Куда перешел: Лионель Месси — последние новости

Разное

Содержание

Кто и куда перешёл, пока вы ели салаты. Главные трансферы праздников

Абрамович купил самого дорогого американца, «Спартак» устроил чистку, а Краснодар взял лучшего игрока чемпионата Швеции.

«ЧЕЛСИ ПОТРАТИЛ 64 МЛН ЕВРО НА ПУЛИШИЧА И ПРОЩАЕТСЯ С ФАБРЕГАСОМ

Самая дорогая покупка зимы пока за «Челси». Клуб Романа Абрамовича отвалил дортмундской «Боруссии» 64 млн евро за Кристиана Пулишича. В этом сезоне Палисик (как он сам себя называет) нечасто появляется в составе, но в этом нет вины этнического хорвата. Главный тренер команды Люсьен Фавр больше доверяет другим футболистам. А Кристиан, действительно, хорош. В 17 лет он впервые забил за «Боруссию», в 19 — получил награду лучшему футболисту США, а в 20 — подписал контракт на 4,5 года с одним из сильнейших клубов Англии за большую компенсацию.

Так много за американского футболиста никто никогда не платил. Предыдущий рекорд принадлежал Джону Бруксу, которого «Вольфсбург» 1,5 года назад приобрёл за 20 млн евро. Если перенести суммы в плоскость повсеместного соперничества США и России, то у Америки теперь самый дорогой футболист – российский рекордсмен Александр Головин обошёлся «Монако» после чемпионата мира в 30 млн.

К слову о «Монако». По ходу всех праздников медиа отправляли туда другого игрока «Челси». Сеск Фабрегас пока отмалчивается, но в кубковой игре англичан он вышел с капитанской повязкой и долго хлопал трибунам после замены, едва не расплакавшись. Из последних данных по его переходу известно, что он слетал в княжество на медосмотр, но вернулся.

«Челси» не готов его отпускать, пока не найдёт чемпиону мира и Европы замену. Как пишет британский The Telegraph, одним из кандидатов на его место в клубе видят полузащитника петербургского «Зенита» Леандро Паредеса. Пока же все на своих местах.

Ещё один крупный трансфер в Англии косвенно тоже связан с «Челси». Середняк АПЛ «Борнмут» не пожалел 21 млн евро на 21-летнего форварда Доминика Соланке. Футболист прошёл всю академию «Челси» с семилетнего возраста, но так и не пригодился родной команде. В 2017-м свободным агентом он перешёл в «Ливерпуль». За спинами Мохаммеда Салаха, Роберто Фирмино

, Садио Мане и Даниэля Старриджа шансов сыграть в составе лидеров сезона в Англии не так много, так что в этой сделке все остались в плюсе.

НОВЫЙ КАКА В «МИЛАНЕ», РОБИНЬО И ТАСКИ УШЛИ К ЛИДЕРУ ТУРЕЦКОГО ЧЕМПИОНАТА 

В Италии тоже случился крупный трейд. В последние годы «Милан» стал главным примером для больших клубов, показывая, как не надо тратить деньги. История с бразильским новичком должна стать другой. Лукас Пакета обошёлся миланцам в 35 млн евро. Парень всего четыре месяца назад дебютировал за сборную Бразилии, а на Новый год подарил родному «Фламенго» за себя громадный чек от итальянцев.

Уже в октябре в Бразилии говорили, что сделка совершена, а сам футболист не скрывал радости от скорого переезда в Европу.

«Мечтаю выступать за «Милан» так же хорошо, как Кака», – говорил 21-летний полузащитник на днях как только приземлился в Италии. Во «Фламенго» он успел стать одним из ключевых футболистов: за два года провёл под сто матчей и забил 17 мячей.

35 млн – так много ни один итальянский клуб ранее не платил за футболиста из Бразилии. За самого Кака «россонери» отдали в 2003-м в 4,5 раза меньше. Правда, тогда были не только другие деньги, но и другой «Милан». От Пакеты уже сейчас ждут, что он сможет вернуть клуб хотя бы в Лигу чемпионов, за попадание куда команде Дженнаро Гаттузо ещё предстоит побороться.

Один из тех, на кого «Милан» возлагал когда-то такие же надежды, сейчас обитает в Турции. В середине нулевых Робиньо был на уровне Криштиану Роналду, с него началась эра арабских нефтедолларов «Манчестер Сити», но карьера у него прошла не так ураганно, как у португальца, да и громкие победы «Манчестер Сити» не связаны с его именем. 5 января лидер чемпионата Турции этого сезона «Истанбул Башакшехир» приобрёл бразильца у «Сиваспора» за 2 млн евро.

34-летний Робиньо не так плох в турецкой лиге. За полсезона он забил 8 мячей и сделал 2 голевые передачи, так что его помощь может стать решающей в борьбе за первый в истории клуба титул. В тот же день клуб анонсировал переход бывшего защитника «Спартака»

Сердара Таски. В Турции новая команда чемпиона России 2016/17 – самый заметный игрок на трансферном рынке этой зимы.

«СПАРТАК» РАЗДАЁТ ИГРОКОВ «КРЫЛЬЯМ»

В России бывший клуб Таски пока тоже ведёт себя достаточно активно. Но больше это относится к чистке состава. «Спартак» по ходу праздников расторг контракты с Ивелином Поповым, Александром Самедовым, Романом Ерёменко и Марко Петковичем. Полузащитники Жано Ананидзе и

Артём Тимофеев уйдут в аренду. Оба, скорее всего, продолжат сезон в «Крыльях Советах». О грузинском футболисте эту информацию самарский клуб уже подтвердил. Туда же перешёл и Самедов. Для 34-летнего бывшего игрока сборной России «Крылья» станут первым клубом не из Москвы. Пока деловые отношения «Спартака» и «Крылья Советов» – самое интересное событие первых дней 2019 года в российском футболе.

Александр Самедов / фото: Сергей Елагин, «БИЗНЕС Online»

«Краснодар» Сергея Галицкого в последние годы внимательно следит за северной Европой, в частности за Скандинавией. На этот раз в клуб из Краснодарского края перешёл игрок сборной Швеции и лучший футболист прошлого сезона чемпионата страны Кристоффер Олссон. Сумма трансфера оценивается почти в 5 млн евро.

Центральный полузащитник из стокгольмского АИКа мог запомниться по игре российской сборной против Швеции в Лиге наций. Во многом за счёт его действий команда Станислава Черчесова проиграла шведам, и Олссон был в числе лучших своей сборной. В опорной зоне у «Краснодара» есть Юрий Газинский и Шарль Каборе, но ещё одна опция для борьбы с «Зенитом» в чемпионской гонке точно не станет лишней. С адаптацией новичку может помочь партнёр по сборной Виктор Классон. Судя по всему, уже сейчас можно говорить, что «Краснодар» сделал очередное удачное приобретение.

ПЕПЕ ВЕРНУЛСЯ В «ПОРТУ» К КАСИЛЬЯСУ

В последние пару дней в Европе случилось несколько интересных событий. В ночь перед Рождеством «Реал» подписал контракт с 19-летним испанцем. Браима Диаса

королевский клуб выкупил у «Манчестер Сити» за сумму в пределах 15 — 17 млн евро и прописал сумму отступных в 750 млн. Новичок уже успел стать жертвой ничего не забывающего интернета. На презентации он признался, что исполнил мечту детства, перейдя в «Реал». Прошло несколько часов и появилось это видео.

DOCUMENTO #JUGONES |@Brahim le RECONOCIÓ a @quimdomenech que ERA DEL BARÇA y su ÍDOLO ERA Messi cuando tenía 12 años. ¡SE HARÁ VIRAL! pic.twitter.com/RMzilUVVyj
— El Chiringuito TV (@elchiringuitotv) 8 января 2019 г.

В нём 12-летний Диас признаётся, что между «Реалом» и «Барселоной» выбирает каталонцев, а любимым игроком назвал Лионеля Месси.

А вчера состоялось возвращение если не года, то хотя бы месяца. Капитан сборной Португалии (когда Криштиану не до неё) 

Пепе вернулся в «Порту», откуда переходил в мадридский «Реал» в 2007-м. Трёхкратный победитель Лиги чемпионов в декабре покинул «Бешикташ» и несколько недель находился в статусе свободного агента. В итоге чемпион Европы-2016 принял решение вернуться туда, где получил известность.

Wellcome
Bem-vindo
Bienvenido @FCPorto pic.twitter.com/pDuvlpGce6
— Iker Casillas (@IkerCasillas) 8 января 2019 г.

«Порту» по-прежнему остаётся особенным клубом для меня», – не скрывает радости от возвращения Пепе. Контракт с клубом защитник подписал на 2,5 года. В команде он хорошо знает как минимум одного человека. Вместе с Икером Касильясом они 10 лет играли в Мадриде и спустя пару лет снова оказались в одной раздевалке.

***

Параллельно с европейскими сделками любопытная трансферная кампания проходила в Азии. Клуб из Саудовской Аравии «Аль-Иттихад» за четыре дня оформил четыре перехода на 25,5 млн евро. Малоизвестные игроки из чемпионатов Турции, Швейцарии и бразилец из арабской «Аль-Джазири» присоединились к клубу в сжатые сроки. Один из четырёх новичков знаком российским болельщикам. Шесть лет назад защитник Ману да Кошта играл за «Локомотив» и запомнился победным дублем в матче с «Зенитом». Видимо, его игра запомнилась тогдашнему тренеру москвичей Славену Биличу. Именно он сейчас тренируют этот саудовский клуб, который прошлый сезон закончил в нижней части турнирной таблицы.

Оценка текста

Томск | Томский баскетболист Александр Каун покинет клуб NBA, куда перешел по обмену

ФОТО: Дмитрий Кандинский / vtomske.ru

31-летний центровой клуба NBA, уроженец Томска Александр Каун покинет клуб  «Филадельфия  Сиксерс», куда его недавно обменяли из «Кливленд Кавальерс», сообщается на сайте  американского спортивного канала Espn.

Ранее сообщалось, что  чемпион  NBA  «Кливленд Кавальерс» приобрел права на  нигерийского форварда Чуквудибере Мадуабума из клуба  «Филадельфия  Сиксерс» в обмен на центрового Александра Кауна и денежное вознаграждение.

«В «Сискерс» намерены отказаться от Кауна после того, как сделка будет завершена, сообщил источник  ESPN. В прошлом сезоне Каун, в среднем, набирал за игру только 0,9 очка и сделал один подбор», — говорится в релизе.

Добавим, в интервью «Матч ТВ» президент РФБ Андрей Кириленко сказал, что не исключает того, что Александр Каун планирует завершить спортивную карьеру и остаться жить в США.

Напомним, томич  стал игроком американского клуба «Кливленд  Кавальерс»  в сентябре 2015 года. Баскетболист подписал контракт с клубом на два года. В сезоне 2015/16 Каун вместе с одноклубником  Тимофеем  Мозговым  стали   первыми  российскими  чемпионами  NBA  в истории.

Бронзовый призер Олимпиады-2012 в Лондоне Александр Каун   родился в Томске, где в течение шести лет  занимался  баскетболом в ДЮСШ № 6. В 2001 году спортсмен уехал учиться в США, а по возвращении был приглашен выступать за баскетбольный клуб ЦСКА.  Каун семь раз становился чемпионом России и пять раз — чемпионом  Единой лиги ВТБ. В 2010 году стал обладателем Кубка России по баскетболу.

Редакция новостей Данный материал опубликован на сайте BezFormata 11 января 2019 года,
ниже указана дата, когда материал был опубликован на сайте первоисточника!

Ещё новости о событии:

Александр Каун намерен завершить карьеру баскетболиста

Радио «Маяк» в Томске Воспитанник томской детско-юношеской спортшколы Александр Каун намерен завершить карьеру баскетболиста.
17:38 18.07.2016 ГТРК Томск — Томск

Томский баскетболист Александр Каун покинет клуб NBA, куда перешел по обмену

ФОТО: Дмитрий Кандинский / vtomske.ru 31-летний центровой клуба NBA, уроженец Томска Александр Каун покинет клуб «Филадельфия Сиксерс», куда его недавно обменяли из «Кливленд Кавальерс»,
15:11 18.07.2016 VTomske.Ru — Томск

Кто куда перешел и что будет дальше?

Без шума не получилось.

Без шума не получилось.

2 февраля мир СНГ Dota 2 потряс уход из команды капитана Natus Vincere Бакыта Zayac Эмилжанова и его последующий переход в Virtus. pro. Сообщество разбилось пополам: одни считают поступок Зайца с лазейкой в контракте откровенно нечестной игрой, другие же, наоборот, не видят в этом ничего необычного.

Так или иначе эта ситуация затронула три наши сильнейшие команды. Помимо Na’Vi и Virtus.pro изменения в составе претерпели и Gambit Gaming. В этом материале мы собрали всю доступную информацию, а также мнения игроков, комментаторов, аналитиков и менеджеров клубов.

Началось все еще несколько недель назад, когда киберспортивный менеджер Дмитрий Korb3n Белов в комментариях своего паблика поделился на тот момент внутренней информацией о переходе Zayac в Virtus.pro.

https://www.instagram.com/p/B7gZbcdI3P5/?utm_source=ig_web_copy_link

Это оставалось на уровне слухов, пока CEO Na’Vi Евгений HarisPilton Золотарев не выпустил официальное обращение с пояснением ситуации:

Смотреть на YouTube

Дело в том, что Бакыт хотел уйти еще после неудачного выступления на The International 9, но тогда его все же уговорили остаться. Ненадолго. После поражения на турнире Leipzig Major Бакыт больше не захотел оставаться в Na’Vi, несмотря на то, что в самой организации были довольны результатами, 

Игрок собрался уйти в VP, «потому что там Нун и Соло». Золотарев подметил, что подобные решения должны приниматься через общение между руководством, а не игроком. Но Зайца уже было не остановить, бывший «рожденный побеждать» собрал вещи и уехал.

Позже CEO Na’Vi пришло сообщение, что контракт с Зайцем заключен неправильно, для продления Бакыт должен был письменно уведомить начальство о желании продолжать играть в составе. Отсутствие такого заявления и стало юридической лазейкой, позволяющей «медведям» забрать игрока. Natus Vincere не стали устраивать официальный трансфер, отказались от денег, отпустив Эмилжанова как свободного агента, чтобы придать истории огласку. Сейчас Зайца в составе заменил Семен CemaTheSlayer Кривуля.

https://www.instagram.com/p/Bon_90xgoNJ/?utm_source=ig_web_copy_link

В конце монолога Золотарев предложил всем руководителям киберспортивных клубов собраться вместе для обсуждения четких правил перехода игроков между организациями.

На обращение сразу же отреагировал спортивный директор Team Empire Александр Stranger Соломонов:

«Скажу честно, я закипел от этой истории. Время идет, а методы некоторых организаций не меняются. Ситуация у NaVi с Зайцем почти полностью похожа на ситуацию, когда VP отжимали у нас Рамзеса, за исключением того, что в контракте у нас не было такого пункта, к которому можно было бы так сильно придраться. Однако мы также получали от Романа письма, написанные явно не им. Случившееся еще раз подтверждает, что игрок, который «кинул» свою бывшую команду, рано или поздно кинет и твою. Если у игрока возникла мысль уйти — он уйдет, когда что-то будет не получаться. Не думаю, что Бакыт станет панацеей для VP. Выбор же Семена для NaVi считаю достаточно хорошим, думаю, в СНГ-регионе NaVi не станут играть хуже. Евгения Золотарева уважаю в данной истории за открытость и волевое решение, ведь можно было договориться с VP о символическом трансфере за $10 тысяч и закрыть вопрос. Также поддерживаю инициативу о встрече СНГ клубов по вопросам трансферов в dota2. Из интриг этого решафла осталось узнать, кто заменит в VP Эпилептика. У меня нет инсайдов на этот счет, и никогда особо ими не интересовался, если говорят, что gpk не будет в VP, то по логике остается всего 2 варианта опытных игроков: fn и God. Посмотрим.»

А на следующий день, 3 февраля, вышел ответ от CEO Virtus.pro Сергея Гламазды, самого Бакыта и капитана команды Алексея Solo Березина:

Смотреть на YouTube

По словам Гламазды, на игрока оказывало давление руководство команды, а контракт действовал только до конца 2019 года:

«Я сам общался с Бакытом, потому что мне нужно было понять, действительно ли интерес искренний. Я понял, что он испытывает большое давление из-за того, что ему организация говорит, что его карьера будет испорчена, что он уже никогда нигде не сможет играть, что он будет сидеть «на банке», что это неэтично, и тому подобное. В один момент мы перешли с Евгением в более конструктивный диалог. Оказалось, что да, действительно есть подписанный контракт, но он подписан ровно на 2019 год. Я сказал: «Хорошо, давайте обсудим трансферную историю». Мы могли бы и не платить эти деньги, но я понимал, что для организации это удар, для менеджеров это удар, для игроков это удар. Поэтому эту ситуацию нужно было довести до логического конца».
https://www.instagram.com/p/B6ctATkBBdh/?utm_source=ig_web_copy_link

Сам Zayac в ролике рассказал о своей работе в роли капитана команды, неудачах на «Мейджоре» и объяснил причины своего ухода:

«На мейджоре, как мне кажется, я не справлялся с капитанством, и это все больше на меня давило. Когда Solo написал мне о том, что он желает играть со мной, — меня это очень сильно воодушевило. Я загорелся этой идеей и сказал, что мне нужно поговорить с командой, так как мы уже выстроили план. На следующее утро первым, кому я решил сказать, был менеджер. Я ожидал от него каких-то наставлений, что он мне поможет правильно высказать парням. Меня все устраивало, но я знаю, что для моей карьеры и моих амбиций мне нужно было уходить. Менеджер отреагировал очень тяжело и порекомендовал пообщаться с Золотаревым. Я позвонил ему и сказал, что у меня есть желание перейти к Solo. Он мне предложил подождать два дня, подумать.Тогда я реально метался, пару часов не находил себе места и не знал, как это сказать. Ко мне подошел менеджер и в агрессивной форме пообещал, что я сяду на банку, что меня год не будут никуда отпускать и что я заруинил себе карьеру. После такого я точно понял, что не хочу оставаться в этой организации. Уже Золотарев мне нормально объяснил, что он не хочет отдавать конкурентам игрока».

В конце он обратился к болельщикам:

«Хочу попросить всех фанатов отнестись ко мне с пониманием. У меня был выбор остаться в хорошей, дружелюбной команде и попытаться дальше расти как капитану, но для своей карьеры я решил, что мне будет лучше продолжать играть как четверка».
https://www.instagram.com/p/B1DWkXDA27k/?utm_source=ig_web_copy_link

После раскрытия всех деталей большинство принялось ругать Virtus. pro за грязные трюки, а Бакыта обвинять в предательстве. Но представители индустрии подметили, что подобная практика в СНГ была всегда.

Прокомментировал ситуацию бывший тренер коллективов Winstrike и FlyToMoon Евгений Sh5dowehhh Алексеев.

Менеджер проектов Winstrike Team Сергей AnahRoniX Быковский вспомнил еще целых два подобных случая с контрактами.

Недоумение по поводу такой бурной реакции также выразил игрок FlyToMoon Андрей ALWAYSWANNAFLY Бондаренко.

А комментатор студии RuHUB Владимир Maelstorm Кузьминов записал целое видео о переходе Zayac в VP, где посчитал поступок игрока мужественным:

«По сути дела, если сейчас NAVI проигрывают, все отнесутся к ним с сочувствием — это нормально, я сам так отнесусь. Если они выиграют, то станут народными героями — для меня в том числе. Потому что они остались в такой ситуации и выиграли. <…> Если же сейчас VP выиграют, допустим, мейджор, то они станут, конечно, на какое-то время героями, но не настолько сильно, как NAVI. Если же они провалятся, то вы представляете, какой хейт свалится в том числе на Бакыта? Поэтому я не совсем понимаю позицию абсолютного большинства, что Zayac такой нехороший человек. По-моему, очень мужественный поступок — он не побоялся рассориться с очень крупной организацией».
Смотреть на YouTube

Во второй половине ролика Кузьминов напомнил зрителям о том, как в 2013 году Na’Vi поступили похожим образом для подписания Глеба Funn1k Липатникова, который на тот момент был в составе Team Empire.

Если у Natus Vincere действительно были проблемы с договорами, то Gambit Gaming, наоборот, сделали все как надо. Лидер команды Gambit Данил gpk Скутин тоже хотел уйти к «медведям», но его контракт оформлен соответствующим образом и действует до 2021 года.

Получив предложение от представителей Virtus. pro, gpk решил отказаться от тренировок с командой, за что был переведен в запас. Руководство Gambit не планирует продавать или обменивать игрока, но рассматривает вариант с возвращением в основной состав.

Коллеги Данила с сочувствием отнеслись к произошедшему, но рады, что «Гамбиты» смогли следовать простым правилам:

«Этот действие от Gambit — первый шаг к цивилизации и нормальной работе между игроком и клубом. Да, GPK жалко, но это будет уроком впредь для каждого: подписываешь контракт — думай, что, на сколько и с какими условиями ты подписываешь, большой спорт работает именно так, а мы давно уже спорт не маленький», — прокомментировал Ярослав NS Кузнецов на своем стриме.

Бывший профессиональный игрок, а сейчас сотрудник студии RuHUB Сергей Smile Ревин напомнил, что в первую очередь людей должен волновать профессионализм, а не скандалы.

Тем временем CEO Na’Vi Евгений Золотарев в своем личном блоге раскрыл подробности деловой встречи между клубами.

«Хочется отвлечься от трансферных саг и рассказать, как проходит подготовка к организации встречи клубов для решения наболевших вопросов. На текущий момент встречу подтвердило 12 клубов — Нави, ВП, Гамбит, Форз, Винстрайк, Тим Спирит, Эмпайр, Вега, Юник, HR, Немига, Авангар. Еще нескольким отправил запросы. Встреча состоится в Москве 21 февраля, и я очень надеюсь, что мы сможем прийти к понятным правилам игры».

По итогу всех переходов на ближайших квалификациях за Virtus.pro будут выступать Бакыт Zayac Эмилжанов и Заур Cooman Шахмурзаев, а gpk в Gambit заменит Ростислав fn Лозовой. Теперь зрители будут наблюдать за матчами наших команд еще более пристально.

Читайте также:

Нападение на Советский Союз, июнь 1941 года

Германское вторжение на территорию Советского Союза, известное под кодовым названием «операция «Барбаросса»», началось 22 июня 1941 года. Это была самая крупная военная операция рейха за всю Вторую мировую войну.

Гитлер всегда считал германо-советский пакт о ненападении всего лишь временным средством, тактическим маневром. 18 декабря 1940 года он подписал Директиву №21 (кодовое название: «операция «Барбаросса»») — первый боевой приказ о нападении на CCCР. С самого начала планирования военной операции германское полицейское и военное командование собиралось вести войну на уничтожение против коммунистов, а также против евреев СССР, которые, как считали нацисты, составляли «расовую основу» Советского государства.

Германия напала на Советский Союз 22 июня 1941 года, менее чем через два года после подписания германо-советского пакта. Три группы армий, насчитывающие более трех миллионов немецких солдат, при поддержке полумиллионного войска германских союзников (Финляндии, Румынии, Венгрии, Италии, Словакии и Хорватии) атаковали Советский Союз широким фронтом — от Балтийского моря на севере до Черного моря на юге. Долгое время советское правительство отказывалось обращать внимание на предостережения западных держав о том, что Германия наращивает свою военную мощь. Таким образом, Германия получила тактическое преимущество внезапности, и в начале войны советские армии были разбиты. Миллионы советских солдат были окружены, отрезаны от снабжения и подкреплений и вынуждены сдаться.

По мере продвижения германской армии вглубь советской территории за ней следовали айнзатцгруппы (оперативные карательные отряды), осуществлявшие операции по массовому уничтожению жителей.

К началу сентября 1941 года германские войска на северном фронте подошли к Ленинграду. Они захватили Смоленск в центре и Днепропетровск на юге. В начале декабря германские части подошли к окраинам Москвы. Однако после долгих месяцев кампании силы германской армии были истощены. Предполагая быструю гибель Советского государства, германское командование не экипировало армию для военных действий в зимнее время. Более того, быстрое продвижение германских войск привело к тому, что они оказались оторваны от линий снабжения, которые были весьма уязвимы из-за своей огромной протяженности (Москва расположена приблизительно в 1500 километрах от Берлина).

В декабре 1941 года Советский Союз предпринял крупное наступление по центру фронта, заставив немецкую армию в беспорядке отступить от Москвы. Только несколько недель спустя немцы смогли остановить продвижение советских войск к востоку от Смоленска. Летом 1942 года Германия возобновила атаку, проведя широкомасштабное наступление на юг и юго-восток, по направлению к Сталинграду на Волге и нефтяным месторождениям Кавказа. Когда в сентябре 1942 года немецким войскам удалось пробиться к Сталинграду, территория, захваченная Германией, достигла максимальных размеров.

ФСС — Прямые выплаты

Получить справку о выплаченных пособиях, в том числе, справку о доходах

О назначении и выплате органами Фонда социального страхования Российской Федерации страхового обеспечения на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством

С 01.01.2022 условия и порядок назначения и выплаты работающим гражданам пособия, регулируют Федеральный закон от 29. 12.2006 № 255-ФЗ «Об обязательном социальном страховании на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством» (далее – Закон № 255-ФЗ) и Правила получения Фондом социального страхования Российской Федерации сведений и документов, необходимых для назначения и выплаты пособий по временной нетрудоспособности, по беременности и родам, единовременного пособия при рождении ребенка, ежемесячного пособия по уходу за ребенком, утвержденные постановлением Правительства Российской Федерации от 23.11.2021 № 2010 (далее – Правила).

В силу пункта 5 Правил при наступлении страхового случая застрахованное лицо представляет страхователю по месту своей работы (службы, иной деятельности) сведения и документы, необходимые для назначения и выплаты пособия, в случае их отсутствия у страхователя.

В соответствии с пунктом 6 Правил застрахованное лицо представляет страхователю по месту работы (службы, иной деятельности) сведения о себе, необходимые для выплаты пособия. Сведения о застрахованном лице представляются страхователю при трудоустройстве застрахованного лица или в период осуществления им трудовой, служебной и иной деятельности, а также при их изменении. Сведения о застрахованном лице оформляются на бумажном носителе либо формируются в форме электронного документа по выбору застрахованного лица.

Согласно пункту 7 Правил страхователь передает полученные им сведения и документы, необходимые для назначения и выплаты пособий, предусмотренные пунктом 5 Правил, и сведения о застрахованном лице в территориальный орган страховщика по месту своей регистрации в срок не позднее 3 рабочих дней со дня их получения.

В соответствии с пунктом 10 Правил в случае представления не в полном объеме страховщику сведений и документов, необходимых для назначения и выплаты пособия, страховщик в течение 5 рабочих дней со дня их получения вручает страхователю под расписку либо направляет в электронной форме или по почте заказным письмом извещение о представлении недостающих сведений и документов по форме, утверждаемой страховщиком.

Страхователю, представившим страховщику неполные сведения и документы в электронной форме, извещение направляется в электронной форме.

В случае отсутствия подтверждения о получении извещения страховщик в течение 3 рабочих дней со дня истечения срока, установленного для такого подтверждения, направляет извещение по почте заказным письмом.

Извещение, направленное по почте заказным письмом, считается полученным по истечении 6 рабочих дней со дня направления заказного письма.

Страхователь представляет страховщику недостающие сведения и документы в течение 5 рабочих дней со дня получения извещения.

Согласно части 1 статьи 15 Закона № 255-ФЗ страховщик назначает и выплачивает пособия по временной нетрудоспособности, по беременности и родам, ежемесячное пособие по уходу за ребенком в срок, не превышающий 10 рабочих дней со дня представления страхователем или застрахованным лицом сведений и документов, необходимых для назначения и выплаты страхового обеспечения, а единовременное пособие при рождении ребенка - в срок, не превышающий 10 рабочих дней со дня поступления сведений о государственной регистрации рождения, содержащихся в Едином государственном реестре записей актов гражданского состояния.

На основании части 25 статьи 13 Закона № 255-ФЗ выплата пособий по временной нетрудоспособности, по беременности и родам, единовременного пособия при рождении ребенка, ежемесячного пособия по уходу за ребенком осуществляется страховщиком через организацию федеральной почтовой связи, кредитную либо иную организацию, указанную в сведениях о застрахованном лице.

Стоит отметить, что при получении Фондом из Единого государственного реестра записей актов гражданского состояния сведений необходимых для назначения и выплаты пособия при рождении ребенка, информационной системой страховщика в автоматизированном режиме получателем пособия в приоритетном порядке выбрана мать ребенка.

Частью 1 статьи 10 Закона № 255-ФЗ установлено, что пособие по беременности и родам выплачивается застрахованной женщине суммарно за весь период отпуска по беременности и родам.

В случае, если в период нахождения матери в отпуске по уходу за ребенком до достижения им возраста полутора лет у нее наступает отпуск по беременности и родам, она имеет право выбора одного из двух видов пособий, выплачиваемых в периоды соответствующих отпусков (часть 3 статьи 10 Закона № 255-ФЗ).

С 01.01.2022 приказом Министерством здравоохранения Российской Федерации от 23.11.2021 №1089н «Об утверждении Условий и порядка формирования листков нетрудоспособности в форме электронного документа и выдачи листков нетрудоспособности в форме документа на бумажном носителе в случаях, установленных законодательством Российской Федерации» утверждены новые правила оформления листков нетрудоспособности.

Пособия по временной нетрудоспособности и по беременности и родам назначаются и выплачиваются на основании сформированных листков нетрудоспособности, оформленных в соответствии с законодательством Российской Федерации.

О выплате пособия по временной нетрудоспособности по заболеванию или травме застрахованного лица

В соответствии с частью 1 статьи 14.1 пособия по временной нетрудоспособности в случаях, предусмотренных пунктом 1 части 1 статьи 5 Закона № 255-ФЗ, выплачиваются за первые 3 дня временной нетрудоспособности осуществляются страхователем по месту работы (службы, иной деятельности) застрахованного лица. Выплата пособия осуществляется в порядке, установленном для выплаты застрахованным лицам заработной платы.

За остальной период начиная с 4-го дня временной нетрудоспособности за счет средств бюджета Фонда, согласно пункта 1 части 2 статьи 3 Закона № 255-ФЗ.

О удержании НДФЛ с назначенного пособия по временной нетрудоспособности

Согласно пункту 1 статьи 217 Налогового кодекса Российской Федерации (далее — НК РФ) не подлежат налогообложению (освобождаются от налогообложения), в том числе, государственные пособия за исключением пособий по временной нетрудоспособности (включая пособия по уходу за больным ребенком).

В связи с тем, что пособие по временной нетрудоспособности подлежит обложению НДФЛ, территориальные органы Фонда являются налоговыми агентами в отношении сумм указанного пособия, выплачиваемых застрахованным лицам.

Исходя из положений подпункта 1 пункта 3 статьи 24 и пункта 1 статьи 226 НК РФ к обязанностям налогового агента, в том числе, относится обязанность своевременно перечислять суммы исчисленного и удержанного налога в бюджетную систему Российской Федерации.

Таким образом, пособие по временной нетрудоспособности перечисляются застрахованному лицу за вычетом суммы удержанного НДФЛ.

В Личном кабинете получателя услуг отображается сумма назначенного территориальным органом Фонда пособия, а также сумма удержания по исчисленному пособию.

О сроках выплат назначенного ежемесячного пособия по уходу за ребенком

Первоначальная выплата ежемесячного пособия по уходу за ребенком осуществляется в течении 10 рабочих дней со дня получения сведений, необходимых для назначения и выплаты ежемесячного пособия по уходу за ребенком. Последующая выплата ежемесячного пособия по уходу за ребенком застрахованному лицу осуществляется территориальным органом Фонда согласно утверждённому региональным отделением Фонда графику ежемесячно, в начале месяца не позднее 15 числа (в месяце, следующем за месяцем, за который выплачивается данное пособие). Подробную информацию о предположительной дате выплаты пособия по уходу за ребенком возможно уточнить у регионального отделения Фонда, назначившего пособие.

Информируем также, что застрахованное лицо вправе подать обращение непосредственно в территориальный орган Фонда в электронном виде через Личный кабинет получателя социальных услуг, размещенный по адресу: http://lk.fss.ru, выбрав соответствующую тематику в форме запроса, а также посредством Личного кабинета получателя социальных услуг ознакомиться с информацией о размере назначенного и выплаченного территориальным органом Фонда страхового обеспечения по обязательному социальному страхованию. Вход осуществляется с использованием логина и пароля для Единого портала государственных услуг (при наличии авторизованной учетной записи).

В случае возникновения дополнительных вопросов, связанных с обеспечением пособиями по обязательному социальному страхованию на случай временной нетрудоспособности и в связи с материнством, возможно обратиться по телефону «горячей линии» Фонда: 8-800-302-75-49.

Куда перешел Бауыржан Исламхан? Вкратце об «Аль-Айне»

31 янв. 2020, 22:10 | 2394

KazFootball.kz представляет Вашему вниманию материал о новой команде капитана Национальной сборной Казахстана Бауыржана Исламхана — эмиратском «Аль-Айне».

Напомним, что сегодня официально стало известно о переходе 26-летнего казахстанского полузащитника Бауыржана Исламхана в эмиратский «Аль-Айн». Контракт расчитан до 30 июня 2020 года.

ФК «Аль-Айн» находится в Объединенных Арабских Эмиратах, практически в одноименном городе Эль-Айн. Это четвертый по численности город в стране, находящийся примерно в 150 км от столицы Абу-Даби. Домашние матчи проходят на современном стадионе «Хазза бин Зайед», вместимостью 22 717 человек.

Всего команда за 52 года существования (1968) завоевала 13 чемпионских титулов, что является рекордом чемпионата ОАЭ. Последний раз золотые медали «Аль-Айн» завоевывал в сезоне 2017/18. Также является семикратным обладателем Кубка ОАЭ, пятикратным обладателем Суперкубка ОАЭ и победителем Клубного кубка чемпионов Персидского залива. «Аль-Айн» — первый арабский клуб, выигравший Азиатский Кубок Чемпионов в 2003 году (ныне — Лига Чемпионов АФК).

Команда выступает в Премьер-лиге ОАЭ, который ведется по системе «осень-весна». Предыдущий сезон «Аль-Айн» завершил на четвертой строчке в турнирной таблице из 14-ти. Также «босс» (прозвище команды) в сезоне 18/19 пробился на клубный Чемпионат Мира. В полуфинале «Аль-Айн» переиграл именитый аргентинский «Ривер Плейт» в серии послематчевых пенальти (7:6), и лишь в финале турнира уступил тогдашнему обладателю Лиги Чемпионов — мадридскому «Реалу» со счетом 1:4.

В текущем сезоне Премьер-лиги ОАЭ «Аль-Айн» после 13-ти туров идет на третьей строчке в турнирной таблице, имея 24 очка в активе. Перед ним лишь «Аль-Джазира» (27 очков) и «Аль-Ахли» (35 очков). Также «Аль-Айн» в текущем сезоне вышел в групповую стадию Лиги Чемпионов АФК для победителей, призеров и обладетелей Кубков азиатских команд. Первый матч в этом турнире состоится 11 февраля, где клуб Исламхана в родных стенах сыграет против иранского «Сепахана».

С января клуб возглавляет 44-летний португальский специалист Педру Эмануэл, начинавший свой путь в молодежных командах «Порту», затем являлся ассистентом Андре Виллаша-Боаша в главной команде. С августа по ноябрь 2019 года работал главным тренером испанской «Альмерии», но был уволен из-за неудовлетворительных результатов. Также с 2014 по 2017 год «Аль-Айном» руководил нынешний тренер сборной Хорватии Злато Далич, с которым хорваты стали финалистами Чемпионата Мира-2018 в России.

Примечательно то, что Исламхан стал вторым по стоимости игроком в составе своей команды. Самым дорогим считается 29-летний бразильский нападающий Кайо Канедо, забивший пять мячей в текущем чемпионате. Общая стоимость эмиратской команды оценивается в 14,9 млн евро, в то время, как тот же «Кайрат» стоит 23,3 млн евро.

Арман Джаксыгулов

Извещение о произошедшем несчастном случаев на производстве

Извещение о произошедшем несчастном случаев на производстве

О происшедшем несчастном случае работодатель обязан проинформировать уполномоченные организации (ст. 228, ст. 228.1, ТК РФ).

Перечень таких организаций и срок, в течение которого необходимо направить извещение о несчастном случае, зависят от степени тяжести несчастного случая (см. таблицу).

Важно! Если работодатель не сообщит в орган ФСС России о страховом случае (вызванном несчастным случаем), ему грозит административная ответственность, предусмотренная КоАП.

Извещение о несчастном случае может быть передано по телефону, факсом, телеграфом и другими имеющимися средствами связи.

Факт направления извещения рекомендуется зафиксировать. В случае судебных разбирательств это позволит исключить обвинения в адрес работодателя в том, что он не сообщил о несчастном случае или сделал это с опозданием.

Если несчастный случай привел к тяжким последствиям или смерти работника, работодатель должен сообщить об этом родственникам пострадавшего. Такая обязанность предусмотрена ст. 228 ТК РФ.

Впрочем, в законе нет запрета на информирование родственников о любом несчастном случае.

Как известить родственников о происшествии, работодатель вправе решить сам с учетом ситуации: времени, места происшествия, тяжести несчастного случая, наличия телефонной связи, удаленности места жительства родственников и других факторов. Чаще всего о происшествии сообщают по телефону, телеграммой, письмом.

Факт извещения рекомендуется зафиксировать (получить копию телеграммы, телефонограммы и т.п.).

 

Организации, которые необходимо уведомить о несчастном случае, срок и форма извещения

 

Вид несчастного случая

 

 Извещаемая организация и нормативно- 
     правовой акт, устанавливающий    
        необходимость извещения       

 

   Срок    
направления
 извещения 

 

Форма извещения

 

Любой несчастный случай
(групповой, легкий, тяжелый, со смертельным исходом), происшедший с застрахованным лицом

 

Фонд социального страхования по месту регистрации работодателя в качестве страхователя

(пп. 6 п. 2 ст. 17 Федерального закона от 24.07.1998 N 125-ФЗ, ст. 228 ТК РФ, п. 5 Положения о расследовании несчастных случаев)         

В течение суток со дня наступления несчастного случая

 

Форма утверждена Приказом ФСС РФ от 24.08.2000 N 157.       

Групповой несчастный случай (два человека и более), тяжелый несчастный случай или несчастный случай со смертельным исходом (ст. 228.1 ТК РФ)        

1) Государственная инспекция труда субъекта РФ, на территории которого произошел несчастный случай.

2) Прокуратура по месту происшествия несчастного случая.

3) Администрация субъекта РФ и (или) администрация органа местного самоуправления по месту государственной регистрации работодателя в качестве юридического лица или индивидуального предпринимателя.

4) Работодатель, направивший работника, с которым произошел несчастный.

5) Территориальный орган соответствующего федерального органа исполнительной власти, контролирующего объект или организацию, на которых произошел несчастный случай (например, территориальный орган Ростехнадзора).

6) в исполнительный орган страховщика по вопросам обязательного социального страхования от несчастных случаев на производстве и профессиональных заболеваний.

6) Территориальное объединение профсоюзов.  

 

В течение суток со дня наступления несчастного случая   

Форма 1 утверждена Постановлением Минтруда России от 24.10.2002 N 73.

 

Несчастный случай, который по прошествии времени перешел в категорию тяжелых несчастных случаев или несчастных случаев со смертельным исходом (ч. 5 ст. 228.1 ТК РФ)

 

1) Государственная инспекция труда субъекта РФ, на территории которого произошел несчастный случай.

2) Территориальное объединение организаций профсоюзов.

3) Территориальный орган соответствующего федерального органа исполнительной власти, контролирующего объект или организацию, на которых произошел несчастный случай (например, территориальный орган Ростехнадзора).

4) Фонд социального страхования по месту регистрации работодателя в качестве страхователя.            

 

В течение трех суток после получения данных сведений   

 

Форма 1 утверждена Постановлением Минтруда России от 24.10.2002 N 73.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

куда ты пропал — Перевод на английский — примеры русский

Эти примеры могут содержать нецензурные слова, основанные на вашем поиске.

Эти примеры могут содержать разговорные слова на основе вашего поиска.

Дэнни, куда ты пошел после того как мы поговорили ранее?

Пле, куда ты ходил прошлой ночью?

Кейичи-кун, куда ты ходил когда болел?

Итак, , куда вы ходили сегодня вечером?

Клэр, куда ты ходила вчера после тренировки в группе поддержки?

Клэр… ¿a dónde fuiste ayer por la tarde después de la práctica de animadoras?

Ми-тян… куда ты пропала ?

Скажи, , куда ты ездил во время школьной поездки?

попасть туда. так куда ты ходил на праздники?

Позже той же ночью, , куда вы пошли, ?

Во-первых, куда вы пошли ?

Итак, , куда вы ходили прошлой ночью?

Дугал, куда ты пошел ?

Так или иначе, , куда вы пошли после передачи?

После катехизиса куда вы пошли ?

И куда вы пошли , миссис Пламмер?

Jax Jones и MNEK выпустили «Where Did You Go» послушайте

Он также выпустил лирик-видео

Автор: Анна Скай ХалтонОпубликовано 4 февраля 2022 г.
Последнее обновление 4 февраля 2022 г. с Эллой Хендерсон и «One Touch» с Джессом Глинном только что выпустили свою последнюю песню, и это еще одна ОЧЕНЬ запоминающаяся танцевальная мелодия.

Совместно с MNEK, Джакс только что выпустил «Where Did You Go» вместе с лирик-видео. Продолжение хита Jax Top 10 с Джоэлом Корри, «Out Out», «Where Did You Go», похоже, станет еще одним большим хитом.

Диджей дразнил эту коллаборацию уже пару недель, ранее называя ее «Моя самая большая запись» в твите, который он разместил со скриншотами нескольких сообщений с вопросом, когда песня выйдет.

Днем позже Джакс опубликовал короткое видео, тизерящее песню, в котором говорилось: «Лучший тизер новой песни, который вы когда-либо видели #wdyo».Поделившись запоминающимся припевом песни с коротким фрагментом вокала «Куда ты ушел», фанаты быстро догадались, что это коллаборация с MNEK.

Один фанат только что прокомментировал: ‘МНЭК!?’ с другой поговоркой: «это МНЭК?».

Теперь, когда хит получился, Jax также выпустил лирическое видео на YouTube, в котором есть кадры нескольких концертов на заднем плане, в то время как Jax DJs на переднем плане, а тексты песен мелькают на экране.

Конечно, Джакс и МНЭК работают вместе не в первый раз.На самом деле, MNEK однажды рассказал нам, что на самом деле это голос, который вы услышите во многих песнях Джакса, говорящий: «Что, что ты собираешься делать»! 👀

Вот некоторые из лучших альбомов 2022 года, а также то, что будет:

The Weeknd — «Dawn FM»

В пятницу, 7 января, нас порадовала совершенно новая музыка от The Weeknd, в виде его пятый студийный альбом «Dawn FM». В альбоме участвовали такие громкие имена, как Лил Уэйн, Тайлер Создатель и даже комик Джим Керри.

Years & Years’ Olly Alexander — ‘Night Call’

После того, как Years & Years объявили, что они продолжат сольный проект Olly Alexander, мы не могли ДОЖДАТЬСЯ, чтобы услышать, что певец приготовил для всех нас! После отложенного релиза наконец настал день 21 января, когда его сольный альбом ‘Night Call’ был официально выпущен — и можно с уверенностью сказать, что он содержит некоторые BOPS!

Аврил Лавин — «Love Sux»

Да, верно — Аврил официально вернулась! После поддразнивания тем, что в прошлом году у нее готовился новый альбом, единственная и неповторимая Аврил Лавин выпустила свой седьмой студийный альбом «Love Sux» 25 февраля 2022 года.

Легенда ‘Sk8er Boi’ даже объединилась с такими артистами, как Machine Gun Kelly и Mark Hoppus из blink-182, для записи некоторых новых треков.

Джеймс Артур — Делюкс-альбом «It’ll All Make Sense In The End»

Джеймс Артур выпустил свой четвертый студийный альбом «It’ll All Make Sense In The End» в ноябре 2021 года, но затем подарил нам делюксовое издание альбома, содержащее шесть новых треков, выйдет 11 марта.

Элла Хендерсон

Элла Хендерсон также порадует всех нас 11 марта 2022 года, выпустив свой второй альбом «Все, что я не сказала».Это был первый выпуск альбома певицы с момента ее дебюта «Chapter One» еще в 2014 году!

Гарри Стайлз

После успеха своих первых двух альбомов бывшая звезда One Direction Гарри Стайлс собирается выпустить свой долгожданный третий альбом «Harry’s House» 20 марта.

Джордж Эзра – «Малыш из золотой лихорадки»

У Джорджа Эзры определенно было захватывающее начало года, когда он выпустил свой игривый трек «Anyone For You» и даже объявил в день его выхода, что у него выходит новый альбом наш путь!

К счастью, нам не придется долго ждать, так как третий альбом Джорджа «Gold Rush Kid» выйдет у нас 10 июня 2022 года.

Льюис Капальди

Добившись БОЛЬШОГО успеха со своим дебютным альбомом ‘Divinely Uninspired to a Hellish Extent’, Льюис Капальди очень хотел взять отпуск, чтобы поработать над своим вторым альбомом.

Но похоже, что 2022 год может стать годом новой музыки Льюиса! В прошлом году певец заявил: «Я вернусь в 2022 году с новой музыкой и дерьмовой кучей концертов в самых разных местах по всему миру, в которые я только смогу попасть».

Cardi B

Поклонники отчаянно нуждались в новой музыке Cardi B с момента выпуска ее ОГРОМНЫХ треков «WAP» и «Up» в 2021 году.Певица объявила, что возьмет отпуск, чтобы поработать над новой музыкой, а в конце прошлого года сообщила, что надеется выпустить свой второй альбом в 2022 году!

Рианна

Ни для кого не секрет, что мир требует новой музыки RiRi. Несмотря на то, что Рианна давала различные намеки на то, что ее девятый альбом будет с нами очень скоро, похоже, в данный момент у нее могут быть другие мысли, поскольку в январе 2022 года она подтвердила, что ждет своего первого ребенка!

Несмотря на то, что певица впервые готовится стать мамой, в декабре 2021 года она сообщила, что «R9» будет с нами «скоро, скоро, скоро», так что мы все еще надеемся. ..

Saweetie

Дебютный альбом Saweetie под названием «Pretty B-tch Music» изначально должен был выйти в 2021 году после того, как она дразнила фанатов такими синглами, как «Tap In», «Back to the Streets» с участием Джене Айко. и «Лучший друг» с участием Doja Cat.

Альбом должен быть выпущен в этом году, в 2022 году, и Saweetie решила восстановить песни. Мы не можем ждать!

Теперь прочитайте:

8 песен, о которых вы никогда не знали, что они на самом деле написаны Джаксом Джонсом

MNEK: певец и продюсер прямо сейчас берет на себя музыку возвраты и невероятные соревнования настраиваются на Hits Radio в нашем приложении Hits Radio, на вашем радио DAB, на умных колонках или в Интернете.

Где вы пошли GIFS

продукты

  • GIF клавиатура
  • Android
  • Mac
  • Content Partners
  • Explore

    • Reactore GIFS
    • Explore GIFS

    Company

      Около

    • пресса
    • Блог
    • Часто задаваемые вопросы
    • Условия конфиденциальности
    • сайт
    • Свяжитесь с нами

    API

Tenor GIF API
  • GIF API Документация
  • Unity AR SDK
    • , где вы

    • Куда вы пошли meme

    наклейки

    Смотреть все наклейки
    • # White
    • # Lookin
    • # Lookin-FRO
    • # Lookin-FRO
      • # Где-you-at-Bitch
      • # What-Are-You-Doing
      • #Whats-Up
      • #Where-The-He-Ya-Been
        9017 1 # Где-вы-ушли
      • #Arlissa
    • # где-you-you
    • # Simon-Pryce
    • # Следуйте — вы дома
    • #Arlissa
    • # То-Где-Ты-Был
    • #tom
    • #Ничего-Я-Делаю-Чувствую-Правильно
    • #Где-Ты-Был-Это
    • #Верни-Мое-Верни Baby-to-me
    • # do-you-momant-me
    • #arlissa
    • # Джастин-Rarri
    • #looking
  • #mime
  • #bot
  • # Robot
  • #PORTAL
    • # там-you-Go
    • # kanan-Gill
    • # Там — You-Go
    • # Cameron-Dallas
    • #Где-Ты-Достали
    • #Там-Ты-Иди
    • #Баттерс-Стотч
    • #Tony-Talks
    • 9 0171 #iamtonytalks
    • # Boom-Baby
    • # Brad-Mondo
    • #BAM
    • #BAM
    • # Вы-Cant-Go
    • # Eric-Cartman
    • # Theres — ничего не беспокоит- Около
    • # Где-ныне:
    • # Move-In
    • # Truck
    • # Move
    • # Move
    • # Downerge
    • # Теперь — что-то To-do
    • # Что-то-то, что-у-у-признанному
    • #love
    • #you
    • # Get-It
    • # Kuldeep-Ka-Kamaal
    • # Что-я-мы еда
    • #cute
    • #
    • # Mad
    • #an
    • #an
    • #an
      • # Dimag-Kaise-Kharab-Hua
      • # Как-ты -Get-Here
      • #Вы-Нашли-Что-нибудь
      • #Bitch-Face
      • #queen
      • #Yas-Queen 901 72
      • # Do-You-Play
      • # Poom
      • #cute
      • # Brother
      • # Brother
      • # Brother
      • # Happy-International-Womans-День
      • # Cute-Sube
      • # #
      • #funny
      • # is-we-not-let — понятно
        • # Do-You-Public
        • # PC-Comment
        • # Вы должны идти — сейчас
        • # Там-we-go-go
        • # Вот — мы —
        • # Что-то ты собираешься
        • # Rich-Rebuilds
        • # Rich-Rebuilds
        • # это — это
        • # Candice-Hutchings
        • # У вас видимый — ее

        GIFS

            • #
            • #
            • #
            • # Reating
            • # Dead-Chat
            • #whaa
              #милый
            • #кошка
            • #очаровательный
            • #You-D idnt-get-gooknappoed-prode
          • # John-Travolta
          • # Confused
          • #
          • # Что
          • # где
          • # Где-you-at
          • # Где-ныне
          • # Nonemo
          • #
          • # Hey
          • # Где-you-Yo-Go
          • # Где-you-at-bitch
          • #keshawn
          • #emoji
          • # Nknocking
          • # is-you — там
          • # Family-Geam
          • # Get-Back-Good — Me
          • # Love-Me
          • # жОсины
          • #binoculars
          • #
          • # Window
          • # Где-ныне — вы
          • #CHICK
          • #searching
          • # Waiting
          • # Text-Back
          • #patient
          • #patient
          #sad
        • # Sourceated
        • # Где-нын
        • #waiting
        • #
        • # Куда-ты-идешь
        • #Все еще жду-ответа
        • 9 0171 #waiting
        • # Расскажите-мне — где-где-you-go-go
        • #hello
        • # You
        • # Hour
        • #Whereareyou
        • # Где — вы проходите
        • #arlissa
      • # где-you-You-Girl
      • #Jane
      • # Mr-Beam
      • # Waiting
      • # Где-you-Your
      • # Daddy-где You-go
      • # Little-Ressals
      • #donc
      • #waiting
      • # Waiting
      • # Куда — вы ушли
      • #Arlissa
      • # Lomising
      • #you
      • # собака
      • #прыгающий
      • #Где-ты-будешь
      • #Куда-ты-идешь
      • #Куда-ты-идешь
        • #Ты-живой
        • #Ты-живой
        • #17-живой
        • Немо
        • #poke
        • #Star-Wars
        • #alright
        • #Wtf-Did-You-Go
        • 90 179
          • # I-Miss-You
          • # Back-Back
          • #Sad
          • #aww
          • #aww
          • #aww
          • # Where-You-Go
          • # Kristen-Stewart
          • # Вы — там
          • # Джим-КАРРЕЙ
              • #stay
              • # Dont-Go
              • # Где-нын — вы идете
              • # Chired-You-Go
              • # Rob-Dyrdek
              • # Guardians -Это-галактика
            • # Где-ныне — вы
            • #ghosted
            • #gosted
              # Где-you-Yo-Go
            • # Hey-где-Did-You-Go
            • # ж
            • # где
            • #
            • #
            • # Вы
            • # Вы
            • # The-Haunting-of Bly-Manor
            • #titanical
            • # Где-you-You-Guys-Go
            • #Снупи
            • #Где-Ты-
            • #Смотри
            • #Ищу
            • #Ты-Туда-Туда
            • #спрашиваешь 90 172
            • #Куда-ты-пропал
            • #Где-ты-ты
            • #Куда-ты-идешь
            • #Куда-ты-север
            • id -Go-Wrong
            • #Where-Did-You-Go

            Усовершенствование инструментов метагеномного анализа для характеристики горизонтального переноса генов

            Образец цитирования: , куда вы пошли: Совершенствование инструментов метагеномного анализа для характеристики горизонтального переноса генов. PLoS Comput Biol 15(7): е1007208. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007208

            Редактор: Кристоф Дессимо, Университетский колледж Лондона, СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО

            Поступила в редакцию: 11 января 2019 г.; Принято: 24 июня 2019 г .; Опубликовано: 23 июля 2019 г.

            Авторское право: © 2019 Seiler et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

            Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в рукописи и файлах вспомогательной информации.

            Финансирование: Мы благодарим Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) за финансовую поддержку, номер гранта RE3474/2-1 и RE3474/2-2 для BYR (http://www. dfg.de/en/research_funding/index. html). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

            Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

            Введение

            Долгое время считалось, что эволюция с точки зрения переноса генов происходит только по древу жизни, то есть от родительского поколения к потомству. Открытие горизонтального переноса генов (HGT) [1–4] произвело революцию в этой догме и раскрыло механизм, который позволяет бактериям быстро адаптироваться к давлению окружающей среды [5–7]. С помощью HGT бактерии могут напрямую передавать один или несколько генов от одного человека к другому через границы видов. Известными и известными механизмами HGT являются трансформация (поглощение зарождающейся ДНК из окружающей среды), конъюгация (прямой перенос из клетки в клетку) и трансдукция (перенос через бактериофаги) [7].Во всех случаях часть последовательности ДНК прямо или косвенно переносится от так называемого донорского организма к акцепторному организму и интегрируется в геном (см. также рис. 1).

            Рис. 1. Обзор HGT и доказательства.

            Последовательность организма HGT состоит в основном из последовательности акцепторного генома (зеленый), и только перенесенная часть (синий ген) представлена ​​геномом донора. Следовательно, считывания из организма HGT должны в основном гомогенно сопоставляться с акцептором (зеленые стрелки), лишь немногие считывания должны локально сопоставляться с донором (синие стрелки), а некоторые пары считываний (красные стрелки) будут охватывать границу между зелеными частями от акцептор и синяя часть от донора.Эти шаблоны сопоставления могут быть представлены баллами на основе профиля покрытия сопоставления. Акцептор с однородным покрытием имеет высокий балл валидности и низкий балл гетерогенности, донор имеет противоположные диапазоны баллов (низкая валидность и высокая гетерогенность). Основываясь на этих оценках, оценка акцептора DaisyGPS равна ∈ [0, 1], а оценка донора равна ∈ [−1, 0].

            https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007208.g001

            В частности, конъюгация и трансдукция облегчают перенос островков патогенности и мобильных генетических элементов, включающих гены устойчивости к противомикробным препаратам (AMR) [8–10].Сегодня мы сталкиваемся с появлением так называемых «супербактерий» [10, 11] в результате адаптации бактерий и приобретения устойчивости к лечению антибиотиками, что свидетельствует о необходимости методов идентификации, характеристики и отслеживания событий ГПГ.

            Несоответствие между вертикальной филогенетической эволюцией и свидетельством горизонтального обмена и эволюции между ветвями филогенетического дерева вдохновило существующие методы HGT на основе генома. Для фиксированного набора видов и потенциального горизонтально переносимого гена эти методы обнаруживают события HGT, рассматривая несоответствия между генным деревом и филогенетическим деревом, построенным для набора видов [12].В качестве предварительного условия должен быть известен ген-кандидат, для которого можно выполнить расчет и сравнение. Методы, основанные на содержании последовательности, направлены на идентификацию генов чужеродного происхождения в данном геноме путем использования паттерна последовательности, такого как частоты k-mer или содержание GC, которые различаются у разных видов [13], [14]. Все методы основаны на собранных геномах, а это означает, что они также подвержены проблемам неправильной сборки. Хотя AMR являются ярким примером горизонтально переносимых генов, методы прямой идентификации генов устойчивости к противомикробным препаратам (AMR) не обязательно связывают присутствие гена AMR с событием HGT (например,г., KmerResistance [15]).

            В предыдущей работе мы разработали подход, направленный на вызов событий HGT непосредственно из данных секвенирования следующего поколения (NGS) [16] в инструменте под названием Daisy. Вместо того, чтобы сосредотачиваться на содержании последовательности или, скорее, несоответствиях в содержании последовательности организма, который приобрел гены через HGT, Дейзи исследует источник переноса, а именно заранее заданный организм-акцептор и донор, и напрямую сопоставляет чтения NGS с этими ссылками. Упрощая методы обнаружения структурных вариантов, мы можем, таким образом, идентифицировать область, перенесенную от донора, и место вставки внутри акцептора.Таким образом, предварительным условием для Daisy является то, что известны ссылки как на акцептор, так и на донор. Это, однако, не всегда так, и, следовательно, требуются методы, которые способны сделать вывод о акцепторных и донорных эталонных кандидатах из считываний NGS организма, который, как предполагается, является результатом события HGT. Таких методов пока нет.

            Тем не менее, проблема идентификации акцептора и донора непосредственно по данным NGS сродни проблеме, решаемой в исследованиях метагеномного профилирования, целью которых является расшифровка метагеномных образцов.Здесь подходы так называемой метагеномной классификации направлены на идентификацию всех организмов, присутствующих в образце, путем прямого анализа данных секвенирования со сложной смесью различных организмов [17]. Хотя в этом классическом сценарии все чтения одного организма в образце теоретически могут быть отнесены к одному эталонному организму во время идентификации, это не относится к организму, несущему чужеродные гены, приобретенные с помощью HGT. Большинство прочтений будет отнесено к геному акцептора, но только часть может быть сопоставлена ​​с геномом донора (см. сопоставленные чтения на рис. 1).Следовательно, мы должны учитывать эти два свойства сопоставления чтений во время анализа. Другим требованием является разрешение классификации на уровне штаммов, если это возможно, так как два штамма одного и того же вида уже могут значительно различаться по содержанию своей последовательности.

            Подходы к метагеномной классификации следуют либо зависимому от таксономии, либо независимому от таксономии подходу [18, 19]. Общая процедура для обоих подходов заключается в назначении считываний секвенирования, происходящих от одного и того же организма в образце, в одну и ту же группу, процесс, также называемый биннингом.Подходы таксономически зависимого бинирования относят чтения к определенным таксономическим группам и, таким образом, делают вывод о наличии этих таксонов в выборке. Эти методы либо также используют паттерны композиции последовательностей, например, Kraken [20], либо определяют сходство последовательностей на основе картирования для назначения чтения, например, MEGAN [21], Clinical PathoScope [22] или DUDes [23]. Оба подхода, скорее всего, идентифицируют акцепторную ссылку организма HGT из-за однородного охвата и сравнительно большого количества прочтений.Недостатком всех подходов к назначению считывания является ограничение присутствия мобильных генетических элементов, например, интегрированных с помощью HGT или до сих пор неизвестных или несеквенированных организмов в образце. Прочтения, принадлежащие этим генам или неизвестным организмам, либо относятся к похожим, но неверным таксонам, либо вообще не относятся, что приводит к неправильной идентификации и систематической ошибке в оценке численности. Чтобы обеспечить надежность, многие подходы намеренно отбрасывают таксономические кандидаты только с низким и локальным охватом.Следовательно, эти подходы, скорее всего, будут отбрасывать любые ссылки кандидатов-доноров. Методы, основанные на составе, такие как Kraken, также будут плохо определять правильного донора на основании доказательств лишь нескольких прочтений, учитывая довольно большое количество обычно обнаруживаемых видов.

            В нашей группе мы разработали MicrobeGPS [24], метагеномный подход, учитывающий последовательности, еще не представленные в базе данных. Вместо того, чтобы сообщать о фиксированных таксонах с назначенными прочтениями, MicrobeGPS, в свою очередь, использует таксоны-кандидаты для описания организмов в образце с точки зрения меры геномного расстояния.То есть он использует доступные эталоны для моделирования состава организмов, присутствующих в образце, с точки зрения профилей охвата и непрерывности, вместо прямого назначения эталонных организмов для характеристики образца. Если организм в образце присутствует в базе данных и покрыт однородно, то расстояние приближается к нулю. Если нет, MicrobeGPS идентифицирует ближайших родственников, помещая организм среди эталонов с наименьшим геномным расстоянием. Следовательно, инструмент учитывает баллы и показатели, которые отражают неоднородное покрытие, подобное донорскому, но отфильтровывает ложноположительные кандидаты с неоднородным покрытием с целью присвоения видов. С точки зрения обнаружения HGT они могут иметь большое значение и не должны исключаться.

            Здесь мы представляем DaisyGPS, пайплайн, основанный на концепциях MicrobeGPS и предназначенный для идентификации кандидатов в акцепторы и доноры из ридов секвенирования организма, которые могут быть вовлечены в событие HGT. DaisyGPS использует метрики расстояния до генома для определения оценки, которая позволяет классифицировать организмы на акцептора и донора. Благодаря свойствам этих оценок мы все равно находим ближайших родственников акцептора и донора, если этих ссылок нет в базе данных.Кроме того, DaisyGPS предлагает дополнительные черные списки и фильтр видов для уточнения пространства поиска кандидатов в акцепторы и доноры. DaisyGPS и Daisy интегрированы в один конвейер под названием DaisySuite, чтобы предложить комплексное обнаружение HGT. Мы проверяем DaisySuite на крупномасштабном моделировании, демонстрируя чувствительность и специфичность нашего подхода, а также его надежность при применении к образцам, не относящимся к HGT. Моделируя эволюционные расстояния, мы демонстрируем в другом эксперименте, что DaisySuite может обнаруживать HGT в организмах, которые отличаются от исходного акцептора и донора.Кроме того, мы использовали наборы смоделированных метагеномных данных из теста CAMI [25] в сочетании с нашими смоделированными чтениями HGT, чтобы показать, что DaisySuite способен обнаруживать HGT в метагеномных образцах. На реальном наборе данных о вспышке метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA) мы демонстрируем способность DaisySuite различать образцы, связанные со вспышкой, и неассоциированные образцы с точки зрения секвенированного содержимого, потенциально полученного в результате событий HGT.

            Материалы и методы

            Проблема обнаружения HGT на основе картирования по данным NGS двояка: во-первых, референс-акцептор (организм, который получает генетическую информацию) и эталон-донор (орган, от которого передается информация), которые участвуют в HGT. событие должно быть идентифицировано. В дальнейшем мы будем называть организм, который произошел от акцептора и приобрел гены от донора в случае HGT, как организм HGT . На основании этого можно охарактеризовать точную область HGT от донора и ее сайт встраивания в акцептор. Метод решения второй задачи мы представили в [16]. Здесь мы предлагаем инструмент DaisyGPS (см. также рис. 2) с целью выявления возможных кандидатов в геномы акцептора и донора с учетом прочтений чистого или метагеномного образца, содержащего потенциальный организм HGT.Мы предоставляем Daisy и DaisyGPS в интегрированном конвейере, который мы называем DaisySuite. DaisySuite общедоступен по адресу https://gitlab.com/rki_bioinformatics/DaisySuite, расширенную документацию можно найти по адресу https://daisysuite.readthedocs.io/en/latest/index.html.

            Рис. 2. Рабочий процесс DaisySuite.

            Входящие чтения NGS сначала обрабатываются DaisyGPS. Прочтения сопоставляются с NCBI RefSeq, а затем анализируются MicrobeGPS, который также включает таксономическую информацию, полученную из таксономической базы данных NCBI. На основании этого DaisyGPS вычисляет две оценки для классификации акцептора и донора (см. раздел «Методы»). В зависимости от этих оценок кандидаты с наивысшим рейтингом выбираются в качестве подходящих кандидатов-акцепторов и доноров. Затем Дейзи использует этих кандидатов для определения кандидатов в область HGT.

            https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007208.g002

            Геном организма HGT состоит в основном из акцепторного генома (см. рис. 1). Когда чтения организма HGT сопоставлены с эталоном акцептора, большинство прочтений должны отображаться правильно.Следовательно, можно ожидать высокого и непрерывного картирования генома акцептора. В отличие от этого, только небольшая часть донорского генома присутствует в геноме HGT-организма, следовательно, только небольшая часть прочтений должна сопоставляться с эталонным донором и только в пределах зонированной части (т. е. той части, которая имеет был переведен). Это приводит к прерывистому шаблону картографического покрытия, когда только небольшая часть эталона показывает высокое картографическое покрытие (см. рис. 1).

            На первом этапе нам необходимо определить метрики, которые представляют наши ожидания, т. е. какая часть генома покрыта считываниями (покрытие картирования) и насколько равномерно эти считывания распределены по геному (прерывистые или непрерывные паттерны). Учитывая только чтения HGT-организма, проблема идентификации акцептора и донора-кандидата аналогична аспектам метагеномного профилирования. Стандартной задачей в метагеномике является идентификация организмов в образце с использованием прочитанного набора данных этого образца.На первый взгляд может показаться, что методы, разработанные для решения этой проблемы, также могут быть применены к нашей цели идентификации, т.е. у нас есть прочитанный набор данных организма HGT, и мы ищем два организма (акцептор и донор), которые находятся в образец. Однако, поскольку организм HGT состоит в основном из акцепторного генома, такой подход хорошо работает только для идентификации акцептора. Для донора необходима дополнительная информация, чтобы гарантировать надежную идентификацию, потому что ссылки только с локальным или прерывистым охватом обычно отклоняются составителем профиля. Мы используем инструмент метагеномного профилирования MicrobeGPS, чтобы получить профиль покрытия нашего данного HGT-организма на основе картирования показателей покрытия. MicrobeGPS соответствует нашим требованиям, поскольку его можно настроить так, чтобы он не фильтровал какие-либо организмы и сообщал о дополнительных показателях, которые мы используем для представления атрибутов акцептора и донора. Мы оцениваем собранные показатели и устанавливаем оценку, которая отражает определенные нами свойства покрытия акцептора или донора. Кандидаты ранжируются по этому баллу, и создается список кандидатов-акцепторов и доноров.Затем эти кандидаты в акцепторы и доноры могут быть дополнительно проанализированы с помощью таких инструментов, как Daisy.

            DaisyGPS набрал

            баллов

            В целях обнаружения HGT мы стремимся определить оценку, отражающую свойства картирования эталонов акцептора и донора: Акцептор имеет непрерывное, однородное покрытие по всей длине генома. Донор имеет локальное, но все же однородное покрытие в области, где происходят переносимые гены, но в противном случае не должно иметь почти никакого покрытия. Кроме того, оценка должна обеспечивать четкое различие между кандидатами-акцепторами и донорами и обеспечивать значимое ранжирование в соответствии с вероятностью того, что они являются наиболее подходящими кандидатами.

            В качестве основы для нашей оценки мы используем Genome Dataset Validity , определенную в [26], и метрику гомогенности , определенную в [24]. Валидность набора данных генома или короткая валидность описывает часть эталонного генома, для которого есть прочитанные доказательства. Напротив, однородность отражает, насколько равномерно распределены чтения.Оба имеют диапазон ∈ [0, 1]. Достоверность определяется таким образом, что геном, который покрыт — либо низко, либо высоко — по всей длине, имеет высокую достоверность (≈ 1). Валидность можно интерпретировать как меру сходства последовательностей между секвенированным образцом и эталонным геномом. По аналогии с метрикой гомогенности мы определяем метрику гетерогенности на основе статистики теста Колмогорова-Смирнова, определенного в [24], так что равномерно покрытый геном имеет низкую гетерогенность (≈ 0), а геном с локальным высоким покрытием — высокую. неоднородность (≈ 1).Отметим, что неоднородность представляет собой вертикальный перенос однородности, определенной в [24], т. е. неоднородностей = 1 − однородностей .

            Акцептор — это геном с непрерывным, высоким покрытием, который затем имеет высокую достоверность (≈ 1) и низкую оценку гетерогенности (≈ 0), тогда как геном отдаленно родственного донора только с локальным, прерывистым покрытием имеет низкую достоверность (≈ 0 ) и высокий показатель неоднородности (≈ 1).

            Как можно видеть выше, и валидность, и гетерогенность дополняют друг друга для акцепторов и доноров, и, следовательно, отношение обеих метрик определяет свойство кандидата между тем, чтобы быть акцептором или донором-кандидатом.

            Определяем: (1)

            Кандидаты-акцепторы имеют однородное покрытие и, следовательно, высокую достоверность и низкую гетерогенность, т. е. достоверность > гетерогенность . Следовательно, значение для полностью покрытого акцептора с равномерным распределением считываний будет приближаться к +1. Точно так же значение для донора, охваченного только небольшим регионом, будет приближаться к -1. В дополнение к профилю покрытия есть убедительные доказательства по чистому количеству считываний для акцепторов: (2) где w — это доля всех сопоставленных прочтений, которые сопоставлены с конкретным кандидатом-акцептором.Однако для донора размер пересаживаемой области заранее неизвестен. Следовательно, мы не ожидаем конкретного свидетельства числа прочтений и поэтому опускаем взвешивание и определяем (3)

            Оба акцептора оценка и донор оценка определяются для каждого кандидата, и они имеют кодовый домен [-1, 1]. Следовательно, мы классифицируем кандидатов с акцептором баллов ≥ 0 как акцептор и ранжируем их от наивысшего к низшему баллу.Кандидаты в доноры имеют высокую гетерогенность и низкую валидность, то есть валидность < гетерогенность . Таким образом, мы классифицируем кандидатов с донорских баллов баллов < 0 как кандидатов-доноров и ранжируем их от самого низкого до самого высокого балла.

            Существует особый случай, когда акцептор и донор очень похожи. Здесь донор может не выражать атрибуты, которые мы ищем. В частности, у донора может быть значительное свидетельство числа прочтений, возникающее из-за прочтений акцептора, также сопоставленных с донором.Эти общие чтения приводят к покрытию большего количества областей донорского генома (более высокая достоверность) и к менее локальному, более однородному характеру покрытия по всему геному донора (более низкая гетерогенность), следовательно, достоверность гетерогенность и донора оценка ≈ 0. Чтобы такое событие произошло, сам истинный акцептор должен быть хорошо (и равномерно) покрыт достаточно, чтобы иметь признаки акцептора. Учитывая, что донор очень похож на акцептор, ярким примером является E.coli и Shigella , валидность донора сильно повышается, в то время как гетерогенность по-прежнему учитывает сильно покрытые части, происходящие из перенесенного региона, что позволяет получить положительный результат донора на баллов. В отличие от этого, отрицательный донор оценка может легко возникнуть из-за ложных прочтений, сопоставленных с эталонным геномом без высокого сходства с акцептором. Следовательно, мы вводим третью классификацию и классифицируем кандидатов с доноров баллов > 0 как акцептороподобных доноров и ранжируем их от самого низкого до самого высокого.

            Определяемое пользователем количество кандидатов с наивысшим рангом каждого класса (по умолчанию: два акцептора, три донора и два подобных акцептору донора) затем используется для сообщения обо всех возможных парах кандидатов акцептор-донор, т. е. декартовых акцепторов произведения × (доноры ∩ акцептороподобные доноры). Для всех этих пар запускается последующий запуск Daisy.

            Выбор кандидатов с фильтром черного списка (опционально)

            Существуют сценарии, в которых необходимо исключить некоторых кандидатов из отчета.Например, в случае повторного анализа собранная последовательность из прочтений образца может быть уже добавлена ​​в выбранный вами эталонный набор. Однако для обнаружения HGT из таких считываний нет никакой информации, если DaisyGPS сообщает об этой записи как о подходящем акцепторе. Другие примеры включают случаи, когда можно исключить определенные виды или таксоны из-за информации предварительного анализа, которая, тем не менее, может быть сообщена DaisyGPS из-за их высокого сходства последовательностей с отобранным организмом или предполагаемыми акцепторами или донорами-кандидатами.Чтобы поиск кандидатов в акцепторы и доноры можно было адаптировать для таких случаев, DaisyGPS заносит определенные таксоны в черный список. Можно исключить отдельные таксоны, полный таксон вида или полное поддерево ниже указанного таксона. Для запуска по умолчанию фильтр отключен.

            Выбор кандидатов с фильтром видов (опционально)

            DaisyGPS обычно рассматривает кандидатов на разных таксономических уровнях, т.е. вид и уровень штамма, а также сообщает об уровне-кандидате с лучшими оценками.Часто эталоны штаммов содержат дополнительные последовательности по сравнению с эталонным представителем на уровне видов, и, следовательно, эталоны видов будут в основном иметь однородное покрытие, что затем приведет к высокой оценке акцептора. Обычно достаточно идентификации на уровне вида. Однако существуют такие виды, как, например, E.coli , для которых уже секвенировано большое количество штаммов, отличающихся по своим свойствам, таким как патогенность среди штаммов (например, E.coli K12 по сравнению со штаммом EHEC O157:H7). ).В этих случаях простое обнаружение акцептора или донора на уровне вида может быть недостаточно точным. Для этих ситуаций мы внедрили фильтр видов. Если этот фильтр активирован, сообщаются только кандидаты ниже видового уровня. В случае, если с активным фильтром видов не будет сообщено ни одного кандидата, фильтр отключается, и пользователь информируется о том, что для дальнейшего анализа также используются кандидаты на уровне видов. Для запуска по умолчанию этот фильтр также отключен.

            Выбор кандидатов с ограниченным количеством отчетов по видам (необязательно)

            По умолчанию DaisyGPS сообщает о нескольких кандидатах-акцепторах в пределах одного и того же вида, учитывая, что они имеют одинаково высокие оценки. Если такой организм-кандидат находится в чрезмерно представленной группе базы данных, например, E. coli , он часто также чрезмерно представлен в зарегистрированных кандидатах из-за высокого сходства между штаммами одного и того же вида. В этом случае может быть полезно обеспечить более широкое представление о возможных кандидатах, ограничив число зарегистрированных представителей видов. Другой вариант использования может возникнуть, когда существует априорное знание о доноре и, при необходимости, в сочетании с другими фильтрами предпочтителен более подробный обзор подходящих видов.Для таких случаев мы внедрили фильтр, который позволяет указать, сколько кандидатов на вид сообщается. Мы рекомендуем использовать этот фильтр для метагеномных образцов, чтобы отразить высокое разнообразие образца среди акцепторных и донорских кандидатов.

            Интеграция Daisy и интеграция со Snakemake

            Snakemake — это обычная система управления рабочими процессами [27], которую мы использовали для реализации различных этапов DaisyGPS. Мы создали файл выравнивания, необходимый для MicrobeGPS, путем сопоставления прочтений организма HGT с NCBI RefSeq (полный RefSeq, без плазмид, загружен 15 марта 2017 г.) [28] с использованием Yara [29, 30] в режиме all-mapper , я.е. все подходящие попадания сообщаются для каждого попадания. Чтобы обеспечить совместимость, мы также повторно реализовали рабочий процесс Daisy в Snakemake и интегрировали их в комбинированный пакет (называемый DaisySuite, см. также рис. 2). DaisyGPS дает настраиваемое количество акцепторов, доноров и акцептороподобных доноров (по умолчанию: 2, 3, 2). Для каждой возможной пары акцептора и донора предполагается гирляндный вызов. Затем Дейзи пытается идентифицировать области HGT для каждой пары акцептор-донор и сообщает о них как о кандидатах, если области превышают пороговые значения, определенные в [16] для картирования покрытия, количества разделенных чтений и количества пар считываний между акцептором и донором.Оба конвейера по-прежнему могут работать независимо. Чтобы облегчить установку, мы предоставляем сценарий установки и предоставляем компоненты DaisySuite в виде пакетов Conda [31]. Моделирование также интегрировано в конвейер DaisySuite (подробности см. в документации DaisySuite).

            Экспериментальная установка

            Наборы данных.

            Мы протестировали полный комплект DaisySuite на трех типах наборов данных, чтобы проверить как DaisyGPS, так и интеграцию с Daisy. Первый тип включает набор данных H.pylori , набор данных KO11FL и набор данных EHEC.Все три были использованы в публикации Daisy (подробное описание набора данных см. в [16]) и выбраны как подходящие наземные исследования и с целью демонстрации воспроизводимости. Второй тип включает крупномасштабное моделирование, аналогичное моделированию H.pylori . Для оценки чувствительности и специфичности DaisySuite используются как положительные (симуляция HGT), так и отрицательные (без HGT) модели. Кроме того, моделируются различные эволюционные временные рамки и контексты метагеномных образцов. В третьей части мы используем реальные данные из набора данных о вспышках с 14 образцами MRSA, чтобы прояснить дальнейшую применимость обоих DaisySuite. Детали наборов данных и экспериментов in silico поясняются ниже.

            H. pylori. Набор данных Helicobacter pylori представляет смоделированный набор данных для доказательства принципа, уже использованного для проверки в статье Дейзи (подробности геномного моделирования см. в [16]). Акцептор – Escherichia coli K12 substr.Dh20B (NC_010473.1), донором является штамм H. pylori M1 (NZ_AP014710.1). Перенесенная in silico фаговая область H. pylori включает область размером 28 т.п.н. в геномных позициях 1 322 000—1 350 000. Сайт вставки в акцептор расположен в позиции 1 120 261.

            ЭГЕС. Организм HGT в наборе данных EHEC представляет собой E.coli O157:H7 Sakai [32], который произошел от E.coli O55:H7 и, как предполагается, приобрел шига-токсины (Stx) посредством трансдукции от Шигелла дизентерия . По литературным данным, бактериофаг, несущий Stx, предположительно располагается по адресу 2 643 556—2 694 691 в E.coli O55:H7. В работе [16] мы предложили альтернативный сайт встраивания фага 1 741 535—1 744 926.

            .

            КО11ФЛ. Набор данных KO11FL включает трансгенный штамм E.coli KO11FL [33]. Акцептором является E.coli W, а двумя донорами являются Zymomonas mobilis и клонирующий вектор pBEN77.

            Крупномасштабное моделирование. Мы разработали крупномасштабную симуляцию, аналогичную набору данных H.pylori , с положительными и отрицательными симуляциями. Для каждой положительной симуляции сначала случайным образом выбираются акцептор и донорский организм среди доступных последовательностей RefSeq (дата поиска: 21 марта 2017 г., плазмиды игнорируются из соображений согласованности размеров). Случайная область размером 28 т.п.н. выбирается из донора и вставляется в случайное положение в акцептор. Размер 28 Кбит выбран для систематического повторения одной симуляции из файла H.pylori например. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и небольшие вставки и делеции (инделы) вводят отдельно в акцепторную и донорную области (коэффициент SNP: 0,01, коэффициент вставок: 0,001). Для каждой отрицательной симуляции случайным образом выбирается только акцептор, а SNP и вставки вводятся с той же скоростью, что и выше. Прочтения размером 150 п.н. моделируются из фрагментов размером 500 п.н. со стандартным отклонением 50 п.н. с помощью симулятора Мейсона [34]. Положительные и отрицательные симуляции автоматически повторяются 100 раз.

            Моделирование с разной частотой мутаций. Чтобы оценить надежность DaisySuite при обработке большего количества исторических событий HGT, мы выполнили моделирование на наборе данных H. pylori с растущими уровнями мутаций. Начиная с частоты SNP, равной 0,01, и скорости делеции, равной 0,001, мы увеличиваем обе частоты для 10 шагов на 0,01 (SNP) и 0,001 (индексы), в результате чего получается максимальная частота SNP, равная 0,1, и максимальная скорость делеции, равная 0,01. Следовательно, мы создали 10 симуляций, введя как SNP, так и небольшие вставки в соответствующих показателях, например.грамм. 0,01 SNP и 0,001 малых вставок для первой выборки, 0,02 SNP и 0,002 малых вставок для второй выборки и так далее. Каждый шаг моделирования повторяется дважды, чтобы избежать случайных артефактов.

            Моделирование метагеномных образцов. Чтобы продемонстрировать применимость метагеномных образцов, мы используем данные первой задачи CAMI (Critical Assessment of Metagenome Interpretation) ([25], http://www.cami-challenge.org) для создания трех симуляций различной сложности в отношении количество организмов в образце.Задача CAMI предоставила три типа смоделированных наборов данных с различной сложностью ( низкий , средний и высокий ), т.е. количество организмов в образце увеличивается (от 40 до нескольких сотен) с ростом сложности. Мы выбираем один образец для каждого уровня сложности (низкий: RL_S001__insert_270, средний: RM1_S001__insert_5000, высокий: RH_S001__insert_270). Во всех трех случаях мы получаем всплеск считываний из набора данных H. pylori . И наш набор данных, и наборы данных задачи CAMI созданы из смоделированных чтений Illumina 150 п.н.Для каждого набора данных из задачи CAMI мы используем 10% случайных прочтений с подвыборкой ([35] не показал потери чувствительности при профилировании для этой частоты подвыборки). Мы всплескиваем 10% случайных подвыборок из набора данных H. pylori , что приводит к среднему 10-кратному покрытию, для которого сайт HGT все еще должен быть обнаружен.

            Вспышка MRSA. Набор данных по MRSA состоит из 14 образцов устойчивых к метициллину штаммов Staphylococcus aureus , полученных во время вспышки MRSA в отделении интенсивной терапии новорожденных (инвентарный номер ENA ERP001256, [36]).С вспышкой связаны семь образцов, обозначенных в этой рукописи O1-O7, остальные семь образцов N1-N7 не связаны со вспышкой. Описание образца и инвентарные номера серий указаны в разделе результатов. Филогенетический анализ, проведенный [36], разделил 14 образцов на отдельные группы в соответствии с их связью со вспышками. Эталонный изолят, использованный в этом исследовании, представляет собой эпидемический MRSA EMRSA-15, представитель HO 5096 0412, и мы используем его в качестве исходной истины для кандидатов-акцепторов, о которых сообщает DaisyGPS.Семь образцов MRSA, связанных со вспышками, имеют отчетливую картину устойчивости к противомикробным препаратам, и считается, что родственные гены устойчивости были введены через HGT. С помощью DaisySuite мы хотим выяснить, имеют ли штаммы вспышки одни и те же области HGT и можно ли их отличить от штаммов, не вызывающих вспышки.

            Структура проверки

            Настройка проверки соответствует типам наборов данных. На первом этапе мы хотим показать доказательство концепции данных с достаточной достоверностью.Цель состоит в том, чтобы предсказать правильных акцепторных и донорных кандидатов с помощью DaisyGPS и в то же время воспроизвести результаты, полученные с помощью Daisy. Поэтому мы используем наборы данных, уже показанные в статье Дейзи, для согласованности. Мы настроили DaisyGPS так, чтобы сообщать в общей сложности о двух кандидатах-акцепторах, четырех кандидатах-донорах и двух кандидатах-донорах, подобных акцепторам, для каждого набора данных, и мы оцениваем, есть ли среди них правильные кандидаты-акцепторы и доноры. Для неправильных кандидатов акцептора и донора Daisy не должна сообщать о кандидатах HGT, если только перенесенная область не присутствует в нескольких штаммах или присутствует несколько возможных акцепторов с высоким сходством последовательностей, например.г., среди штаммов E.coli . Для набора данных EHEC мы активируем фильтр видов, поскольку нас интересуют штаммы-кандидаты, а также дополнительные таксоны черного списка из организма HGT для анализа ( E.coli O157:H7, таксон 83334) и полная линия O157 (родительский таксон 1045010). Для набора данных KOFL11 организм HGT также занесен в черный список ( E.coli KOFL11, таксон 595495). Во второй части мы хотим оценить уровень чувствительности и специфичности DaisySuite.Мы разработали крупномасштабную симуляцию, аналогичную набору данных H.pylori , с положительными и отрицательными симуляциями (по 100 симуляций в каждой). На основе положительных результатов моделирования мы рассчитываем чувствительность как для DaisyGPS, так и для Daisy (определения показателей см. ниже). DaisyGPS разработан с учетом высокой чувствительности и всегда сообщает о наиболее подходящих кандидатах с учетом данных секвенирования, даже для организмов, не относящихся к HGT. Следовательно, DaisyGPS также будет сообщать о кандидатах для отрицательных симуляций, и мы ожидаем, что здесь будет низкая специфичность.Дейзи, однако, должна затем сообщить только о нескольких кандидатах HGT из пар акцептор-донор, если таковые имеются. Кроме того, мы хотим проверить, насколько HGT-организм может мутировать, прежде чем истинный акцептор и донор больше не будут обнаружены. Мы используем набор данных H. pylori и вставляем SNP и небольшие вставки с разной скоростью. Мы повторяем эту процедуру два раза для десяти различных частот мутаций, в результате чего получается 20 наборов данных. Затем мы проверяем для каждого образца, может ли DaisyGPS по-прежнему обнаруживать истинного акцептора и донора, и если да, то может ли Daisy обнаруживать истинную область HGT.Кроме того, мы хотим оценить применимость метагеномных образцов с помощью трех смоделированных метагеномных образцов различной сложности, которые включают считывания из набора данных H. pylori . DaisySuite по-прежнему должен сообщать о правильных акцепторных и донорских кандидатах для набора данных H. pylori . MicrobeGPS является инструментом метагеномного профилирования и, следовательно, будет сообщать обо всех организмах в образце наряду с истинными акцепторными и донорскими кандидатами. Следовательно, мы должны скорректировать наши настройки и процедуру для этого анализа: чтобы сообщить о большем количестве отдельных кандидатов для последующего анализа, мы увеличиваем количество сообщаемых акцепторных и донорных кандидатов до 30 соответственно, но устанавливаем максимальное количество кандидатов на вид равным одному. Мы проводим последующий анализ Daisy только для истинного акцептора и донора, если сообщается о паре. Для метагеномных образцов мы обычно рекомендуем эту процедуру разделения запусков DaisyGPS и Daisy, настраивая и пробуя различные настройки фильтра для DaisyGPS, а затем запуская Daisy только для наиболее вероятных кандидатов.

            В последней ознакомительной части мы тестируем DaisySuite на реальных данных с неизвестными или неопределенными исходными данными. Набор данных о вспышках MRSA состоит из 14 образцов, семь из которых связаны со вспышками, а семь — не связаны.Здесь мы хотим проверить, может ли DaisySuite различать образцы вспышки и не вспышки в соответствии с их заявленными кандидатами на акцептор, донор и область HGT.

            Определение показателей оценки

            Интерпретация различных статистических данных зависит от проверяемой гипотезы. В нашем анализе в крупномасштабном моделировании мы различаем два сценария: в первом мы ожидаем обнаружения события HGT (положительный тест), а в другом мы предполагаем отсутствие события HGT (отрицательный тест). .Для каждой симуляции или прогона вызов DaisyGPS приведет к тому, что Daisy будет оценивать несколько пар. Поэтому мы различаем статистику по сериям и статистику по парам, что мы объясним ниже.

            Для DaisyGPS во время положительного теста мы рассматриваем одиночный запуск как истинно положительный (TP), если сообщается о правильной паре акцептор/донор. Соответственно, ложноотрицательный результат (FN) возникает, когда не сообщается правильная пара. Поскольку количество зарегистрированных пар задается нашими настройками, у нас почти всегда будет фиксированное количество последующих проверок (за исключением случаев, когда недостаточно кандидатов для отчета), и поэтому мы сообщаем количество прогонов вместо пар.Следовательно, мы можем определить чувствительность как TP / #Runs. В условиях отрицательного теста мы считаем те циклы истинно отрицательными (TN), где либо не сообщается ни о каких парах, либо акцептор и донор пары являются одним и тем же организмом. Обратите внимание, что если другие подходящие кандидаты недоступны, один и тот же организм может быть указан и как акцептор, и как донор из-за сортировки по соответствующим баллам, например. даже организм, уже зарегистрированный как акцептор с донором баллов > 0, может быть заявлен как донор, если нет кандидата с более низким донором баллом .Все остальные пары рассматриваются как FP, каждая из которых вызывает ненужную проверку в нижестоящих инструментах. Поскольку нас интересует, сколько прогонов не вызвало верификации, мы можем охарактеризовать специфичность по TN/#Runs. Хотя в обоих случаях очевидно, что следует полагаться на точное совпадение сообщаемых результатов и исходных данных, сообщаемый организм все же может быть очень близок к исходному организму с точки зрения сходства последовательностей (отрицательные и положительные параметры) и даже включать очень регионы, участвующие в событии HGT (положительная установка).Чтобы учесть это, мы также используем BLASTN в случае, если не было сообщено о TP, и сравниваем FP с достоверной информацией. Если Blast идентифицирует FP с наземной правдой выше 80%, мы меняем классификацию с FP на TP с поддержкой BLAST (Blast TP), поскольку Дейзи все еще может сделать вывод о правильной области HGT из этих Blast TP с учетом достаточной последовательности. сходство.

            В Daisy мы оцениваем пары акцептор/донор, поэтому статистика определяется на основе состояния пары, сообщаемого DaisyGPS.В положительном моделировании пары Daisy TP — это те, которые представляют правильную пару и обнаруживаются Daisy. Отсюда непосредственно следует, что каждая правильная пара, не поддерживаемая Daisy, может рассматриваться как ложноотрицательная (FN). Учитывая, что пара неверна, то есть FP от DaisyGPS, где акцептор или донор неправильный, мы считаем правильно не поддерживаемую пару как истинно отрицательную (TN), а ошибочно обнаруженную пару как FP. Чтобы измерить, сколько пар правильно идентифицировано, мы определяем чувствительность как (TP + TN) / #Pairs.Учитывая отрицательную настройку теста, нас в основном интересуют пары, о которых ошибочно сообщается, что они участвуют в событии HGT. Мы объявляем эти пары как FP и описываем специфичность как (#Pairs—FP) / #Pairs. Отсюда также следует, что все пары, которые не обнаружены, являются TN. Подробное описание классификаций см. в таблице S1.

            Наконец, в контексте полного конвейера DaisySuite мы оцениваем объединенные результаты DaisyGPS и Daisy. Каждая пара, сообщаемая DaisyGPS для одной симуляции, вызывает оценку Daisy.Поскольку общий результат конвейера должен указывать, содержит ли моделирование событие HGT или нет, классификация запуска DaisySuite зависит исключительно от консолидированных результатов каждой оценки Daisy для одного моделирования. В положительной тестовой настройке мы хотим найти ровно одну пару, которая представляет событие HGT. Из этого следует, что полный запуск DaisySuite может быть классифицирован как TP, если Daisy поддерживает только правильную пару, т. е. Daisy сообщает о TP, а не о FP. Это также означает, что DaisyGPS необходимо обнаружить TP.Точно так же в условиях отрицательного теста TN возникает, если Дейзи вообще не сообщает о кандидатах на HGT.

            Настройки и предварительная/постобработка

            DaisySuite запускается с параметрами по умолчанию, начиная с версии 1. 2.1, если не указано иное. В версии 1.3.0 была введена возможность ограничить максимальное количество зарегистрированных кандидатов для каждого вида. Однако новая версия не внесла никаких изменений в используемые версии программного обеспечения, параметры по умолчанию или другие алгоритмические аспекты DaisySuite.Параметр для объединения потенциально перекрывающихся кандидатов HGT в Daisy установлен на 20 п.н., следовательно, перекрывающиеся области с начальной и конечной позициями, отличающимися более чем на 20 п.н., сообщаются как отдельные кандидаты. Для сравнения количества и содержания последовательностей HGT мы кластеризовали перекрывающиеся кандидаты HGT с помощью инструмента usearch9 (v9.1.13_i86linux32) с идентификатором 1.0 [37].

            Для проверки мы определяем истинное присутствие области HGT в образцах, сопоставляя считывания образца со всеми предполагаемыми сгруппированными областями с помощью Bowtie2 (версия 2.2.4). Для сравнения мы берем среднее покрытие каждого региона и применяем сигмоидальную функцию, чтобы сопоставить все средние покрытия с пространством [0,5,1] для отображения значимой тепловой карты. Применение сигмоидальной функции и тепловой карты вычисляется в R (версия Rscript 3.3.3). Функция тепловой карты в R по умолчанию использует иерархическую кластеризацию с полной привязкой, и мы отключили дендрограмму для столбцов. Кроме того, мы выполняем выравнивание всего генома с помощью плагина Mauve (версия 2.3.1) как часть программного обеспечения Geneious (версия 10.0.5) для установления общих областей HGT среди образцов. Для этого мы объединяем все области HGT выборки и разделяем области сегментами 1000*’N’, чтобы избежать фрагментированных областей или перекрывающихся локальных коллинеарных блоков (LCB).

            Результаты

            Идентификация акцептора и донора с помощью DaisyGPS

            В первой части проверки мы тестируем DaisyGPS на трех наборах данных из смоделированных и реальных данных с достаточной достоверностью и уже предварительно оцененных с помощью Daisy.Поскольку DaisySuite сочетает в себе оба инструмента, DaisyGPS и Daisy, цель состоит в том, чтобы воспроизвести наши предыдущие результаты даже без предварительного определения донора и акцептора.

            Набор данных H.pylori был смоделирован на основе E.coli K12 substr. Dh20B в качестве акцептора и штамм H. pylori M1 в качестве донора. DaisyGPS успешно сообщает как таковые (полные отчеты кандидатов и HGT см. в таблицах S2 и S3), а последующий запуск Daisy также сообщает об истинном сайте HGT. В дополнение к единственному истинному кандидату HGT, о котором ранее уже сообщалось в статье Daisy, DaisySuite сообщает о другом сайте FP HGT для региона из Haemophilus ducreyi .Область HGT, зарегистрированная для штамма H. ducreyi GHA9, не имеет постоянного сходства с областью HGT из H.pylori (отсутствие бластных ударов длиннее 15 п.н., см. Таблицу S4). Однако область на H. ducreyi разделяет первые 1200 п.н. и последние 1300 п.н. с акцептором E.coli K12 substr. Dh20B на нескольких сайтах, и поскольку начало и конец области покрыты, обнаруживается почти в шесть раз больше разделенных прочтений, чем для истинного акцепторного сайта. Общее покрытие региона относительно низкое: 30x по сравнению с 95x у H.pylori , но явно достаточно высокий, чтобы пройти фильтр покрытия.

            EHEC E.coli O157:H7 Sakai предположительно получен в результате события HGT, когда дефектный профаг был перенесен из Shigella dysenteriae в E.coli O55:H7. Оба указаны DaisyGPS как кандидаты (см. Таблицу S5). В соответствии с его сильным сходством последовательностей с видами E.coli , S.dysenteriae помечен как донор-кандидат, подобный акцептору.Предлагаемый альтернативный сайт вставки HGT из нашей предыдущей статьи Daisy все еще сообщается (см. Таблицу S6).

            Набор данных KO11FL включает трансгенный вариант E.coli W с перенесенными генами из Zymomonas mobilis и плазмиду, которая здесь не анализировалась. DaisyGPS успешно сообщает о E.coli W и Zymomonas mobilis как о кандидатах в акцепторы и доноры (см. Таблицу S7). Дейзи не сообщает ни о каких кандидатах FP HGT.

            Оценка чувствительности, специфичности и надежности DaisySuite посредством крупномасштабного моделирования

            После проверки DaisyGPS на данных, ранее оцененных с помощью Daisy в качестве доказательства принципа, мы анализируем DaisySuite с точки зрения надежности и чувствительности, выполняя крупномасштабное моделирование.Мы выполняем моделирование для набора данных H.pylori рандомизированным и автоматизированным способом, создавая 100 симуляций с переданной областью HGT. Чтобы оценить надежность, мы также выполняем 100 отрицательных симуляций, в которых моделируется геном акцептора, но не вставляется область HGT. При положительном моделировании мы можем оценить чувствительность всего комплекта DaisySuite. Для DaisyGPS мы оцениваем, сколько из 100 симуляций имеют правильный геном акцептора и донора.Поскольку DaisyGPS сообщает о более чем одной потенциальной паре акцептор-донор, мы учитываем попадание TP, если среди них есть истинная пара, и учитываем только FN, если об истинной паре вообще не сообщалось. В случае, если правильная пара не указана (акцептор, донор или оба), мы рассматриваем пары с идентичностью последовательности Blast> 80% также как потенциальную пару-кандидатов HGT, а также считаем их TP. Для оценки Daisy мы рассматриваем все пары, предложенные DaisyGPS.

            Для истинной пары, о которой сообщает DaisyGPS, Daisy может либо сообщить о регионе TP HGT, либо о FN, если регион не может быть идентифицирован.Для пары акцептор-донор, ошибочно предложенной DaisyGPS, Daisy может либо сообщить об отсутствии региона-кандидата HGT (TN), либо о совпадении FP. Когда мы суммируем результаты DaisySuite по всем парам одной симуляции, мы подсчитываем TP для этой симуляции только в том случае, если Daisy не сообщила ни о каких FP (несмотря на любые TP или TN).

            В таблице 1 приведены результирующие подсчеты для DaisyGPS и для полного комплекта DaisySuite, суммированные по 100 симуляциям. DaisyGPS обеспечивает чувствительность 79%. Из 79 TP 22 основаны либо на неправильном акцепторе, либо на доноре, либо на том и другом, но все еще имеют достаточное сходство Blast с исходным акцептором или донором, чтобы считаться TP согласно нашей оценке. 69% TP и FP привели к звонку TP или TN от Дейзи. Примечательно, что все FP DaisySuite являются FP Blast.

            Таблица 1. Моделирование положительного HGT.

            DaisyGPS называет правильных кандидатов на акцептор и донор с чувствительностью 79%. Общая чувствительность для DaisySuite из 100 симуляций HGT в отношении правильных акцепторных и донорных кандидатов с последующим правильным вызовом сайта HGT составляет 69%.

            https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007208.t001

            В таблице 2 указано количество зарегистрированных пар, предложенных DaisyGPS, и подробный подсчет на основе каждой пары для Daisy.Затем из полученных 818 пар Daisy сообщает о правильной области HGT или об отсутствии области HGT из DaisyGPS FP с чувствительностью 89%.

            В дополнение к положительным симуляциям мы выполнили еще 100 отрицательных симуляций, в которых мы случайным образом выбирали и варьировали геном акцептора, но не вставляли какие-либо чужеродные области от донора. Теперь DaisyGPS может либо произвести попадание TN, т. е. вообще не сообщать о кандидатах, либо о кандидатах FP. Так как DaisyGPS очень чувствителен по своей конструкции, мы ожидаем, что он обычно будет сообщать о кандидатах, и, следовательно, мы хотим оценить, вызывают ли эти отрицательные HGT отчеты при последующем вызове Daisy.Как и ожидалось, специфичность DaisyGPS очень низкая и составляет 6% (см. Таблицу 3). Однако Дейзи сообщает только о шести FP из 743 пар, т. е. три симуляции дали отчет FP HGT.

            Таблица 3. Моделирование отрицательного HGT.

            Для 100 отрицательных симуляций DaisyGPS правильно сообщает об отсутствии кандидатов в акцепторы и доноры для шести симуляций. Из 94 симуляций, вызывающих последующую оценку с помощью Daisy, только три приводят к вызову FP с учетом всех результатов от DaisySuite (обобщенных по 100 симуляциям).Daisy оценивает 743 пары и имеет всего шесть вызовов области FP HGT из всех этих пар.

            https://doi.org/10.1371/journal. pcbi.1007208.t003

            Из этих результатов мы можем сделать вывод, что DaisySuite способен отличать HGT от не-HGT организмов и очень надежен, если HGT отсутствует.

            Оценка генетической дивергенции

            Чтобы определить, насколько надежен наш метод, если истинные акцепторы и доноры отклоняются от репрезентативного генома в базе данных, мы провели моделирование эволюционных расстояний, введя увеличение количества SNP и малых вставок в H.pylori набор данных. Мы использовали набор данных H. pylori для создания 20 симуляций с различной частотой мутаций. Мы вводили как SNP, так и вставки, начиная с коэффициента 0,01 и 0,001 соответственно. Затем мы увеличили показатели на 0,01 (SNP) и 0,001 (вставки) всего за 10 шагов, получив максимальную скорость SNP 0,1 и максимальную скорость вставки 0,01. Каждый шаг повторялся дважды для учета случайности мутаций и моделирования чтения.

            В таблице 4 показаны результаты обнаружения кандидатов с помощью DaisyGPS. Для этого эксперимента мы использовали настройки по умолчанию, в частности, мы сообщаем о двух акцепторах и трех донорах. Для скорости SNP до 0,03 и скорости инделирования 0,003 мы можем надежно определить правильного акцептора и донора как кандидатов с наивысшим рейтингом на уровне деформации. Более высокая частота мутаций скрывает истинного акцептора, делая других представителей семейства Enterobacteriaceae более похожими на HGT-организм, так что истинный акцептор (на уровне штамма) больше не входит в число двух кандидатов с наивысшим рейтингом.Для коэффициентов SNP 0,03–0,04 и коэффициентов инделей 0,003–0,004 представлены представители семейства для Enterobacteriaceae . Для более высоких скоростей мутаций сообщается о представителях вида для E. coli . Ранги истинных акцепторов и доноров см. в таблице S8.

            Таблица 4. Кандидаты на различные частоты мутаций.

            Каждая строка показывает, на каком таксономическом уровне — если вообще — истинный акцептор и донор были зарегистрированы среди двух лучших кандидатов на данный SNP и малую долю вставок. * сигнализирует о том, что только в одном из двух повторений было сообщено о правильном напряжении.

            https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007208.t004

            В целом донор может быть обнаружен на уровне деформации даже при более высоких скоростях. Для уровней SNP в диапазоне от 0,01 до 0,09 мы обнаруживаем истинного донора по крайней мере один раз среди трех лучших кандидатов в двух повторениях. Это может быть связано с тем фактом, что лишь небольшая часть организма HGT происходит от донора и, следовательно, менее сильно изменена случайно распределенными мутационными событиями.При частоте SNP 0,1 сообщаются только представители вида E. coli , следовательно, настоящий донор не поддается обнаружению.

            Для дальнейшего изучения того, приводят ли заявленные кандидаты к обнаружению области HGT, мы продолжили запуск Daisy. Для всех наборов данных, для которых истинно положительные акцептор и донор были указаны на уровне штамма, Дейзи смогла определить правильное место события HGT. Другие штаммы E. coli также преодолели пороговые значения и впоследствии также были зарегистрированы, хотя истинное место всегда было или среди мест с наивысшим баллом.Количество зарегистрированных сайтов HGT увеличивается по мере роста скорости мутаций, и, начиная с частоты мутаций 0,04 (SNP) и 0,004 (indel), также можно наблюдать, что количество зарегистрированных местоположений значительно увеличивается, что делает практическую оценку невозможной. . Это ясно показывает ограничения основанного на картировании подхода в отношении генетической дивергенции, особенно у таких широко представленных и очень похожих видов, как E. coli .

            Применимость для метагеномных образцов

            Чтобы оценить применимость метагеномных образцов, мы используем три смоделированных набора метагеномных данных с добавлением прочтений из H.pylori набор данных. Наборы метагеномных данных взяты из задачи CAMI и имеют разную сложность с точки зрения количества содержащихся организмов, классифицируемых как низкий , средний и высокий . Чтобы учесть метагеномный контекст, мы устанавливаем количество зарегистрированных акцепторов и доноров равным 30 соответственно и сообщаем только об одном кандидате на вид. Истинный акцептор E.coli K12 входит в число 20 лучших кандидатов (низкий ранг 7, средний ранг 8, высокий ранг 18, ​​полные списки зарегистрированных кандидатов см. в таблицах S9–S11), поэтому максимальное количество акцепторных кандидатов составляет 20. было бы достаточно для идентификации даже для выборки высокой сложности.Идентификация донора является более сложной задачей из-за меньшего количества прочтений, которые могут быть назначены. Тем не менее, настоящий донор H.pylori входит в число 30 лучших кандидатов (низкий ранг 12, средний ранг 7, высокий ранг 24). Последующий запуск Daisy для истинной пары акцептор-донор успешно сообщает о правильной области HGT для всех трех сложностей.

            Изучение обнаружения HGT с помощью DaisySuite на основе данных о вспышках MRSA

            Обычно считается, что штаммы

            MRSA часто подвергаются событиям HGT [38, 39]. Рассматриваемый здесь набор данных по MRSA состоит из 14 образцов, семь из которых относятся к вспышке MRSA (O1-O7) и семь образцов MRSA, не связанных со вспышкой (N1-N7), но произошедших в тот же период времени [36]. [36] проанализировали все 14 образцов и сравнили их с представителем EMRSA-15 НО 5096 0412 как предположительно ближайшим родственником штаммов вспышки. Сначала мы оцениваем кандидатов-акцепторов и доноров, о которых сообщила DaisyGPS, в отношении предложенной ссылки HO 5096 0412, а затем исследуем кандидатов на область HGT, о которых сообщила Daisy, в отношении возможного различия между вспышкой и вирусом.образцы без вспышки. Мы активируем фильтр видов, так как нас снова интересуют кандидаты на уровень деформации.

            Для всех образцов вспышки O1-O7, S.aureus HO 5096 0412 был зарегистрирован DaisyGPS как акцептор-кандидат (см. Таблицу 5 и Таблицы S12–S39 для индивидуальных результатов для каждого из 14 проанализированных наборов данных MRSA). О том же акцепторе сообщалось и для образцов N2, N6 и N7, не связанных со вспышками. Кандидатами-акцепторами для образца N1 являются S.aureus ECT-R-2 и N315, для N3 и N4 S.aureus MSSA476 и MW2, а для N5 S.aureus MRSA252. Хотя это и не связано со вспышкой, образцы N3 и N4 взяты у пациентов, которые жили в одной палате в больнице, где произошла вспышка, и, следовательно, могут быть связаны между собой [36].

            Таблица 5. Акцептор и количество кандидатов на область HGT.

            Для 10 из 14 образцов EMRSA-15 (HO 5096 0412) был заявлен как акцептор-кандидат. Это включает все образцы вспышки. В столбце областей HGT указано количество зарегистрированных областей HGT, а в столбце EMRSA-15 в качестве акцептора для областей HGT указано соответствующее количество, о котором сообщалось с HO 5096 0412 в качестве акцептора.

            https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007208.t005

            Зарегистрированные доноры в основном одинаковы как для вспышек, так и для образцов без вспышек (см. Таблицу 6). Ни один донор не был зарегистрирован исключительно для образцов вспышки, но три донора были зарегистрированы только для штаммов N1, N4 и N6, не связанных со вспышкой. Это штаммы S.epidermidis ATCC 12228 и PM221, а также Enterococcus faecium Aus0004. Хотя S.aureus HO 5096 0412 был зарегистрирован для всех образцов вспышки, нет четкого различия между кандидатами на акцептор и донор, о которых сообщила DaisyGPS, за исключением доноров, не являющихся только вспышками.

            Таблица 6. Сумма зарегистрированных доноров для всех образцов.

            Образцы как связанных, так и несвязанных со вспышкой в ​​основном сообщают об одних и тех же донорах-кандидатах с небольшими вариациями (подробности см. в таблицах S12–S39). Сообщается об уникальных донорах только для неассоциированных образцов N1, N4 и N6.

            https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007208.t006

            В таблице 5 указано общее количество сгруппированных областей HGT и количество сгруппированных областей, где HO 5096 0412 является акцептором, обнаруженных с помощью DaisySuite.Следовательно, большинство областей HGT имеют представителя EMRSA-15 в качестве акцептора.

            На рис. 3 показано сиреневое выравнивание объединенных областей HGT всех 14 образцов. Существует четкая связь между областями HGT из семи нижних образцов O1-O7, которые являются образцами, связанными со вспышкой. Образцы N1-N7 также имеют общие регионы, но не имеют четкой связи, как среди штаммов, связанных со вспышкой. Перекрытие между вспышками и не вспышками HGT также невелико.

            Рис. 3. Лиловое выравнивание объединенных областей HGT.

            Области HGT всех образцов выравниваются с помощью Mauve для установления общих областей между ними. Образцы, связанные со вспышкой (O1-O7) в нижней части, разделяют большую часть своих областей, тогда как неассоциированные образцы (N1-N7) в верхней части не имеют.

            https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007208.g003

            На рис. 4 показано наличие 41 области HGT, определенной путем сопоставления покрытия, вызванного Дейзи, среди всех выборок. Цель анализа охвата состоит в том, чтобы снова оценить, различаются ли регионы HGT между штаммами, вызывающими вспышку, и штаммами, не являющимися вспышками, а также оценить, существуют ли регионы, общие для всех штаммов вспышки, которые являются кандидатами FN для Daisy, или регионы, вообще не охваченные, которые являются вероятными кандидатами в FP.

            Рис. 4. Тепловая карта покрытия области HGT.

            Средние покрытия областей HGT из всех выборок рассчитываются для каждой выборки и сравниваются после применения сигмоидальной функции. Порядок строк получается иерархической кластеризацией с полной связью, реализованной в сигмоидальной функции. Сплошные зеленые пятна указывают на отсутствие укрывистости, сплошные охристые высокие укрывистости. Регионы 34 и 37 не включены ни в одну выборку и, следовательно, вызовы FP. Образец O6 показывает наличие нескольких областей HGT, вызываемых DaisySuite для других образцов, но пропущенных здесь.Существует отчетливое присутствие областей HGT между образцами вспышки в верхней части и неассоциированными образцами в нижней части.

            https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007208.g004

            Кластеризация выборок в соответствии с дендрограммой, показанной на рис. 4, была выполнена автоматически (см. раздел настроек) и, следовательно, отражает соотношение выборок в соответствии с картографическое покрытие предлагаемых регионов HGT.

            Все штаммы вспышки сгруппированы вместе и имеют общие области HGT.Все штаммы, не вызывающие вспышки, для которых DaisyGPS не сообщила о EMRSA-15 в качестве кандидата-акцептора, сгруппированы дальше всего от штаммов, вызвавших вспышку (N1, N3—N5). Вероятно родственные образцы N3 и N4 сгруппированы вместе. Что касается различия между штаммами, вызывающими вспышки, и штаммами, не вызывающими вспышки, DaisySuite может определять области HGT, связанные со вспышкой, которые отличаются от кандидатов на HGT для штаммов, не вызывающих вспышки. Следовательно, различение возможно. Хотя DaisySuite вызвал только один регион HGT для O6, мы можем сделать вывод из профиля охвата, что присутствуют и другие регионы HGT, используемые для других образцов вспышки, но они были пропущены DaisySuite.Как видно на тепловой карте, кластеры 34 и 37 не покрыты какой-либо выборкой и, следовательно, вероятны FP. Мы обнаружили ген AMR mecA в Кластере 0, однако устойчивость общая для всех 14 образцов согласно [36]. В других кластерах не обнаружено никаких других генов AMR, протестированных [36]. Однако большинство этих генов AMR находятся на плазмидах, которые здесь не анализировались.

            Обсуждение

            Мы представили DaisyGPS, конвейер, который использует стратегии метагеномного профилирования для идентификации кандидатов в акцепторы и доноры из прочтений NGS потенциального организма HGT.DaisyGPS вместе с Daisy является частью комплексного пакета обнаружения HGT DaisySuite. Мы успешно проверили DaisyGPS на смоделированных и реальных данных, ранее проанализированных в [16]. Мы также продемонстрировали надежность DaisySuite в крупномасштабном моделировании со 100 отрицательными тестами HGT, показав, что DaisySuite правильно сообщает об отсутствии событий HGT со специфичностью 97%. При крупномасштабном моделировании со 100 положительными симуляциями HGT DaisySuite сообщает о правильном событии HGT с общей чувствительностью 69%.Из 818 пар, зарегистрированных DaisyGPS среди 100 симуляций, Дейзи назвала области TP и TN с чувствительностью 89%. Наконец, мы оценили DaisySuite на наборе данных о вспышках MRSA с семью образцами, связанными со вспышкой, и семью, не связанными со вспышкой, но произошедшими в один и тот же период времени. Здесь мы можем показать, что DaisySuite успешно различает связанные и несвязанные образцы в отношении их предполагаемых областей HGT, т. е. образцы вспышек показывают разное количество и содержание зарегистрированных областей HGT.

            Следует признать, что все штаммы вспышки имеют высокое сходство последовательностей со штаммом EMRSA-15, что не обязательно относится к штаммам, не связанным со вспышкой. Это также отражено в результатах DaisyGPS, где S.aureus HO 5096 0412 является лучшим кандидатом-акцептором для всех вспышечных штаммов, но о некоторых штаммах, не вспыхивающих, вообще не сообщается. Из этого непосредственно следует, что анализ, основанный на сравнении последовательностей, выполненный с помощью DaisySuite, вероятно, обнаружит разные закономерности для штаммов, вызывающих и не вспыхивающих, и разница в кандидатах в области HGT может показаться очевидной. Однако, начиная с установления такого различия, имеет смысл затем проанализировать кандидаты на общие области HGT среди штаммов, связанных со вспышкой. Для этого доказательства концепции мы выполнили относительно простую оценку, выполнив анализ покрытия всех областей HGT во всех образцах и изучив наличие генов AMR в областях HGT. Но дальнейший тщательный последующий анализ происхождения и функциональности, обеспечиваемой потенциальными участками HGT, может помочь нашему пониманию риска и патогенности этих вспышечных штаммов.

            Однако наблюдаемые кандидаты FP и FN также выявляют недостатки подхода сравнения последовательностей. DaisyGPS разработан с упором на чувствительность и, следовательно, неизбежно приводит к тому, что Дейзи проверяет пары кандидатов на акцептор и донор. Поскольку эти FP по-прежнему связаны с достаточной степенью покрытия картами, ложные раздельные чтения и считывания с охватом могут вызвать последующие вызовы FP, как это наблюдается для смоделированного набора данных из E. coli K12 Dh20 и H.pylori .Однако зарегистрированный сайт HGT из H.ducreyi имеет сходство только в начальной и конечной частях предложенного региона по сравнению с перенесенным регионом H.pylori . Сайты вставки также могут находиться в повторяющихся областях, что усиливает негативное влияние неоднозначных отображений. Это подчеркивает, что критическая оценка прогнозов HGT всегда имеет решающее значение. Чтобы помочь интерпретировать прогнозы HGT от DaisySuite, заявленные акцепторные и донорные кандидаты ранжируются в соответствии с их соответствующей оценкой, и в окончательных результатах VCF сообщается только те сайты HGT, которые соответствуют установленным пользователем пороговым значениям (перечисленным в полном файле результатов TSV).В дополнительных таблицах результатов мы указали параметры, используемые для фильтрации или настройки в соответствии с требованиями набора данных. Мы также предоставляем документацию по использованию на https://daisysuite. readthedocs.io/en/latest/tutorial/example.html.

            Из отсутствующих вызовов области HGT для образца O6, который можно вывести из анализа покрытия, мы можем сделать вывод, что DaisySuite не обнаруживает все области HGT из-за недостаточности доказательств. Потенциальной причиной может быть то, что DaisyGPS не сообщил о правильном доноре.Даже если бы DaisyGPS смогла найти подходящий донорский геном, все еще вероятно, что содержание генома различается между областью, присутствующей в доноре, и областью, фактически присутствующей в организме HGT. Альтернативный, дополнительный подход к решению этой проблемы отсутствия подходящего донора-кандидата может заключаться в облегчении локальной сборки инсерционной последовательности. Предлагая идентифицированные последовательности вставок, мы по-прежнему можем предоставить содержимое потенциальной последовательности HGT и, таким образом, обеспечить последующий анализ.Этот подход также будет поддерживать обнаружение новых последовательностей HGT, отсутствующих в текущих справочных базах данных, и, следовательно, также обнаружение, например, новых генов устойчивости к противомикробным препаратам. Popins [40] — это инструмент для вызова вставки на основе популяции, разработанный для данных секвенирования человека (см., например, [41]). Popins только локально собирает несопоставленные чтения (тот же ввод, что и для Daisy), а Velvet руководствуется ссылкой, тем самым сводя к минимуму риск потенциальных ошибок сборки. Помимо сборки, Попинс сначала использует связующие пары (см. красные пары чтения на рис. 1), чтобы поместить вставку в (акцепторную) ссылку, а затем выполняет локальное выравнивание разделенного чтения вокруг потенциальной точки останова.Если предоставляется несколько образцов, Popins объединяет контиги разных образцов в суперконтиги, предполагая, что одна и та же вставка присутствует в нескольких образцах. Хотя различные бактериальные образцы не представляют популяцию в том виде, в каком она дана для популяции людей, образцы, связанные со вспышками, по-прежнему напоминают популяцию, поэтому для этой цели можно использовать Попины и получать ценную информацию. Однако локальная сборка вставки только свидетельствует о вставке по сравнению с выбранным эталоном акцептора, что не обязательно означает, что вставка произошла в результате события HGT. Следовательно, сначала необходимо определить средства для сложного включения результатов сборки вставки в контекст HGT. Несмотря на доказательства события HGT, которые может предоставить DaisySuite, результаты всегда следует проверять на наличие альтернативных причин, таких как потеря гена.

            Ограничения

            Наши метагеномные анализы показывают, что DaisySuite способен обнаруживать HGT не только в чистых образцах. Однако автоматическое обнаружение событий HGT с помощью DaisySuite в метагеномных образцах имеет ограничения, если разнообразие в образце становится более сложным.DaisyGPS использует инструмент метагеномной классификации MicrobeGPS и, следовательно, идентифицирует организмы в образце как часть конвейера. Все идентифицированные организмы с однородным покрытием сами по себе являются возможными кандидатами в акцепторы. Мы увеличили пороговые значения для зарегистрированных акцепторов, а также кандидатов-доноров до 30 записей соответственно и ограничили количество кандидатов на вид до одного, так что наземные акцептор и донор смоделированного H. pylori все еще перечислены. Обратите внимание, что это число зависит не только от количества организмов в образце, но и от сходства их последовательностей, особенно с ожидаемыми акцепторами и донорами-кандидатами.

            Полученные в результате 400 последовательных запусков потребуют слишком много вычислительного времени и места для систематического и автоматического отслеживания. Как правило, для метагеномных образцов мы рекомендуем сначала запускать DaisyGPS, а затем определять ограниченный набор вероятных кандидатов для последующего анализа. Для будущих разработок мы бы предложили интегрировать другую фильтрацию на основе сопоставления для этого определения, где мы будем искать вероятные пары через считывания с парными концами, при этом одно считывание сопоставляется с акцептором, а другое — с кандидатом-донором.Мы используем этот критерий также в дальнейшем исследовании Дейзи в качестве доказательства, но, по нашему мнению, он также хорошо послужит для фильтрации кандидатов (пар).

            [42] применили метод, аналогичный методу Daisy, для обнаружения мобильных генетических элементов (МГЭ) в микробиоме кишечника человека. Хотя это исследование показывает общую применимость нашего подхода в крупномасштабном метагеномном исследовании, основное внимание здесь может быть уделено только коллекции присутствующих или отсутствующих МГЭ в микробиоме (а не конкретных штаммов). [42] также отмечают, что такая характеристика MGE более значима при анализе временных рядов, а не на моментальном снимке одной выборки.Дейзи также применялась для определения горизонтально перенесенных генов в вирусе радужной дафнии 1 [43], что показывает, что наш подход может быть применен в дальнейшем в других контекстах, кроме бактерий.

            DaisySuite использует сходство на основе сопоставления для определения кандидатов. Это может привести к систематическим ошибкам, если в базе данных отсутствуют истинные кандидаты или исторические события скрыты за счет улучшения. DaisyGPS по-прежнему будет сообщать о следующих лучших кандидатах (т. е. с наибольшим сходством последовательностей), но FP в нашем крупномасштабном моделировании, возникающем в результате попаданий Blast, уже показывают потенциал для последующих ошибок.Кроме того, наше моделирование на эволюционных расстояниях ясно показывает ограничения для идентификации акцептора и донора выше определенного расстояния. Это ограничение также идет рука об руку с достаточным охватом секвенирования, чтобы избежать дальнейшей систематической ошибки из-за случайных ошибок секвенирования, а также обеспечить надежный последующий анализ Дейзи. Исходя из наших экспериментов, мы рекомендуем обеспечить как минимум 10-кратное покрытие секвенирования.

            DaisySuite расширяет возможности программ, предназначенных для решения различных задач, включая картирование, метагеномное профилирование и обнаружение структурных вариантов.Хотя это позволяет нам объединить сильные стороны каждого инструмента для решения проблемы обнаружения HGT, мы также уязвимы для узких мест, связанных со временем выполнения отдельных шагов. В частности, наборы данных, которые создают большие результаты сопоставления и/или содержат много раздельных чтений, могут значительно увеличить время выполнения. В общем, общее время работы на стандартной машине составляет от одного до двух часов для обработки стандартного образца, например, набора данных H. pylori . Однако очень большие или разнообразные наборы данных, такие как созданные в нашем эксперименте по генетической дивергенции, увеличат время выполнения и в крайних случаях сделают их невозможными для запуска.Основным узким местом для DaisyGPS является метагеномное профилирование с помощью MicrobeGPS, тогда как для Daisy обнаружение разделенных прочтений Густавом и, если Густав обнаруживает достаточно раздельных прочтений, само обнаружение HGT. В будущем мы надеемся облегчить эту проблему, модернизируя или помогая модернизировать соответствующие инструменты.

            Как и все вычислительные методы, они не могут полностью заменить критическое человеческое мышление и должны быть проверены другими способами. В исследовании обнаружения HGT мы рекомендуем использовать другие методы обнаружения HGT (вычислительные и / или влажные лаборатории) для подтверждения результатов отдельных методов.Хотя мы считаем это важным, мы считаем, что обеспечение такой перекрестной проверки выходит за рамки DaisySuite.

            Заключение

            С помощью DaisyGPS мы представляем инструмент для идентификации акцептора и донора из прочтений NGS организма HGT. Для этого DaisyGPS уточняет метрики, уже определенные и используемые для целей метагеномного профилирования, для учета профилей охвата акцептора и донора. Мы интегрировали DaisyGPS с Daisy в комплексный пакет обнаружения HGT под названием DaisySuite, который обеспечивает автоматический рабочий процесс, чтобы сначала определить кандидатов на акцептор и донор, а затем идентифицировать и охарактеризовать области HGT из предложенных пар акцептор-донор.Мы успешно оценили DaisyGPS на данных, ранее проанализированных с помощью Daisy, и продемонстрировали чувствительность и надежность DaisySuite в крупномасштабном моделировании с 100 смоделированными положительными и отрицательными событиями HGT. Кроме того, мы могли бы продемонстрировать преимущества анализа HGT с помощью DaisySuite на наборе данных о вспышках MRSA, где DaisySuite сообщил о кандидатах HGT, которые помогают различать образцы, связанные со вспышкой, и не связанные со вспышкой, и, следовательно, также предоставляют информацию для характеристики штамма вспышки.

            Каждое мгновение, все, что вам нужно

          • [ПРЕДЗАКАЗ] Кремовая футболка Every Moment + виниловый набор Cloudy Blue

            Запись/винил + цифровой альбом

            Фирменная футболка из парусины

            **ВНИМАНИЕ: ЭТО ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ ЗАКАЗ, КОТОРЫЙ ОЖИДАЕТСЯ ПОСТАВИТЬ В МАЯ 2022 ГОДА В СВЯЗИ С ТРЕБОВАНИЯМИ ПРОИЗВОДСТВА ВИНИЛА.**

            МЫ БОЛЬШЕ НЕ БУДЕМ ПОДАВАТЬ ЭТОТ ЦВЕТ. ИЗОБРАЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ ВЫ ВИДИТЕ, НЕ ВСЕГДА ГАРАНТИРУЮТ ВИД ВИНИЛОВОГО ПРОДУКТА, НО ОН БУДЕТ БЛИЗКИМ.

            Включает неограниченную потоковую передачу Каждый момент, все, что вам нужно через бесплатное приложение Bandcamp, а также высококачественную загрузку в форматах MP3, FLAC и других форматах.

            отправка 10 мая 2022 г. или около того

            выпуск 13

            Можно приобрести с подарочной картой

            Купить пластинку/винил 50 долларов
            Отправить в подарок
          • [ПРЕДЗАКАЗ] Черная футболка Every Moment + виниловый набор Cloudy Blue

            Запись/винил + цифровой альбом

            Фирменная футболка из парусины

            **ВНИМАНИЕ: ЭТО ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ ЗАКАЗ, КОТОРЫЙ ОЖИДАЕТСЯ ПОСТАВИТЬ В МАЯ 2022 ГОДА В СВЯЗИ С ТРЕБОВАНИЯМИ ПРОИЗВОДСТВА ВИНИЛА. **

            МЫ БОЛЬШЕ НЕ БУДЕМ ПОДАВАТЬ ЭТОТ ЦВЕТ. ИЗОБРАЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ ВЫ ВИДИТЕ, НЕ ВСЕГДА ГАРАНТИРУЮТ ВИД ВИНИЛОВОГО ПРОДУКТА, НО ОН БУДЕТ БЛИЗКИМ.

            Включает неограниченную потоковую передачу Каждый момент, все, что вам нужно через бесплатное приложение Bandcamp, а также высококачественную загрузку в форматах MP3, FLAC и других форматах.

            отправка 10 мая 2022 г. или около того

            издание 10 3 осталось

            Можно приобрести с подарочной картой

            Купить пластинку/винил 50 долларов
            Отправить в подарок
          • [ПРЕДЗАКАЗ] Облачно-синий винил

            Запись/винил + цифровой альбом

            **ВНИМАНИЕ: ЭТО ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ ЗАКАЗ, КОТОРЫЙ ОЖИДАЕТСЯ ПОСТАВИТЬ В МАЯ 2022 ГОДА В СВЯЗИ С ПРОБЛЕМАМИ ПРОИЗВОДСТВА ВИНИЛА. **

            МЫ БОЛЬШЕ НЕ БУДЕМ ПОДАВАТЬ ЭТОТ ЦВЕТ. ИЗОБРАЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ ВЫ ВИДИТЕ, НЕ ВСЕГДА ГАРАНТИРУЮТ ВИД ВИНИЛОВОГО ПРОДУКТА, НО ОН БУДЕТ БЛИЗКИМ.

            Мы больше не будем подавлять этот цвет. Изображения, которые вы видите, не всегда будут гарантировать внешний вид винилового продукта, но он будет близок к этому. В этом варианте изготавливается 525 единиц.

            Включает неограниченную потоковую передачу Каждый момент, все, что вам нужно через бесплатное приложение Bandcamp, а также высококачественную загрузку в форматах MP3, FLAC и других форматах.

            отправка 10 мая 2022 г. или около того

            выпуск 525 1 осталось

            Можно приобрести с подарочной картой

            Купить пластинку/винил 23 доллара
            Отправить в подарок
          • компакт диск

            Компакт-диск (CD) + цифровой альбом

            ВНИМАНИЕ: ЭТО ПОСТАВЛЯЕТСЯ 25 ФЕВРАЛЯ ИЛИ ПРИМЕРНО. Один диск вставлен в футляр для драгоценностей с 6-панельным буклетом.

            Включает неограниченную потоковую передачу Каждый момент, все, что вам нужно через бесплатное приложение Bandcamp, а также высококачественную загрузку в форматах MP3, FLAC и других форматах.

            отправляется в течение 14 дней

            Можно приобрести с подарочной картой

            Купить компакт-диск 12 долларов
            Отправить в подарок
          • Цифровой альбом

            Потоковое + Загрузка

            Включает неограниченную потоковую передачу через бесплатное приложение Bandcamp, а также высококачественную загрузку в форматах MP3, FLAC и других форматах.

            Можно приобрести с подарочной картой

            Купить цифровой альбом $8
            Отправить в подарок

          • [ПРЕДЗАКАЗ] Оранжевый винил Galaxy

            Запись/винил + цифровой альбом

            **ВНИМАНИЕ: ЭТО ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ ЗАКАЗ, КОТОРЫЙ ОЖИДАЕТСЯ ПОСТАВИТЬ В МАЯ 2022 ГОДА В СВЯЗИ С ПРОБЛЕМАМИ ПРОИЗВОДСТВА ВИНИЛА. **

            МЫ БОЛЬШЕ НЕ БУДЕМ ПОДАВАТЬ ЭТОТ ЦВЕТ. ИЗОБРАЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ ВЫ ВИДИТЕ, НЕ ВСЕГДА ГАРАНТИРУЮТ ВИД ВИНИЛОВОГО ПРОДУКТА, НО ОН БУДЕТ БЛИЗКИМ.

            В этом варианте выпускается 525 шт.

            Включает неограниченную потоковую передачу Каждый момент, все, что вам нужно через бесплатное приложение Bandcamp, а также высококачественную загрузку в форматах MP3, FLAC и других форматах.

            Продано

          • [ПРЕДЗАКАЗ] Черная футболка Every Moment + виниловый набор Galaxy Orange

            Запись/винил + цифровой альбом

            Фирменная футболка из парусины

            **ВНИМАНИЕ: ЭТО ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ ЗАКАЗ, КОТОРЫЙ ОЖИДАЕТСЯ ПОСТАВИТЬ В МАЯ 2022 ГОДА В СВЯЗИ С ТРЕБОВАНИЯМИ ПРОИЗВОДСТВА ВИНИЛА. **

            МЫ БОЛЬШЕ НЕ БУДЕМ ПОДАВАТЬ ЭТОТ ЦВЕТ. ИЗОБРАЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ ВЫ ВИДИТЕ, НЕ ВСЕГДА ГАРАНТИРУЮТ ВИД ВИНИЛОВОГО ПРОДУКТА, НО ОН БУДЕТ БЛИЗКИМ.

            Включает неограниченную потоковую передачу Каждый момент, все, что вам нужно через бесплатное приложение Bandcamp, а также высококачественную загрузку в форматах MP3, FLAC и других форматах.

            Продано

          • [ПРЕДЗАКАЗ] Кремовая футболка Every Moment + виниловый набор Galaxy Orange

            Запись/винил + цифровой альбом

            Фирменная футболка из парусины

            **ВНИМАНИЕ: ЭТО ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ ЗАКАЗ, КОТОРЫЙ ОЖИДАЕТСЯ ПОСТАВИТЬ В МАЯ 2022 ГОДА В СВЯЗИ С ТРЕБОВАНИЯМИ ПРОИЗВОДСТВА ВИНИЛА. **

            МЫ БОЛЬШЕ НЕ БУДЕМ ПОДАВАТЬ ЭТОТ ЦВЕТ. ИЗОБРАЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ ВЫ ВИДИТЕ, НЕ ВСЕГДА ГАРАНТИРУЮТ ВИД ВИНИЛОВОГО ПРОДУКТА, НО ОН БУДЕТ БЛИЗКИМ.

            Включает неограниченную потоковую передачу Каждый момент, все, что вам нужно через бесплатное приложение Bandcamp, а также высококачественную загрузку в форматах MP3, FLAC и других форматах.

            Продано

          • Поделиться / Встроить

          • выпущен 25 февраля 2022 г.

            ℗ + © 2021 фетр
            Все песни написаны и исполнены Мэтью Доти
            Барабаны в исполнении и записи Джеймса Макалистера
            Вокал «Where Did You Go» написан и исполнен Кэролайн Лафкин
            Дополнительный синтезатор на «Far From Over» Оливера Чапоя
            Проектирование и дополнительное производство, Крис Коди
            Сведение Дэйва Фридманна @ Tarbox Road Studios, Кассадага, Нью-Йорк
            Помощник инженера по микшированию: Майкл Фридманн
            Мастеринг: Грег Калби и Стив Фаллоне @ Sterling Sound
            Фотография и дизайн от Philistine DSGN

            Сильный дождь собирается падать

            О, где ты был, мой голубоглазый сын?
            О, где ты был, мой милый юноша?
            Я наткнулся на склон двенадцати туманных гор
            Я ходил и полз по шести кривым дорогам
            Я ступил посреди семи унылых лесов
            Я был перед дюжиной мертвых океанов
            Я проехал десять тысяч миль в устье кладбища
            И это сложно, и это сложно, это сложно, это сложно
            И дождь будет сильный

            О, что ты видел, мой синеглазый сын?
            О, что ты видел, мой милый юноша?
            Я видел новорожденного, а вокруг него дикие волки
            Я видел дорогу из бриллиантов, на которой никого не было
            Я видел черную ветку с кровью, которая продолжала капать
            Я видел комнату, полную мужчин с истекающими кровью молотами
            Я увидел белую лестницу, всю в воде
            Я видел десять тысяч болтунов, у которых все языки были сломаны
            Я видел ружья и острые мечи в руках маленьких детей
            И это тяжело, и это тяжело, это тяжело, это тяжело
            И дождь будет сильный

            И что ты слышал, мой синеглазый сын?
            И что ты слышал, мой милый юноша?
            Я услышал звук грома, он прогремел предупреждение
            Услышал рев волны, способной затопить весь мир
            Слышал сотню барабанщиков, чьи руки пылали
            Слышал десять тысяч шепотов, и никто не слушал
            Слышал, как один человек голодал, я слышал, как многие люди смеялись
            Услышал песню поэта, погибшего в канаве
            Слышал звук клоуна, который плакал в переулке
            И это тяжело, и это тяжело, это тяжело, это тяжело
            И дождь сильный

            Ой, кого ты встретил, мой голубоглазый сын?
            Кого ты встретил, мой милый юноша?
            Я встретил маленького ребенка рядом с мертвым пони
            Я встретил белого человека, который гулял с черной собакой
            Я встретил молодую женщину, тело которой горело
            Я встретил молодую девушку, она подарила мне радугу
            Я встретил одного человека, который был ранен в любви
            Я встретил другого человека, которого ранила ненависть
            И это сложно, это сложно, это сложно, это сложно
            Будет сильный дождь

            О, что ты теперь будешь делать, мой голубоглазый сын?
            О, что ты теперь будешь делать, мой милый юноша?
            Я собираюсь вернуться, прежде чем начнется дождь
            Я пойду в глубины самого глубокого черного леса
            Где народу много и руки у всех пустые
            Где гранулы яда наводняют их воды
            Где дом в долине встречается с сырой грязной тюрьмой
            Где лицо палача всегда хорошо спрятано
            Где голод безобразен, где души забыты
            Где черный цвет, где нет число
            И я это скажу, и подумаю, и скажу, и вдохну
            И отразить это от горы, чтобы все души могли видеть это
            Тогда я буду стоять в океане, пока не начну тонуть
            Но я хорошо узнаю свою песню, прежде чем начну петь
            И это сложно, это сложно, это сложно, это сложно
            Скоро пойдет сильный дождь

            Copyright © 1963 Warner Bros. Inc.; renewed 1991 by Special Rider Music

            Where Did U Go 歌词 邓紫棋 ※ Mojim.com


            作词:G.E.M.邓紫棋
            作曲:Skot Suyama 陶山
            编曲:雷颂德
            监制:雷颂德

            曾看着同星空 闲聊吹风 看日出多心动
            曾每日缠一起 傻傻讲起 能爱到下世纪
            怎么你俘虏这个心 却抽身退隐 不再亲近
            独自苦等 仍然空等 难藏泪印

            看着 电话中短信
            听着 录音的口讯
            昨天的你哪天再接近

            Tell me where did you go? 心声都不可细诉
            Oh tell me baby where did you hide? 辛苦都未被谅解
            Where did you go? 数数多久不碰到
            我在每夜 彻夜狂想 Where did you go?

            而这夜月光中 再见影纵 再献花多感动
            而似蜜甜的心 明明开心 为何又骤降温
            怎么你一下子抱紧 却一下子转身 不再亲近
            独自苦等 仍然空等 难藏泪印

            看着 电话中短信
            听着 录音的口讯
            昨天的你哪天再接近
            更多更详尽歌词 在 ※ Mojim.com 魔镜歌词网

            Tell me where did you go? 心声都不可细诉
            Oh tell me baby where did you hide? 辛苦都未被谅解
            Where did you go? 数数多久不碰到
            我在每夜 彻夜狂想…

            Where did you go? Where did you go?
            怎会当这刻我需要你 你却没在我身边
            Where did you go? Where did you go?
            这秒钟很挂牵 你却不可感觉到
            Where did you go?

            Tell me where did you go? 心声都不可细诉
            Oh tell me baby where did you hide? 辛苦都未被谅解
            Where did you go? 数数多久不碰到
            我在每夜 彻夜狂想. ..

            Tell me where did you go? 心声都不可细诉
            Oh tell me baby where did you hide? 辛苦都未被谅解
            Where did you go? 数数多久不碰到
            我在每夜 彻夜狂想 Where did you go?

            [ti:Where Did U Go]
            [ar:邓紫棋]
            [by:劳维明]
            [00:05.07]邓紫棋
            [00:08.50]
            [00:10.71]Where Did U Go
            [00:14.23]
            [00:16.63]作曲:Skot Suyama 陶山
            [00:18.47]作词:G.E.M.
            [00:21.28]编曲:Mark Lui 雷颂德
            [00:22.63]监制:Mark Lui 雷颂德
            [00:25.42]
            [00:26.54]曾看着同星空 闲聊吹风 看日出多心动
            [00:32.11]曾每日缠一起 傻傻讲起 能爱到下世纪
            [00:37.82]怎么你俘虏这个心 却抽身退隐 不再亲近
            [00:43.85]独自苦等 仍然空等 难藏泪印
            [00:50.28]看着 电话中短信
            [00:53.31]听着 录音的口讯
            [00:56.19]昨天的你哪天再接近
            [01:01.41]Tell me where did you go? 心声都不可细诉
            [01:07.01]Oh tell me baby where did you hide? 辛苦都未被谅解
            [01:12.88]Where did you go? 数数多久不碰到
            [01:18.82]我在每夜 彻夜狂想 Where did you go?
            [01:30.98]而这夜月光中 再见影纵 再献花多感动
            [01:36.48]而似蜜甜的心 明明开心 为何又骤降温
            [01:42.22]怎么你一下子抱紧 却一下子转身 不再亲近
            [01:48. 23]独自苦等 仍然空等 难藏泪印
            [01:54.54]看着 电话中短信
            [01:57.28]听着 录音的口讯
            [02:00.33]昨天的你哪天再接近
            [02:05.76]Tell me where did you go? 心声都不可细诉
            [02:11.11]Oh tell me baby where did you hide? 辛苦都未被谅解
            [02:17.25]Where did you go? 数数多久不碰到
            [02:23.42]我在每夜 彻夜狂想…
            [02:28.67]Where did you go? Where did you go?
            [02:35.07]怎会当这刻我需要你 你却没在我身边
            [02:40.70]Where did you go? Where did you go?
            [02:46.86]这秒钟很挂牵 你却不可感觉到
            [02:52.61]Where did you go?
            [03:04.29]Tell me where did you go? 心声都不可细诉
            [03:09.63]Oh tell me baby where did you hide? 辛苦都未被谅解
            [03:16.23]Where did you go? 数数多久不碰到
            [03:21.95]我在每夜 彻夜狂想…
            [03:27.24]Tell me where did you go? 心声都不可细诉
            [03:33.41]Oh tell me baby where did you hide? 辛苦都未被谅解
            [03:39.33]Where did you go? 数数多久不碰到
            [03:45.41]我在每夜 彻夜狂想 Where did you go?

            1. 感谢 劳维明 提供动态歌词
            .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.