имеет плоскую коронку и слишком короткий, его нужно будет заменить.

Если лады достаточно высокие, чтобы их можно было отремонтировать, они сначала выравниваются, а затем повторно увенчаются. Чтобы уравновесить раздражение, ваша техника измельчает и пескоструит лады на одинаковую высоту. Это оставляет лады с плоской коронкой. Следующий шаг состоит в том, чтобы заново увенчать лад, удалив материал с его сторон, пока корона не предложит узкое место контакта струны Рис. 4 . Это очень кропотливый процесс, и требуются годы практики для разработки правильного навыки — определенно работа для профессионала.

Что значит перезарядка? В новом ладу, заменены все лады в грифе.Процесс очень точный и требует дорогие инструменты и большое мастерство. Основа шаги включают разборку гитары, удаление всех старых ладов, строгание грифа, закругление грифа, очистка прорези для ладов, установка новых ладов и затем выравнивание и повторная коронка, чистка грифа и полировки ладов, и, наконец, сборка гитары Рис. 5 .

И это лишь базовый обзор процесс. Есть еще много, еще много шагов — достаточно, чтобы заполнить всю книгу.Перетяжка — дело дорогое и трудоемкое, но в целом стоит своих затрат.

На протяжении многих лет у меня были клиенты, которые заменить старую шейку с болтовым креплением на новый, вместо того, чтобы делать выбор в пользу повторения лада. Это может быть отличным выбором, но будьте осторожны — почти каждый новый гриф требует уровня лада. и коронация. Большинство заводов по производству гитарных деталей не тратьте время на то, чтобы мастер убедитесь, что лады выровнены. Так что оставайся в помните, что к тому времени, когда вы заплатите за новый шею и дополнительную резьбу, вы могли переработали оригинальную шею и некоторые остатки сдачи!

А как насчет частичного рефрета? Иногда просто заменяя несколько ладов, а не все они, выполняет свою работу.Обычно это предпочтительнее для шеи, есть износ только на первых шести или семи ладах и имеет ровный гриф. Если гриф в хорошем состоянии и остальные лады достаточно высоки, частичный рефрет — отличный способ сэкономить деньги. Не все гитары подходят для этой операции. Если на грифе есть крутите или махайте в нем, требуется полный перебор ладов.

Capo — это четырехбуквенное слово. Каподастр злейший враг раздражения. Конечно я люблю капо, потому что я люблю лепить! Если нет один использовал капо, мой доход от лепнины упадет как минимум на 60 процентов.Чем больше вы используете каподастр, тем больше вреда он наносит лады. Когда каподастр сжимает струны, он разбивает струны в лады и намного сложнее, чем если бы вы играли аккорд. В результате лады начинают сплющиваться и образовывать ямки и вмятины. Это здорово новости для гитарного техника, но не очень хорошие для игрок.

Чтобы избежать ненужного «наложения капо» повреждение ладони, я предлагаю вам использовать каподастр с регулировка натяжения. Многие капо просто прижать струны к грифу не предлагая способа отрегулировать натяжение.Если вы используете каподастр с натяжением регулировки, вы можете зажать устройство с помощью достаточно силы, чтобы предотвратить дребезжание струн, еще уменьшить дополнительный износ ладов.

Еще одно большое преимущество использования каподастра с регулируемым натяжением зажима: помочь избежать проблем с настройкой по сравнению с нерегулируемым капо. Есть несколько отличных капо на рынке, которые уменьшат беспокойство повреждения и проблемы с настройкой, в том числе Planet Waves Dual Action Capo и все такое различные модели Шубба. Если ваш каподастр не предлагает регулировку натяжения, купить тот, который делает.Это сэкономит вам массу деньги в резьбе.


Джон Леван, гитарный техник в Нэшвилле, написал пять книг по ремонту гитар, все опубликовано Мел Бэй. Его бестселлер, гитара Уход, установка и обслуживание , подробно гид с нападающим Бобом Тейлором. Леван приветствует вопросы о своей колонке PG или книги. Напишите письмо на адрес guitarservices@aol.com или посетите сайт guitarservices.com, чтобы узнать больше. информация о его мастерских по ремонту гитар.

Школа гитарного оборудования: Лады II

Лады медные

Хорошая, старомодная медь использовалась и до сих пор используется для изготовления ладов.Многие винтажные инструменты будут поставляться с медными ладами, и даже сегодня такие производители, как Warwick, иногда используют медные лады в своих инструментах.

Латунь — это сплав меди и цинка, и, как и следовало ожидать, эти лады имеют «медный» цвет. Лады из латуни не самые твердые в мире и изнашиваются быстрее, чем другие проволоки.

Лады из никелевого серебра

Первое предложение , каждое из вещей, когда-либо написанных о никелевом серебре, всегда будет напоминать вам, что на самом деле оно не содержит серебра.Нейзильбер — это медный сплав, по сути, это латунь (медь и цинк) с добавлением никеля для повышения твердости. Этого никеля достаточно, чтобы сместить цвет латуни в сторону знакомых нам ладов серебристого цвета. Количество никеля определяет, насколько твердым будет лад. Большинство гитар оснащены ладами с содержанием никеля 18%, хотя можно получить и проволоку с содержанием никеля 12%. Последний используется сравнительно редко.

Нейзильберные лады настолько распространены, что мне, наверное, не нужно много о них говорить.Возьмите гитару или бас, и это почти наверняка то, что в них установлено.

Лады из нержавеющей стали

Hard. Действительно, очень сложно. Лады из нержавеющей стали действительно чертовски твердые.

Хотя это не совсем обычное дело, я вижу небольшое увеличение количества нержавеющих ладов и запросов на них. Поскольку они такие прочные, они очень хорошо носятся и служат долго. Если вы агрессивный музыкант, который не любит лады, лады из нержавеющей стали могут реже видеть вас в гостях у меня для рефрета.

При этом работать с ладами из нержавеющей стали невероятно сложно. Их сложно установить, и они требуют больших затрат на инструменты. При ремонте нержавеющей стали я обычно заменяю инструменты, испорченные проволокой. По этим причинам нержавеющая сталь немного дороже «стандартной» арматуры.

Evo Frets

Bling. Лады Evo золотые. На всем протяжении — это не просто покрытие. Проволока Evo, как и латунь и нейзильбер, представляет собой медный сплав. Если у вас есть одна из этих занавесок для душа с периодической таблицей, вы легко разберете ее состав: CuSnFe1Ti.Для тех, кто не обратил внимания на естественных науках, это медь, олово, железо и титан.

По шкале твердости Evo занимает промежуточное положение между мельхиоровым серебром и нержавеющей сталью. Это может быть хорошим компромиссом, так как с ним немного легче работать и, следовательно, он немного дешевле, чем нержавеющая сталь. Однако его золотой цвет не всем придется по вкусу (хотя он может отлично смотреться на правильной гитаре).

Влияние материала лада на тон

Бла, бла, бла… Тон субъективен… Бла, бла.

Теперь, разобравшись с этим, вот общепринятая мудрость:

Лады из латуни, как правило, имеют твердый, теплый тон, в то время как лады из нержавеющей стали могут добавить немного яркости и, возможно, небольшое увеличение сустейна. Никелевое серебро, вы знаете, обычно это середина пути между латунью и нержавеющей сталью. Проволока для ладов EVO находится где-то между мельхиоровым серебром и нержавеющей сталью в спектре тонов.

Мое собственное мнение? Я пришел к выводу, что любое изменение вашего тона из-за различных ладовых материалов — если оно вообще существует — является чрезвычайно тонким (великолепный оксюморон).Я поменял много ладов и лично не думаю, что смогу заметить разницу в звуке.

Если вы можете, отлично, но я должен выделить тонкий на этом. Не ждите резких сдвигов в тоне.

Итог: стоит ли обновляться?

Как я уже упоминал в статье о размере ладов, если ваши лады достаточно изношены, чтобы потребовать повторного ремонта, вы можете подумать о материалах.

Лично я бы не рекомендовал менять ладовый материал исключительно для изменения вашего тона, поскольку изменения не будут очень заметными.На самом деле, увеличение твердости / срока службы — основная причина рассмотреть возможность внесения изменений.

И, тем не менее, на мой взгляд, нержавеющая сталь — это перебор для большинства плееров (и следует учитывать увеличение стоимости установки). Если вы действительно быстро изнашиваете лады , это может быть оправдано, но есть причина, по которой никель-серебро используется по умолчанию практически на каждой сделанной гитаре — для большинства людей это совершенно нормально.

Evo wire может обеспечить золотую середину, которая является износостойкой, а не довольно такой дорогой, как нержавеющая сталь, но некоторым не нравится цвет (хотя именно по этой причине другие выбирают Evo).

Итог: если у вас нет особой причины менять материалы, можно использовать мельхиор.

Проволока для ладов Jescar — Jescar

Доступно множество различных профилей ладовой проволоки, от маленького до большого, от низкого до высокого, от узкого до широкого, от овального до круглого и треугольного, все это влияет на игровые характеристики и ощущение инструмента. Медные лады прошлых лет уступили место стандартному материалу сегодняшнего дня, 18% -ному нейзеру, также называемому «немецкое серебро».Но даже с 18% -ным никелевым серебром существуют различия в твердости, прочности на разрыв, качестве поверхности, размере зерна и других металлургических свойствах, которые влияют на качество лада, его характеристики и ощущение. Помимо 18% нейзильбера, в производстве современной струны для ладов были использованы новые сплавы, которые значительно улучшили характеристики и эстетику гитары.
Для того, чтобы такое ощущение и качество оставались на долгое время, жизненно важно использовать проволоку для ладов из соответствующего сплава и твердости, чтобы избежать преждевременного износа.Изнашивание ладов приводит к гудению, плохой интонации и ухудшению чувствительности грифа. В результате возникает необходимость в выравнивании и правке или даже в расходах на замену лада. Преждевременного износа можно избежать с помощью качественной проволоки для ладов, а лады из нержавеющей стали полностью исключены.

С линейкой высококачественной гитарной струны Jescar профессионального уровня, мы предлагаем мастерам и исполнителям следующие преимущества:

  • Идеальная формовка проволоки любого размера по всей длине бухты
  • Строгий контроль качества прочности на разрыв, твердости, размеров и состава
  • Точная симметрия профиля с центрированными и перпендикулярными выступами
  • Зубцы с острыми четко очерченными кончиками, которые входят в прорези ладов и остаются надежно закрепленными.
  • Допуски с точностью +/- 0,002 ″
  • Качество поверхности Superfinish для яркого внешнего вида и гладкости
  • Повышенная твердость и более плотная структура зерна для увеличения срока службы и удобства игры
  • Доступен с традиционным 18% -ным никелевым серебром, нержавеющей сталью и золотым сплавом EVOgold ™
  • Служба поддержки клиентов, ориентированная на полное удовлетворение потребностей клиентов

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) — Общие понятия

Вводные понятия

Точное расположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений.Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определяемого критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0,2 микрометра). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением. Метод резонансного переноса энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специализированные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.Флуоресцентный резонансный перенос энергии — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии ко второму хромофору в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен примерно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему акцепторному хромофору без излучения за счет диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии не чувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем эффекты растворителя на коротких расстояниях, а диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая в первую очередь зависит от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредуется испусканием фотонов, и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора.Следовательно, измерения FRET можно использовать в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансной передачи энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (a)) два флуорофоров разделены расстоянием приблизительно 12 нанометров, слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами.Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET. На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (рисунок 1 (b)) представлена ​​зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка.Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между участками макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В экспериментах этого типа степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя резонансный перенос энергии флуоресценции часто использовался для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белки с соответствующими флуорофорами.Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в самых разных типах клеток стали критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках. Было разработано несколько вариантов мутаций этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET.Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков. Если два белка, один из которых помечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса при максимальной длине волны поглощения будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцептора (GFP) флуоресценции.

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, оптики микроскопов и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках. В дополнение к изучению взаимодействий белковых партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения ближайшему хромофору, акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь.Теория, предложенная Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фёрстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не предполагает выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается повышенное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3).Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора. Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между излучением донора и поглощением акцептора при резонансном переносе энергии флуоресценции.Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3).Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, необходимо выполнить несколько критериев. В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фёрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между донорными и акцепторными молекулами уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их.Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор приблизительно 10 нанометров. На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий.В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансной передачи энергии является то, что время жизни флуоресценции молекулы-донора должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти. Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.Согласно теории Фёрстера и подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

KT = (1 / τD) • [R0 / r] 6

, где R (0) — критическое значение Фёрстера расстояние , τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры. Критическое расстояние Фёрстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора.Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фёрстера — это максимальное расстояние между донорными и акцепторными молекулами, при котором все еще будет происходить резонансная передача энергии.Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц. Значение R (0) (в нанометрах) может быть вычислено из следующего выражения:

R0 = 2,11 × 10-2 • [

κ

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в которой κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет собой показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) вычисляется как:

ET = 1 — (τDA / τD)

где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения для обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь, зависит от κ -квадрат, J (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неточности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET
Донор Акцептор Расстояние Ферстера (нанометры)
Триптофан Дансил 2.1
ИАЭДАНЫ (1) ДДПМ (2) 2,5 — 2,9
BFP DsRFP 3,1 — 3,3
Дансил FITC 3,3 — 4,1
Дансил Октадецилродамин 4.3
CFP GFP 4.7 — 4,9
CF (3) Техасский красный 5.1
Флуоресцеин Тетраметилродамин 4,9 — 5,5
Cy3 Cy5 > 5,0
GFP YFP 5,5 — 5,7
BODIPY FL (4) BODIPY FL (4) 5.7
Родамин 6G Малахитовый зеленый 6.1
FITC Эозин тиосемикарбазид 6,1 — 6,4
B-фикоэритрин Cy5 7.2
Cy5 Cy5.5 > 8,0

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорно.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора посредством вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может находиться в диапазоне от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит к изменению рассчитанного расстояния только на 26 процентов, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для отклонения в квадрате κ . Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния, возможно, до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если вообще возможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием методов резонансной спектроскопии переноса энергии и дифракции рентгеновских лучей в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предлагается теорией Ферстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Большая неопределенность существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадратов требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, а это условие вряд ли будет достигнуто.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность из-за фактора ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ -квадрат) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

κ

2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

где θ (T) — угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A) — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, который может быть определен FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни распада флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии по механизму Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрических форм и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой прямой или инвертированный микроскоп можно дооснастить для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть объединены с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами визуализации с флуоресцентным резонансным переносом энергии, представлена ​​на Рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культивирования тканей оснащен стандартной вольфрамово-галогенной лампой на столбе для исследования и записи. ячейки, использующие стандартное светлое поле, фазово-контрастное или дифференциально-интерференционное ( DIC ) освещение.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа крепится стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье, обеспечивающая широкополосную флуоресценцию и получение изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального освещения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

  • Концентрации донорных и акцепторных флуорофоров должны тщательно контролироваться. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
  • Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
  • Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
  • Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
  • Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
  • Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
  • Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
  • Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
  • При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
  • Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть присоединены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
  • Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Чтобы феномен флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставил значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается сопутствующим уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансного переноса энергии, обычный подход заключается в использовании отношения двух значений, I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между донорно-акцепторными парами и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным гашением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется установившимся режимом флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны в пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (а)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками.

Среди факторов, которые потенциально могут повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может происходить самотушение, что влияет на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные доказательства, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях метод фотообесцвечивания доноров менее сложен, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение в тушении излучения донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод коррекции обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентной резонансной передаче энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра эмиссии акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал эмиссии донора (нежелательные длины волн) проходит через эмиссионный фильтр.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая излучения донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением , которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение средней продолжительности жизни, когда они записываются как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут иметь различное время жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресценции, классифицируются как во временной области ( импульсный , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется из фазового сдвига и глубины демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной областей для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями флуоресцентного резонансного переноса энергии являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки с помощью множества биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни донора в возбужденном состоянии, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся режиме. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Несмотря на то, что существуют различные методы измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись с трудом, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers and Michael W.Davidson — Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии — обзор

3.1.3.1.2 Флуоресцентная спектроскопия

Общие принципы объяснения флуоресцентной спектроскопии здесь не приводятся. Его можно найти в специальных учебниках [48], и его краткое изложение представлено на рис. 3.17.

Рисунок 3.17. Общий принцип флуоресцентной спектроскопии.(A) Представление основных переходов между двумя синглетными состояниями молекулы. На остальной части этого рисунка синяя и зеленая стрелки (темно-серая и серая стрелка в печатных версиях) представляют собой поглощение света и его излучение за счет флуоресценции, соответственно. Оранжевая стрелка (светло-серая стрелка в печатных версиях) представляет релаксацию энергии за счет безызлучательных процессов. Для простоты теоретически запрещенный переход в более низкоэнергетическое триплетное состояние «T» не был представлен, но он лежит в основе излучения фосфоресценции.(B) Схематическое изображение флуоресцентного спектрофотометра. (C) Химическая структура и абсорбция (синяя кривая (темно-серая в печатных версиях)) — эмиссионные (зеленая кривая (серая в печатных версиях)) спектры флуоресцеина.

Наиболее распространенными флуоресцентными фрагментами являются органические флуорофоры (кумарины, флуоресцеины, родамины, оксазины и цианины в порядке увеличения длины волны флуоресцентного излучения), хелаты лантаноидов или флуоресцентные наночастицы (см. Главу 6.9).

Два наиболее интересных аспекта для целей этой книги состоят в измерении динамической релаксации светового излучения, позволяющем определять характерные времена жизни флуоресценции, и в определении расстояния между двумя флуорофорами (наложенными на одном или двух различных молекул), используя эффект резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

FRET обычно предназначен для определения расстояния (а также ориентации) между флуоресцентным донором ( D ) и акцептором ( A ). Эффективность безызлучательной передачи энергии между D и A зависит от следующего:

1.

Относительная ориентация D и A , которые рассматриваются как диполи

2.

Степень перекрытия спектров между спектром излучения флуоресценции D и спектром поглощения A

3.

Расстояние r между D и A

Если спектральное перекрытие между флуоресценцией D и поглощением A равно нулю, передачи энергии не будет, даже если D и A очень близки. Если есть спектральное перекрытие, то передача энергии масштабируется как величина, обратная шестой степени , что типично для диполь-дипольных взаимодействий между небольшими молекулами (см. Главу 2.1). Тогда эффективность передачи энергии определяется как

(3.34) E = R06R06 + r6

В этом уравнении R 0 — это критическое расстояние, на котором эффективность передачи энергии снижается до 50% от максимальное значение при r = 0.

В теории Ферстера R 0 пропорционально квантовому выходу донора ( ϕ ) и интегралу спектрального перекрытия, Дж, , между излучениями. спектр D и спектр поглощения A :

(3.35) R0 = (8,8 × 10-25) · K2 · ϕ · Jn4

, где K учитывает взаимную ориентацию D и A . n — показатель преломления используемого растворителя.

Перед проведением экспериментов FRET с определенной молекулярной системой необходимы следующие предварительные эксперименты:

1.

Квантовый выход донора должен быть измерен в растворителе, используемом для экспериментов FRET.

2.

Спектры флуоресценции D и спектры поглощения A должны быть измерены при концентрациях, используемых в эксперименте FRET для вычисления интеграла перекрытия J .

Эффективность FRET показана на рис. 3.18 для различных значений R 0 .

Рисунок 3.18. Эффективность резонансной передачи энергии флуоресценции как функция расстояния между D и A для R 0 = 1 (), 2 ((серый в печатных версиях)) и 5 ​​((темно-серый в версии для печати)) нм.

На схемах в верхней части представлены изменения расстояния между D (обозначено звездочкой) и A (обозначено диском) по отношению к конформационному изменению.

Справедливость уравнения. (3.35) был критически протестирован для дансил- (Pro) n -нафтилпептидов, проявляющих конформацию спирали полипролина II типа. Вдоль этой спирали расстояние между донором нафтила и акцептором дансила можно точно регулировать числом пролинов в аминокислотной последовательности [49].

FRET был использован для исследования многих механизмов реакции. Типичным примером является выяснение индуцированного вирусами слияния липидов, межфазного явления, имеющего фундаментальное значение в медицинских науках [50].

Флуоресцентная спектроскопия особенно полезна для исследования взаимодействий между биомакромолекулами, такими как белки, и их партнерами по связыванию. Действительно, взаимодействие может изменить локальную полярность вокруг флуорофора и, следовательно, локальные дипольные моменты. Это вызывает изменение положения либо самого низкого энергетического уровня (самая высокая занятая молекулярная орбиталь), либо / или энергетического уровня молекулярной орбитали возбужденного состояния (например, самая низкая незанятая молекулярная орбиталь) и, следовательно, изменение поглощения спектр, но еще более заметное изменение в спектре излучения.

В качестве примера рассмотрим собственные флуоресцентные аминокислоты в белках. Соответствующие флуоресцентные группы представляют собой боковые цепи триптофана (Trp в трехбуквенном коде аминокислот), тирозина (Tyr) и фенилаланина (phe). Среди этих боковых цепей Trp имеет самый высокий квантовый выход эмиссии. Максимум спектра поглощения расположен при 280 нм, а максимум излучения — при 340 нм в воде. Но этот максимум излучения смещается в сторону более коротких длин волн (синее смещение), если Trp находится в гидрофобной внутренней части белка, и смещается в сторону более высоких длин волн, когда белок разворачивается (см. Главу 2.9).

Интенсивность флуоресценции также можно изменить с помощью процессов гашения. График отношения интенсивности флуоресценции в отсутствие гасителя, F 0 , к интенсивности флуоресценции F в присутствии концентрации гасителя [ Q ] обычно дает прямую линию:

(3,36 ) F0F = 1 + KS · [Q]

Наклон этого так называемого уравнения Штерна – Фольмера дает константу гашения K S , которая напрямую связана со временем жизни флуоресцентной группы в отсутствие тушителя τ и бимолекулярной константы скорости процесса тушения k q , согласно

(3.37) Ks = kq · τ

Экспериментально полученное значение k q часто сравнивают с константой скорости диффузии для бимолекулярного процесса k d = 2,0 × 10 10 л моль -1 с -1 . Когда k q > k d , процесс закалки ограничен диффузией, и процесс закалки является «статическим». Это означает, что существует комплексное образование между флуоресцентной молекулой в основном состоянии и гасителем.Процесс гашения также может быть «динамическим», подразумевая образование комплекса между флуоресцентной молекулой в возбужденном состоянии и гасителем.

Наконец, еще одно интересное применение флуоресцентной спектроскопии состоит в проведении анализов конкурентного связывания. Флуоресцентной молекуле (теперь называемой «рецептором» R ) сначала разрешается взаимодействовать с известной молекулой C ( C для «конкурента»), которая действует как гаситель и, как известно, связывается с известным область рецептора.Затем интересующий лиганд, L , титруют в рецепторном растворе; если интенсивность флуоресценции изменяется, C замещается L , что означает, что L связывается с рецептором в месте, близком к C . Хорошо известными примерами конкурентов флуоресценции альбуминов являются варфарин и ибупрофен, которые действуют как маркеры сайтов для сайта I (расположенного в субдомене IIA альбуминов) и сайта II (расположенного в субдомене IIIA альбуминов), соответственно [51].

Теперь мы сосредоточимся на реализации флуоресцентной спектроскопии на поверхностях.

композиция — Шестой лад — Томас Флиппин

«Это будет нашим ответом на насилие: делать музыку интенсивнее, красивее и преданнее, чем когда-либо прежде». -Леонард Бернштейн

В прошлом месяце меня осенило в душе: вместо того, чтобы писать ансамблевую пьесу, которую меня попросили написать для студентов из Сент-Луиса, я написал статью, связанную с недавней стрельбой в подростка из Сент-Луиса Майкла Брауна.Эта тема говорила мне больше, чем изначально планировалось, и когда художники могут делать то, что они хотят, а не то, что их просят, работа обычно более значима. Самонадеянный?

Я начал исследовать события и открыл для себя рэп-песни Майкла Брауна. Многие из них были вульгарными, но я решил взять мелодию, которую он использовал, и построить целую пьесу на этих восьми нотах. Целью было не прославить его грубый рэп, а представить его на слух. Была надежда, что подростки со всего города выполнят это, и все сообщество сможет собраться вместе, независимо от расового и социально-экономического характера, чтобы поразмышлять над ситуацией исцеляющим и вдумчивым образом. Смелый?

Две недели спустя у меня было кое-что… то, чем я очень горжусь . Есть чтение Дюбуа, чтобы контекстуализировать расовый аспект, и я дал игрокам возможность поднимать или не поднимать руки, когда они заканчивают игру, в надежде, что они смогут обсудить свой выбор. Дело в том, что добросовестные люди могут — и имеют — разные мнения о Фергюсоне, но я чувствовал, что все оценят то, что я пытался сделать. Наивный?

Но моя точка зрения как жителя Нью-Йорка не предполагала, насколько напряженными и вызывающими разногласия сейчас ситуация в Сент-Луисе.И есть много факторов, влияющих на успеваемость подростков: администраторы, учителя, ученики и родители — все должны быть за это. Тогда есть все виды соображений для представляющей организации: будем ли мы отчуждать членов? Считаться сторонником этого поляризующего вопроса? Как СМИ будут изображать это (например, «Ведущий демонстрирует вульгарную рэп-песню»)? Мы вели хорошую борьбу, даже изменяя аспекты пьесы, чтобы успокоить возражения (, это совершенно другая тема, ), но в конце концов трудности с выполнением пьесы так, как задумано, стали огромными. Отказ.

ОБНОВЛЕНИЕ: Итак, если сначала у вас ничего не получится, попробуйте, попробуйте еще раз. Я вернулся к чертежной доске, и благодаря удаче, изяществу и упорному труду некоторых людей, которым я благодарен, премьера произведения состоится в Duo Noire в Альянсе галерей черного искусства в Сент-Луисе. Теперь можно начинать настоящую работу. Погашение.

Биография инструктора | 7th Fret Guitar Studios

Darin Au

Дарин окончил Phi Beta Kappa со степенью B.А. в музыке из Университета Редлендса. Он получил степень магистра музыки в области композиции в Университете Северного Техаса. здесь находится один из крупнейших музыкальных колледжей страны, в который входят среди его выпускников много профессионалов в области музыки и лауреатов премии «Грэмми». Его сочинения и аранжировки исполнялись по всей территории США. США, по всей Европе и в Азии, в том числе мировая премьера его опубликовал работу Chasing Dragons на престижном фестивале Guitar Foundation of America в 2000 году.Его произведения исполнялись несколькими профессиональными гитарными ансамблями, в том числе Нью-Йоркским гитарным квартетом, гитарным квартетом Сан-Франциско и европейским гитарным квартетом Guitar4utation. Бенджамин Вердери, заведующий кафедрой гитары Йельского университета, на протяжении многих лет также использовал ряд композиций и аранжировок Дарина в своем обучении (Мауи ’09) и на семинарах (включая National Guitar Summer Workshop в Сиэтле ’03). Дарин также получил множество Награды и почести.Он много выступал в США и среди его местных заслуг — концерты и запись компакт-дисков с рок / регги. группа Thick Tubes, а также выступления на радио и телевидении с Капоно Бимером. Его композиции и записи также были услышаны в постановках Молодежного театра Гонолулу. Он занимал преподавательские должности в Академии Sacred Hearts Academy и Гавайский университет в Маноа.В течение 11 лет, с 2005 по 2016 год, Дарин занимал должность Заведующий музыкальным отделением Академии в школе Пунаху. В 2017–2018 годах он будет катализатором K-12 Learning Commons, исследуя творческие пути для всех в сообществе Пунахоу, чтобы учиться и демонстрировать свои работы. За последние несколько лет он проводил семинары по обучению творчеству на конференции «Школы будущего», конференции Гавайской ассоциации музыкального образования (HMEA), а также для учителей и родителей в школе Пунаху.Его последняя книга — «Начинающие ансамбли для следующего поколения гитаристов». «Погоня за драконами» была на компакт-диске «Погоня за светом» 2010 года, выпущенном SFGQ. «Dawning at Sunset», его трёхчастная сольная композиция для классической гитары, вошла в альбом Иэна О’Салливана «Born and Raised» в 2013 году. Этот компакт-диск был номинирован на премию Na Hoku Hanohano Гавайской академии звукозаписи в номинации «Инструментальный альбом года». Совсем недавно его композиция для гитарного ансамбля «Bailarina en un paisaje abstracto» была представлена ​​на конференции HMEA 2017 в совместных усилиях гастролирующего гитарного ансамбля средней школы Мэривейл (Феникс, Аризона) и ансамбля классической гитары II школы Пунаху. .В 2015 году он был назначен в совет директоров Hawaii Pops в качестве главы комитета по образованию. Он также входит в Совет NAfME по обучению игре на гитаре в качестве представителя Западного дивизиона на 2015–2018 годы.

Джейсон Номура

Джейсон получил степень бакалавра наук. в средней школе общей музыки Образование в UH-Manoa, где он получил множество наград. Входит в те отличием был сертификат за заслуги перед местным CMENC (Национальная ассоциация музыкальных педагогов), в котором он работал Президент.Помимо занятий классической гитарой, Джейсон изучал за эти годы был в нескольких рок-группах, а сейчас уже в трех; два кавер-группы, игра на гитаре / клавишах и пение, а также его оригинал проект, Мантра. Джейсон окончил среднюю школу Кадена, которая входит в состав ВВС США Кадена. Авиабаза на Окинаве, Япония, где он получил множество музыкальных наград. в том числе лучший оркестр / хор, первый председатель почетного оркестра / хора, и стипендия за производительность.В настоящее время работает по совместительству на факультете Пунахоу преподает, что еще, гитара! Джейсон был на 7-м ладу с Август 2009 г.

Мэтью Лав

Мэтт имеет степень бакалавра искусств. в исполнении классической музыки из Нового Консерватория Англии, где он учился на стипендии. В дополнение к свою курсовую работу по музыкальному исполнению, он также проявлял большой интерес к Прохождение ряда курсов по музыкальному образованию и композиции.Мэтт окончил Пунаху, где получил «Луи Б. Джазовая премия Армстронга »и престижной премии« Музыкальный департамент ». награда присуждается только в те годы, когда отдел находит выдающиеся ученик. Находясь в Пунаху, он выступал как в Симфоническом оркестре. и Jazz Band все четыре года.Он также активно выступал с его панк-группа, p.p.e., где он играл на басу и пел. Он был соавтором и записал два полноформатных альбома группы. С его возвращения в Гонолулу, Мэтт преподает уроки контрабаса в частном порядке, группа уроки игры на гитаре на 7-м ладу, и их можно увидеть выступающими в различных местных постановки по городу.Он также выступает с Джейсоном Номура в их местная альтернативная рок-группа Mantra, а также сочиняет и записывает собственную оригинальную музыку:
matthewcodylove.com

Кимберли Ошита

Кимберли владеет M.M. в исполнении на гитаре от штата Калифорния Университет Нортриджа и степень бакалавра искусств в исполнении на гитаре от Университет штата Аризона, где она закончила с отличием.Кимберли работал ассистентом преподавателя в Калифорнийском государственном Нортридже и в качестве инструктора по подготовке к игре на гитаре в Университете штата Аризона Программа. Она обучает игре на гитаре детей и взрослых в возрасте от 5 лет и старше. вверх, более 8 лет. Недавно она вернулась на Гавайи после учился классической гитаре в Европе в течение двух лет у Хуберта Каппеля (Германия) и Лоренцо Микели (Италия).В то время как в Университете штата Аризона Кимберли участвовала в джазовые мастер-классы и игра на электрогитаре, микросинте и струнных фортепиано в ансамбле экспериментальной музыки Университета штата Аризона. Кимберли очень любит преподавать и играть музыку, и любит делиться процесс открытия музыки с другими.Она сейчас играет электрогитара в паре экспериментальных рок-проектов.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.