Администрация Кузнечихинского сельского поселения Ярославского района Ярославской области
Сведения о руководителях государственного органа
Глава Кузнечихинского сельского поселения ЯМР
ИНФОРМАЦИЯ
БИОГРАФИЯ
Белозеров Александр Викторович родился в городе Ангарске Иркутской области 21 марта 1970 г. Окончил в 1992 г. Киевское высшее танковое инженерное училище имени Маршала Советского Союза Якубовского И.И. по специальности «Бронетанковое вооружение и техника», а в 2007 г. – Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова по специальности «Юриспруденция».
С июня 1994 г. по декабрь 2009 г. Александр Викторович проходил службу в УВД по Ярославской области. В январе 2010 г. назначен директором государственного бюджетного учреждения Ярославской области «Содействие».
Александр Викторович с 13 января 2014 г. главой территориальной администрации Кировского района мэрии города Ярославля.
С ноября 2017 года А.В.Белозеров – исполняющий обязанности главы Кузнечихинского сельского поселения ЯМР.
ПРИСЯГА ПРИНЯТА, ТЕПЕРЬ — ЗА РАБОТУ
В Кузнечихинском Доме культуры состоялась инаугурация Главы Кузнечихинского сельского поселения А.В.Белозерова. Председатель территориальной избирательной комиссии Ярославского муниципального района Сергей Геннадьевич Лапотников сообщил, что Александр Викторович одержал убедительную победу на выборах 15 апреля и набрал более 81-гопроцента голосов, вручил удостоверение, пожелал успехов на непростом поприще руководителя поселения ив выполнении наказов, данных ему на выборах избирателями.
Принимая присягу главы поселение, А.В, Белозеров сказал: «Клянусь при осуществлении полномочий главы Кузнечихинского сельского поселения верно служить жителям, справедливо осуществлять доверенную мне власть, добросовестно выполнять свои обязанности, соблюдать и защищать Конституцию Российской Федерации и законы Ярославской области, Уставы Ярославского муниципального района и Кузнечихинского сельского поселения».
В своем поздравлении А.В. Белозерова глава Ярославского муниципального района Николай Владимирович Золотников напомнил, что у Кузнечихинского сельского поселения немало достижений, значительный потенциал и выразил надежду , что новый глава оправдает большой кредит доверия жителей и сумеет использовать возможности поселения на благо жителей.
Нового главу Кузнечихинского сельского поселения также поздравили: заместитель председателя Ярославской областной думы Павел Валентинович Исаев, настоятель храма Ильи Пророка дер. Кузнечиха иеромонах Антоний, член президиума областного совета ветеранов войны и труда и правоохранительных органов Александр Викторович Пирожков, глава Карабихского сельского поселения Андрей Валентинович Шатский от имени глав поселений Ярославского муниципального района.
В своем заключительном слове Александр Викторович Белозеров сказал, что присяга принята, напутствия получены, теперь – за работу!
ВСТРЕЧА-СОБРАНИЕ В КУЗНЕЧИХЕ ПО НОВЫМ ТАРИФАМ ЖКХ
20 февраля в Кузнечихинском Доме культуры состоялась встреча-собрание старост домов и активных жителей по вопросам оплаты жилищно-коммунального хозяйства и благоустройства.
Открывая собранием, исполняющий обязанности главы Кузнечихинского сельского поселения Александр Викторович Белозеров сказал:
— Для многих жителей квитанции по оплате жилищно-коммунальных услуг стали сюрпризом – тарифы заметно подросли. Поэтому недовольные жители обратились в администрацию поселения с просьбой разъяснить сложившуюся ситуацию. Идя навстречу им, мы пригласили к вам генерального Заволжской управляющей компании генерального директора управляющей компании Алексея Анатольевича Куликова, руководителя инженерной службы предприятия Галину Леонтьевну Сарычеву, которые занимаются обслуживанием жилого фонда Кузнечихи.
Руководитель управляющей компании А.А. Куликов сообщил, что появлению новых тарифов по ОДН и вывозке, транспортировке и захоронению бытовых отходов предшествовали документы правительства страны, области и местного муниципального совета.
В соответствии с ними были введены новые тарифы по ряду позиций – отоплению, холодной и горячей воде, водоотведению. Управляющая компания должна исполнять новые распоряжения.
Первый опыт показывает, что новые тарифы не учитывают местные условия и возможности самих кватиросъемщиков. По отдельным позициям действительно нужно производить перерасчет, но и здесь к вопросам нужно подходить внимательно. Может случиться так, что в некоторых домах замена оплаты по счетчикам может оказаться выше, чем по нормативам. Но надо считать и считать.
После этого собравшиеся стали задавать наболевшие вопросы. На часть этих вопросов ответила Галина Леонтьевна Сарычева.
Подводя итог собранию, исполняющий обязанности главы Кузнечихинского сельского поселения Александр Викторович Белозеров сказал, что старосты домов, жители отнеслись со всей серьезностью к проведению собрания жители и задавали острые вопросы, причем квалифицированные, со знанием дела, как говорится, с цифрами на руках, называя номера документов.
С такими активистами можно разговаривать и находить и находить общие точки соприкосновения. Ситуация с ростом тарифов такова, что нашей местной Кузнечихинской администрации, муниципальному совету этот вопрос нужно держать острый на контроле и вместе с управляющей компании искать варианты решения, учитывая местные условия.
ПОЗДРАВЛЕНИЕ ВЕТЕРАНА ГОРШИХИ В.А. АБРОСИМОВОЙ С ЮБИЛЕЕМ
26 января временно исполняющий обязанности главы Кузнечихинского сельского поселения Александр Викторович Белозеров поздравил с 90-летием ветерана орденоносного колхоза «Горшиха» Валентину Александровну Абросимову. Юбиляр была растрогана тем, что ей были вручены поздравления Президента Российской Федерации Владимира Владимировича Путина, а также губернатора Ярославской области и администрации Кузнечихинского муниципального района.
Поздравляя Абросимову, Александр Викторович вручил ей от имени администрации – поселения цветы и подарок.
Это очень приятная миссия поздравлять ветеранов с юбилеем, тем более, когда им уже 90 лет.
Абросимова у нас долгожительница. За её спиной много добрых дел. Она настоящая труженица. Ведь начала она работать с 12-13 лет – в годы войны.
В 1944 году она вышла замуж. После войны в основном работала в полеводстве, а 1972 года по 1982 телятницей. Хотя в 1983 году она ушла на пенсию по возрасту, все равно продолжала работать в полеводстве. Она показывала пример отношения к труду своим детям сыну и дочери.
Не обделена она и наградами, она удостоилась медали золотой медали ВДНХа СССР, дважды — серебряной и дважды бронзовой, медали «Ветеран труда», «50-лет Победы», ударник 10-й пятилетки.
Принимая поздравления, Валентина Александровна сказала А.В. Белозерову:
— Радует, что меня не забыли. Поздравление даже их Кремля. Такое не забывается. Спасибо, что пришли, сказали добрые слова. Жить хочется. Есть ради кого. Ведь я богатая – у меня трое внучат, четыре правнука и один праправнука. Дай Бог, им благополучной жизни и чтобы власть была хорошая справедливая, заботливая и внимательная.
Дата последнего изменения: 11-03-2021
| Студент | Позиция в рейтинге | Средний балл | Минимальный балл | Перцентиль | GPA |
| Джиоева Алина Ибрагимовна | 1 | 9.33 | 8 | 0% | 9.25 |
| Стенин Глеб Максимович | 2 | 9 | 7 | 0.87% | 9.17 |
| Белозеров Андрей Павлович | 3 | 8.33 | 7 | 1.74% | 8.79 |
| Кандауров Константин Алексеевич | 4 | 8.5 | 7 | 2.61% | 8.62 |
| Демина Ксения Вачагановна | 5 | 8.67 | 7 | 3.48% | 8.42 |
| Голубева Мария Дмитриевна | 6 — 7 | 8.17 | 6 | 4.35% | 8.25 |
| Шойхед Ирина Олеговна | 6 — 7 | 7. 67 | 5 | 4.35% | 7.33 |
| Комогорцев Андрей Иванович | 8 | 7.67 | 5 | 6.09% | 8.12 |
| Ижеев Сергей Дмитриевич | 9 | 8 | 7 | 6.96% | 8.08 |
| Алексеева Виктория Александровна | 10 — 12 | 8.33 | 7 | 7.83% | 8.00 |
| Кобалян Артём Артурович | 10 — 12 | 8.17 | 7 | 7.83% | 8.00 |
| Кузьминова Юлия Витальевна | 10 — 12 | 8 | 6 | 7.83% | 8.00 |
| Подкорытова Анастасия Геннадьевна | 13 | 9 | 7 | 10.43% | 9.00 |
| Гаджимирзаева Альбина Гаджимирзаевна | 14 | 7.5 | 6 | 11.3% | 7.50 |
| Лопатина Варвара Дмитриевна | 15 | 8.6 | 8 | 12.17% | 8.48 |
| Онуфрийчук Денис Дмитриевич | 16 | 8 | 6 | 13.04% | 7. 38 |
| Кривенко Алёна Станиславовна | 17 | 8.2 | 6 | 13.91% | 8.38 |
| Колотовкин Тимофей Николаевич | 18 — 19 | 6.86 | 4 | 14.78% | 6.03 |
| Семенченко Артем Игоревич | 18 — 19 | 7.67 | 7 | 14.78% | 7.29 |
| Носова Наталья Денисовна | 20 | 8.2 | 7 | 16.52% | 8.29 |
| Алексеенко Влада Владиславовна | 21 — 22 | 7.33 | 6 | 17.39% | 7.17 |
| Сбитнев Тимур Макарович | 21 — 22 | 8.2 | 7 | 17.39% | 8.19 |
| Ёлкин Григорий Валерьевич | 23 — 24 | 7.83 | 5 | 19.13% | 7.12 |
| Ястребилова Анастасия Сергеевна | 23 — 24 | 7.5 | 5 | 19.13% | 7.12 |
| Дунаевская Алиса Владимировна | 25 — 27 | 6.5 | 4 | 20.87% | 7.08 |
| Рековец Анастасия Андреевна | 25 — 27 | 8. 2 | 7 | 20.87% | 8.10 |
| Хасаншина Алсу Рамисовна | 25 — 27 | 8.2 | 7 | 20.87% | 8.10 |
| Новиков Никита Александрович | 28 | 7.33 | 6 | 23.48% | 7.04 |
| Иванова Марина Александровна | 29 | 7.67 | 4 | 24.35% | 7.00 |
| Полтева Екатерина Александровна | 30 | 8 | 5 | 25.22% | 7.95 |
| Стопочева Анна Антоновна | 31 | 7.17 | 6 | 26.09% | 6.92 |
| Соколова Анжелина | 32 | 7.17 | 6 | 26.96% | 6.83 |
| Марчукова Алина Владимировна | 33 | 8 | 7 | 27.83% | 7.76 |
| Тихонов Владислав Александрович | 34 | 7.8 | 7 | 28.7% | 7.71 |
| Тимофеев Дмитрий Игоревич | 35 | 7.17 | 6 | 29.57% | 6.67 |
| Яценко Анна | 36 | 7. 17 | 6 | 30.43% | 6.62 |
| Дорджиева Дарья Александровна | 37 — 38 | 7 | 6 | 31.3% | 6.58 |
| Сы Юйлинь | 37 — 38 | 6.67 | 4 | 31.3% | 6.58 |
| Жадько Кристина Вячеславовна | 39 | 7.33 | 5 | 33.04% | 6.54 |
| Дюмкеева Даяна Владимировна | 40 | 7.8 | 7 | 33.91% | 7.38 |
| Горбунова Марина Евгеньевна | 41 | 7.6 | 6 | 34.78% | 7.33 |
| Губанов Алексей Антонович | 42 — 43 | 6.83 | 5 | 35.65% | 6.29 |
| Костышина Екатерина Александровна | 42 — 43 | 7.17 | 4 | 35.65% | 6.29 |
| Тинятова Наталья Александровна | 44 | 7.17 | 4 | 37.39% | 6.25 |
| Скобелева Мария Максимовна | 45 | 7.17 | 4 | 38.26% | 6. 17 |
| Кравченко Станислав Алексеевич | 46 — 47 | 7.4 | 4 | 39.13% | 6.95 |
| Шипулин Александр Германович | 46 — 47 | 6.83 | 4 | 39.13% | 6.08 |
| Капустина Варвара Дмитриевна | 48 — 50 | 6.33 | 4 | 40.87% | 6.00 |
| Мосунов Данил Витальевич | 48 — 50 | 6.17 | 4 | 40.87% | 6.00 |
| Стрельникова Екатерина Владимировна | 48 — 50 | 7 | 5 | 40.87% | 6.86 |
| Старенькая Анастасия Васильевна | 51 | 6 | 4 | 43.48% | 5.92 |
| Анваров Тимур Анварович | 52 — 54 | 6 | 4 | 44.35% | 5.88 |
| Россол Архип Евгеньевич | 52 — 54 | 6.33 | 5 | 44.35% | 5.88 |
| Семин Глеб Александрович | 52 — 54 | 7 | 5 | 44.35% | 6.71 |
| Бегич Ксения Сергеевна | 55 — 59 | 7 | 4 | 46. 96% | 6.62 |
| Волобуев Артемий Дмитриевич | 55 — 59 | 6.33 | 4 | 46.96% | 5.79 |
| Габидова Ляйсан Кадимовна | 55 — 59 | 6.17 | 4 | 46.96% | 5.79 |
| Газина Мария Михайловна | 55 — 59 | 6.67 | 4 | 46.96% | 5.79 |
| Фомина Анастасия Алексеевна | 55 — 59 | 6.67 | 4 | 46.96% | 5.79 |
| Пахомова Диана Олеговна | 60 — 61 | 6.17 | 5 | 51.3% | 5.67 |
| Федорова Ольга Алексеевна | 60 — 61 | 5.83 | 4 | 51.3% | 5.67 |
| Верлатая Анастасия Сергеевна | 62 — 65 | 6.17 | 4 | 53.04% | 5.62 |
| Горобец Дарья Михайловна | 62 — 65 | 6.5 | 4 | 53.04% | 5.62 |
| Касумов Амир Алиевич | 62 — 65 | 6.17 | 5 | 53.04% | 5.62 |
| Такахо Ростислав Борисович | 62 — 65 | 6. 67 | 4 | 53.04% | 5.62 |
| Героев Дауд Ахмедович | 66 — 68 | 6.5 | 4 | 56.52% | 5.50 |
| Колосов Артур | 66 — 68 | 6.8 | 6 | 56.52% | 6.29 |
| Хайдарова Шахнозахон Шарифджоновна | 66 — 68 | 6 | 4 | 56.52% | 5.50 |
| Фаткулина Рушана Маратовна | 69 | 6.17 | 4 | 59.13% | 5.46 |
| Овсянникова Дарья Игоревна | 70 — 71 | 5.83 | 4 | 60% | 5.38 |
| Савульчик Степан Михайлович | 70 — 71 | 6.17 | 4 | 60% | 5.38 |
| Борисова Елизавета Юрьевна | 72 | 6.6 | 4 | 61.74% | 6.00 |
| Тарасова Екатерина Сергеевна | 73 | 6 | 4 | 62.61% | 5.21 |
| Вишневская Мелания Петровна | 74 — 76 | 6.17 | 4 | 63.48% | 5. 17 |
| Курашев Марат Хасанбиевич | 74 — 76 | 6 | 4 | 63.48% | 5.17 |
| Ноговицын Александр Михайлович | 74 — 76 | 5.67 | 4 | 63.48% | 5.17 |
| Реутова Вероника Артёмовна | 77 | 6 | 4 | 66.09% | 5.08 |
| Петросян Сергей Николаевич | 78 | 5.83 | 4 | 66.96% | 5.00 |
| Желев Владислав Евгеньевич | 79 | 6.4 | 4 | 67.83% | 5.67 |
| Манукян Саркис Арменович | 80 | 5.33 | 4 | 68.7% | 4.92 |
| Константинов Артём Олегович | 81 | 6.6 | 4 | 69.57% | 5.52 |
| Бокоева Адриана | 82 — 84 | 5.8 | 4 | 70.43% | 5.48 |
| Долаков Мурат Магомедович | 82 — 84 | 7 | 6 | 70.43% | 6.76 |
| Мухаметсабирова Аделина Рустамовна | 82 — 84 | 5. 5 | 4 | 70.43% | 4.79 |
| Декин Руслан Максимович | 85 | 6.4 | 4 | 73.04% | 5.29 |
| Шулепов Никита Алексеевич | 86 | 5.33 | 4 | 73.91% | 4.58 |
| Котельников Густав Максимович | 87 | 5 | 4 | 74.78% | 4.50 |
| Камиллетти Федерико | 88 | 5.4 | 4 | 75.65% | 4.46 |
| Чехоев Арсен Аланович | 89 | 5.8 | 4 | 76.52% | 5.05 |
| Ахматова Альбина Таалайбековна | 90 — 91 | 5.8 | 4 | 77.39% | 5.00 |
| Крылова Елизавета Павловна | 90 — 91 | 5.6 | 4 | 77.39% | 5.00 |
| Ванцян Георгий Вачаганович | 92 | 5.4 | 4 | 79.13% | 4.95 |
| Турчак Диана Николаевна | 93 | 7.2 | 5 | 80% | 4.29 |
| Кочергина Сабина | 94 | 5.6 | 4 | 80.87% | 4.81 |
| Жирнова Александра Александровна | 95 | 5.8 | 4 | 81.74% | 4.76 |
| Рязанова Ирина Сергеевна | 96 | 5.8 | 4 | 82.61% | 4.71 |
| Бахметьева Анна Олеговна | 97 | 5.2 | 4 | 83.48% | 4.67 |
| Каракашев Михаил | 98 — 99 | 5.8 | 4 | 84.35% | 3.79 |
| Сызранов Владимир Васильевич | 98 — 99 | 6.4 | 4 | 84.35% | 3.79 |
| Зверьков Михаил Ярославович | 100 | 6.2 | 4 | 86.09% | 3.58 |
| Червякова Василиса | 101 | 4 | 4 | 86.96% | 4.00 |
| Козлов Кирилл Эдуардович | 102 | 5.2 | 4 | 87.83% | 3.25 |
| Никифоров Степан Александрович | 103 | 5.4 | 4 | 88.7% | 3.12 |
| Мухаметшин Ильсаф Жалилович | 104 | 5.75 | 4 | 89.57% | 3.48 |
| Сухорукова Дарья Владимировна | 105 | 8.33 | 7 | 90.43% | 8.00 |
| Ли Синьхан | 106 | 5.25 | 4 | 91.3% | 2.46 |
| Ибраева Бермет Советбековна | 107 | 6 | 4 | 92.17% | 2.42 |
| Дорохов Дмитрий Сенорикович | 108 | 7.33 | 7 | 93.04% | 2.71 |
| Чен Артём Алексеевич | 109 | 3.5 | 1 | 93.91% | 2.29 |
| Абильмажинов Санжар | 110 | 4.25 | 4 | 94.78% | 2.52 |
| Михайлян Алина | 111 | 6 | 4 | 95.65% | 1.67 |
| Жумадил Данияр | 112 | 2.8 | 0 | 96.52% | 1.05 |
| Байчеркешев Дамир | 113 | 2 | 0 | 97.39% | 0.83 |
| Абрагимович Владимир Владимирович | 114 | 7 | 7 | 98.26% | 7.00 |
| Петрова Екатерина Владимировна | 115 | 0.2 | 0 | 99.13% | 0.14 |
Статистика
Условные обозначения:- И — количество сыгранных матчей,
- ИП — игры, проведенные полностью,
- БЗ — был заменен,
- ВЗ — вышел на замену,
- ВБЗ — вышел на замену и был заменен,
- Г — забитые голы (у вратарей пропущенные, в скобках — с пенальти),
- П — предупреждения,
- У — удаления.
Примечание. Мяч в свои ворота забил Владислав Никифоров («СКА-Хабаровск»).
«Нижний Новгород» в сезоне-2020/21.
| № | ФИО | И | ИП | БЗ | ВЗ | ВБЗ | Г | П | У |
| | | | | | | | | | |
| | вратари | | | | | | | | |
| 1 | Нигматуллин Артур | | | | | | | | |
| 31 | Абаев Илья | 11 | 11 | — | — | — | -25 (4) | — | — |
| 41 | Кержаков Михаил | 8 | 8 | — | — | — | -5 | 2 | — |
| | | | | | | | | | |
| | защитники | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | |
| 4 | Айдов Дмитрий | 15 | 15 | — | — | — | — | 3 | — |
| 6 | Полянин Дмитрий | 8 | 7 | 1 | — | — | — | 1 | — |
| 8 | Григалава Гия | 19 | 19 | — | — | — | 1 | 3 | — |
| 12 | Бондарв Дани | | | | | | | | |
| 15 | Тараканов Егор | | | | | | | | |
| 25 | Буйволов Андрей | 8 | 7 | — | 1 | — | — | — | 1 |
| 33 | Зайцев Николай | 10 | 6 | 2 | 2 | — | — | 4 | — |
| 63 | Белозеров Александр | 17 | 14 | — | 3 | — | 1 | 4 | — |
| | | | | | | | | | |
| | полузащитники | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | |
| 5 | Каряка Андрей | 16 | 2 | 11 | 3 | — | — | 4 | — |
| 7 | Рыжков Владислав | | | | | | | | |
| 9 | Шуленин Александр | 14 | 9 | 4 | 1 | — | 1 | 3 | — |
| 13 | Кудряшов Дмитрий | 8 | — | 3 | 5 | — | — | 1 | — |
| 17 | Дворнекович Матия | 3 | 1 | — | 2 | — | — | — | — |
| 21 | Аджинджал Руслан | 18 | 10 | 7 | 1 | — | — | 6 | — |
| 23 | Плешан Михаита | 6 | 3 | — | 3 | — | — | 2 | — |
| 24 | Паштов Руслан | | | | | | | | |
| 29 | Бибилов Шота | 19 | 6 | 5 | 8 | — | 1 | 1 | — |
| 83 | Харитонов Александр | 16 | 13 | — | 3 | — | 1 | 3 | — |
| 87 | Максимов Илья | 13 | 12 | 1 | — | — | 4 | 6 | 1 |
| | | | | | | | | | |
| | нападающие | | | | | | | | |
| 11 | Асильдаров Шамиль | 13 | 2 | 4 | 7 | — | 3 (1) | 3 | — |
| 14 | Саркисов Артур | 8 | 1 | 2 | 5 | — | — | — | — |
| 19 | Ахметович Мерсудин | 6 | — | 3 | 3 | — | — | — | — |
| 27 | Сапогов Алексей | 16 | 9 | 6 | 1 | — | 6 | 5 | 1 |
| 77 | Салугин Александр | 9 | 2 | 3 | 4 | — | 1 | 2 | — |
Условные обозначения. И — количество сыгранных матчей, ИП — игры, проведенные полностью, БЗ — был заменен, ВЗ — вышел на замену, ВБЗ — вышел на замену и был заменен, Г — забитые голы (у вратарей пропущенные, в скобках — с пенальти), П — предупреждения, У — удаления.
ДОЛЖНОСТЬ: | ФИО: | ТЕЛ: |
АДМИНИСТРАЦИЯ |
| 8 (473) |
Главный врач ВГКБСМП №1 | Банин Игорь Николаевич | 263-69-60 |
Зам. главного врача по медицинской части | Лютиков Юрий Владимирович | 263-06-65 |
Зам. главного врача по хирургии | Усов Юрий Викторович | 263-57-50 |
Зам. главного врача по ОМР | Натаров Алексей Алексеевич | 263-60-06 |
Зам. главного врача по клинико-экспертной работе | Жильцов Михаил Алексеевич | 263-88-10 |
Зам. главного врача по работе с сестринским персоналом | Козлова Нелли Васильевна | 263-87-46 |
Зам. главного врача по кадрам | Шмидт Любовь Аркадьевна | 263-56-50 |
Зам. главного врача по экономическим вопросам | Прокуророва Анна Николаевна | 263-66-55 |
Зам. главного врача по технике | Боева Зинаида Ивановна | 263-41-89 |
Зам. главного врача по моб. работе и ГО | Галушкин Алексей Валерьевич | 263-55-84 |
Главный бухгалтер | Попова Софья Евгеньевна | 263-50-00 |
|
|
|
НЕМЕДИЦИНСКИЕ ОТДЕЛЫ и СЛУЖБЫ |
| |
Начальник отдела автоматизации | Белозеров Александр Александрович | 263-77-39 |
Начальник отдела медицинской статистики |
| 263-87-58 |
Начальник договорного отдела | Зоценко Оксана Валерьевна | 225-95-03 |
Врач-эпидемиолог | Борисова Лариса Сергеевна | 270-64-89 |
Заведующая внутрибольничной аптекой | Черкасова Наталия Юрьевна | 263-77-08 |
Начальник службы питания | Никишина Любовь Аркадьевна | 263-70-84 |
Начальник отдела сторожевой охраны | Лихачёв Сергей Иванович | 263-92-60 |
Председатель Профкома | Сысоева Оксана Петровна | 263-70-51 |
МЕДИЦИНСКИЕ ОТДЕЛЫ |
|
|
Приёмное отделение (1 эт.) | Федосеев Александр Валентинович | 263-39-94 |
Травмпункт (1 эт.) | Ковалев Александр Алексеевич | 263-81-27 |
Гинекологический профиль: |
|
|
Гинекологическое отделение (5 эт.) | Денисова Наталья Валерьевна | 263-90-41 |
Хирургический профиль: |
|
|
Реанимационное отделение (2 эт.) | Незнамов Олег Дмитриевич | 263-46-73, 263-86-74 |
Анестезиологическое отделение (2 эт.) | Руденко Андрей Степанович | 263-39-98 |
Урологическое отделение (3 эт.) | Карташов Евгений Митрофанович | 263-38-71 |
Общехирургическое отделение №1 (6 эт.) | Стрыгин Олег Васильевич | 263-42-14 |
Общехирургическое отделение №2 (8 эт.) | Усов Юрий Викторович | 263-46-30 |
Травматологическое отделение (9 эт.) | Яшников Евгений Владимирович | 263-85-89 |
Нейрохирургическое отделение (10 эт.) | Степанов Евгений Викторович | 263-81-28 |
Терапевтический профиль: |
|
|
Первичное неврологическое отделение (2 эт.) | Сазонов Илья Эдуардович | 225-95-06 |
Кардиологическое отделение № 2 (3 эт.) | Алферова Елена Николаевна | 263-35-94 |
Кардиологическое отделение №1 (4 эт.) | Бунина Марина Николаевна | 263-70-45 |
Нейрососудистое отделение (7 эт.) | Белинская Вера Викторовна | 263-66-48 |
Пульмонологическое отделение (11 эт.) | Шегида Юлия Владимировна | 263-15-31 |
Общетерапевтическое отделение (12 эт.) | Кураносов Андрей Юрьевич | 263-85-62 |
| Лор — отделение | Харькова Наталья Алексеевна | 263-95-66, 263-40-57 |
Лабораторно-диагностический профиль: |
|
|
Клинико-диагностическая лаборатории | Филёв Игорь Федорович (вр. и.о зав. отд.) | 231-94-36 |
Эндоскопическое отделение (2 эт.) | Волкова Ирина Васильевна | 263-81-23 |
Отделение гравитационной хирургии крови (2 эт.) | Беседин Игорь Дмитриевич | 263-41-18 |
Отделение функциональной диагностики (2 эт.) | Мескова Светлана Игоревна | 263-88-72 |
Отделение лучевой диагностики (3 эт.) | Алимов Владимир Валентинович | 263-88-72 |
Физиотерапевтическое отделение (3 эт.) | Фоменкова Ирина Васильевна | 263-89-30 |
Патологоанатомическое отделение (морг) | Шипилов Николай Егорович | 263-61-51 |
ПЛАТНЫЕ УСЛУГИ |
|
|
Отделение платных услуг (1 эт.) | Лохмачев Павел Вячеславович | 263-72-20 |
Наркологическое отделение (1 эт.) | Трухан Евгений Эдуардович | 263-16-71 |
Администрация города Сочи — Чугунный срок. В Сочи возбуждено три уголовных дела за кражи люков
Эту тему сегодня обсуждали на совещании в администрации города. Были приглашены владельцы городских металлобаз. Сейчас в Сочи 21 фирма занимается приемом цветного и черного металлов. Больше всего их в Центре и Адлере. Сегодня по статистике в Сочи в день воруют от 30 до 50 люков. Не пугают охотников за металлом даже солидные штрафы: для физ. лиц 5 000 руб, должностных уже 10 000, а юридических до 40 000.
— Ведь очевидно, что воруют люки и кабели асоциальные элементы. Но ведь сдают они этот металл не в другом городе, а здесь в Сочи. И именно вы его и принимаете, то есть вы каждый раз становитесь соучастником. Хоть кто-то из вас хоть раз сообщил о фактах сдачи люка? Нет. Вот это тоже делает вас соучастниками. А за это грозит ответственность, вплоть до уголовной. И можете даже не сомневаться, что все подобные факты будут выявлены, — подчеркнул Александр Белозёров, начальник отдела участковых уполномоченных полиции и по делам несовершеннолетних УВД по г.Сочи.
Воруют металл в Сочи давно. Как было отмечено на совещании, это пережиток лихих 90-ых. Хищение металла — одна из примет того времени, однако и сегодня в Сочи крадут чермет везде — вырубают кабели в трансформаторных будках, снимают канализационные люки, ограды и решетки. С началом масштабного строительства ситуация усугубилась. В городе построены десятки километров дорог, которые оборудованы различными металлическими элементами. Естественно, вырос и соблазн.
— В городе десятки металлобаз, откуда в Сочи столько металла? Я вам скажу, это просто стало бизнесом уже, который очень сильно вредит городу. Мы не успеваем эти люки закупать, а это бюджетные деньги. За последние пару десятков дней украдено 800 штук! Ведь если бы не принимал их никто, никто бы их и не воровал, это было бы невыгодно, — заявил мэр Анатолий Пахомов.
За последнее время в Сочи возбуждено три уголовных дела по факту кражи люков. Один их охотников за металлом уже отбывает наказание, ему дали год тюрьмы.
Еще один вопрос, который поднимался на совещании, — битье стекол в новых «Ласточках». Электрички запустили в начале ноября. Всего за несколько дней зафиксировано уже три факта порчи имущества. Одного преступника задержали по «горячим» следам. Им оказался местный житель, который, находясь в состоянии сильного алкогольного опьянения, с моста закидал проезжающую «Ласточку» камнями. Мужчине выписали штраф за нарушение общественного порядка. А после того как будет подсчитан размер ущерба, примут решение о возбуждении уже уголовного дела.
Как было подчеркнуто на совещании, контроль и за люками, и за «Ласточками» будет усилен. Все электрички будут сопровождаться полицейскими, для этого на днях в Сочи приедут 196 сотрудников ОВД на транспорте. Помимо этого в олимпийскую столицу в ближайший месяц дополнительно прибудет несколько тысяч сотрудников правоохранительных органов из разных регионов России. На их плечи и ляжет контроль за соблюдением порядка в городе.
Формирование и мотивация команды
Зарождение стартапа начинается с команды. Универсального рецепта нет, поэтому мы собрали коллективный опыт команд, прошедших через это. Мы пообщались с резидентами и выпускниками Акселератора ФРИИ и услышали истории основателей — как они нашли друг друга, сформировали штат и продумали схемы мотивации.
Формула идеальной команды с точки зрения ФРИИ
1. Опыт лидера проекта
У руководителя проекта должен быть, как минимум, опыт работы в индустрии, в которой он делает бизнес — экспертиза, а также опыт ведения собственных проектов, руководства командой — лидерские навыки. В идеале — опыт руководства онлайн-проектом. ФРИИ инвестирует только в ИТ, поэтому нужен хотя бы один из участников с релевантным опытом в ИТ: разработке технологий, интернет-продвижении, онлайн-маркетинге.
2.Компетенции команды и баланс в распределении ролей
Идеальное распределение ролей — когда лидер проекта параллельно обладает какой-то второй компетенцией (маркетолог, сейлз, разработка, веб-продвижение). Второй человек дополняет его компетенцию. В идеале — должны быть закрыты техническая часть и маркетинговая. В совокупности у них должна быть синергия, это позволит им быстрее развивать свой проект и масштабироваться. От технической части в команде должен быть тим-лид, разработка же может оставаться на аутсорсе. Важно посмотреть, как долго команда (хотя бы ее костяк) работает вместе. Работоспособность и эффективность команды подтверждается временем. Помимо гармоничного распределения ролей в команде инвестору важно показать ключевые компетенции и достижения каждого из участников: команда должна быть способна создать и монетизировать продукт лучше, чем это делают конкуренты.
3. Вовлеченность
Это минимум два человека, которые занимаются проектом фултайм. Варианты с постоянной занятостью в другой компании и работой над проектом по вечерам не рассматриваются. Бывает, что в Акселератор проходят стартапы с одним человеком на фултайм, но это скорее исключение. Двум членам команды проще распределить задачи, поэтому вовлеченность определяет скорость
4. Мотивация
Для нас идеальный кейс — когда двум-трем участникам, костяку команды принадлежит если не 100%, то хотя бы 70-80%. Это гарантия того, что команда будет заниматься проектом долгосрочно. Как правило, руководитель владеет более 50%. Сомнителен кейс, когда 100% принадлежит руководителю, а команда при этом никаким образом не замотивирована. В этом случае мы спрашиваем, как основатель планирует в ближайшей перспективе мотивировать сотрудников: выделять опционы, перераспределять часть своей доли сотрудникам, делать их соучредителями. Бывают кейсы, когда внутри команды есть договоренность о распределении долей, которая не закреплена юридически. Это понятно членам команды, но для инвестора надежнее, когда у участников есть реальные доли. Опцион — довольно индивидуальная вещь. На самой ранней стадии, когда есть команда, базовый продукт и только начинаются продажи, идеально, если у всех ключевых членов команды есть доли. Если же уже есть объем продаж, проект какое-то время функционирует, есть трекшн — могут быть KPI и завязанные на них опционы. Обычно это все же KPI, который определяет основатель. Для продажника — KPI по продажам, для разработчика — KPI может быть по продукту: к какому моменту и что реализовано. Он тоже завязан на время, но есть и качественная характеристика».
Поиск и мотивация сооснователей и сотрудников: мнения предпринимателей
Антон Ершов, CEO и основатель Go2all
«В Go2all у меня нет сооснователей. Я пробовал найти партнеров: договаривались с сотрудниками, что при достижении результата они получают долю. Но они не выдерживали темпа, и этого не случилось ни разу. Сооснователей пробовал искать только через знакомых, по рекомендациям, а лучших сотрудников нашел на фриланс.ру. Выбирал только тех, у кого были положительные отзывы. Мне все равно, в каком городе находится человек: мою лучшую сотрудницу, которая занимается контентом сайта уже семь лет, я никогда не видел.
Мотивировать сотрудников пробовал по-разному. Сначала предлагал зарплату чуть выше рынка, на 15-20%, но в итоге сотрудники воспринимают это как само собой разумеющееся. Год экспериментировали со штрафами за каждую провинность — это демотивировало людей, часть из них бросали работу. Должна быть золотая середина. Фиксированную часть зарплаты стараюсь делать меньше, чем завязанную на результат. Те, кто выполняет KPI, зарабатывают больше рынка.
Все сотрудники работают на аутсорсе, по договору. Я не претендую на работу фултайм: на мой взгляд лучше купить несколько свободных часов в день у хорошего специалиста, чем посредственного — на полный рабочий день».
Иван Абрамовский, CEO и основатель LeaderTask
«Бизнес мы запускали втроем — я, мой родной брат и одногруппник. Оба разработчики, я отвечаю за управление командой и продажи. Когда мы перевели бизнес из ИП в ООО, я для простоты оформил его на себя, но у нас есть между собой договоренности о распределении долей. С этим нет проблем — и с братом, и с одногруппником у нас сложившиеся отношения.
В команде нас сейчас семь человек, кроме костяка команды двое в поддержке и двое в маркетинге. Сейчас начинаем формировать отдел продаж. Все ключевые сотрудники работают в штате на фултайм, на аутсорс мы отдаем дизайн, перевод, верстку — точечные задачи. Сотрудников мы искали на hh.
На старте все сотрудники получали фиксированную зарплату, позднее мы разработали систему поощрений. На основе статистики и обязанностей для каждого сотрудника мы рассчитали минимальный KPI на неделю и результат, при достижении которого к фиксированной ставке прибавляется процент. Плюс у нас есть сотрудник года, полугодия, квартала, для них расписаны премии.
На мой взгляд, важнее всего при выборе партнеров и сотрудников — порядочность. Все компетенции можно купить. В любом случае всех сотрудников придется учить, а честность и порядочность за деньги не купишь».
Алексей Чекарев, сооснователь и CEO «Нужен Ужин»
«Когда у меня родилась идея запуска собственного сервиса по доставке продуктовых наборов «Нужен Ужин», я всерьез занялся проектом и почти сразу привлек своего первого партнёра. Я отвечаю за производство и продукт: мне помогает образование — я учился на технолога пищевой промышленности. Также у меня есть опыт работы с крупными медийными лицами в качестве организатора концертов. У моего партнёра же было пять лет в event-сфере по организации выездных банкетов, а также опыт по взаимодействию с медийными лицами и каналами, такими как ТНТ. На этапе пилота без нормальной упаковки и четко сформированного ценностного предложения по продукту на такие каналы выходить было рано, поэтому компетенции моего компаньона в этой сфере не понадобились. Кроме того, параллельно он работал над своим проектом и не вовлекался в проект на 100%. Стартапу, на мой взгляд, на начальном этапе нужно уделять максимум времени и сил, поэтому мы не смогли продолжать работу.
В итоге сооснователем стала Мария Варламова — раньше я был ее партнером в агентстве по организации тимбилдингов, имел там небольшую долю. Поэтому именно её я и решил привлечь для развития «Нужен Ужин». У Маши был опыт построения прибыльного бизнеса и выстраивания процессов, но мы столкнулись с проблемой инвестиций. Мы искали людей с компетенциями в digital-проектах — рассказывали о проекте друзьям. Тем, кому идея была интересна, предлагали принять участие — вложить деньги и свой ресурс. Именно так мы привлекли в проект коммерческого директора Алексея Поликарпова с компетенциями в digital. Алексей инвестировал в проект, получив долю в компании. На мой взгляд, доля и вложенные средства лучше всего мотивируют человека вкладывать усилия в развитие бизнеса — нам хотелось привлечь равноправного партнера с полной вовлеченностью. Опцион — тоже неплохой вариант, в случае когда человек не вкладывает своих денег в проект.
Алексей Поликарпов отвечает за бизнес-часть, он наш коммерческий директор, я отвечаю за производство, Мария — за PR и маркетинг. Кроме того, у нас есть два наемных сотрудника на аутсорсе, но на фултайм: smm-менеджер и менеджер по работе с клиентами. Это позволяет сократить расходы на ранней стадии. Сотрудникам мы готовы будем предлагать опцион, если они кратно увеличат показатели. За превышение стандартных показателей сейчас мы платим процент. У каждого есть канал привлечения, за который он отвечает. Аккаунт-менеджеру, который занимается обзвоном, при увеличении конверсии во вторую покупку выше стандартных 50% мы доплачиваем за каждого дополнительного клиента. Также и с холодными звонками. Для smm-щика показатель — количество уникальных клиентов с первой точкой контакта в социальных сетях.
Сотрудников искали через знакомых, рекомендации, facebook, avito, fl.ru. Нашли через facebook. Мне нравится формат стажировок: чтобы сотрудник сначала себя проявил. Это снижает риски потратить время и ресурсы: мы в свое время сменили трех smm-щиков. При подборе сотрудников важно, чтобы они проникались идеей и обладали нужными компетенциями».
Алексей Ковалев, CEO и основатель Convead
«В Convead у меня не было полноценного сооснователя — бизнес с другом в свое время не получился, и я не рискнул искать партнера. Двух ключевых членов команды — технического директора и project-менеджера — я принимал на работу с мотивацией получить опцион. В итоге у них есть опционы в виде фантомных долей — мотивационная схема, когда ты получаешь процент при достижении определенного результата. Project-менеджера (она же продакт и арт-директор, отвечает за маркетинг и дизайн) я нашел на hh. Ее задача — анализировать конкурентов, продукт, метрики, проверять гипотезы через MVP новых функций в продукте. Если гипотезы подтверждаются, она их отдает в разработку. Ради работы у нас она переехала в Москву из Перми, а сейчас живет в Барселоне, но нам комфортно работать удаленно.
Наш технический директор не просто кодит, он вникает в процессы, в бизнес. Раньше у него была своя веб-студия, которую я нанимал на разработку как подрядчика. В итоге, вся студия, вся сработавшаяся команда, стала частью Convead. Сейчас у нас работает около 12 человек, искал их в основном через hh. У меня есть функциональная карта с целями, задачами, компетенциями, требованиями и KPI для каждого сотрудника. Если каких-то компетенций не хватает, сотрудник обязан их получить — научиться внутри команды или пойти на курсы. Мотивация — это фиксированный оклад плюс часть, привязанная к KPI. Кроме того, мотивация в нашей команде двухуровневая: первый уровень — метрика, на которую влияет сотрудник, второй уровень — достижение всей компанией плана.При выборе партнера важнее всего его компетенции и энергия, интерес к проекту. Для сотрудников — примерно также. Сейчас партнер мне не нужен — вывести бизнес на самоокупаемость получилось и без него. Он важнее на самой ранней стадии, чтобы запустить проект. Возможно, он понадобится мне при активном развитии на западном рынке, где у меня нет компетенций».
Георгий Гаспарян, CEO и основатель SyncCloud
«Партнеров в SyncCloud я не искал. Это мой третий бизнес, первые два запускали с друзьями или родственниками, но ничем хорошим это не закончилось. Как ни договаривайся с ними «на берегу» — все равно возникает недопонимание. Ожидания у близких людей всегда отличаются, там другая плоскость, где всегда возникает ситуация «но мы же друзья?!». Для них придется делать исключения, в бизнесе это мешает.
Сейчас у меня 14 человек в команде, у ключевых есть опционы, завязанные на KPI и время работы в компании более четырёх лет. Начинали они также с уровня сотрудников, в общей сложности им принадлежит 16% компании. Первыми были два разработчика, третьим стал продакт-менеджер, ответственный за проектирование. Я отвечаю за управление командой и продажи. У рядовых сотрудников — разработчиков и маркетологов — фиксированный оклад. Все сотрудники работают в штате компании фултайм — без вовлеченности в проект качество сильно страдает, особенно в случае с высокотехнологичным продуктом. На hh я никого не искал — специфика бизнеса такова, что сотрудники притягиваются сами. При подборе смотрел, прежде всего, на компетенции».
Александр Белозеров, CEO и сооснователь «КОТ»
«Партнер по проекту — наш инвестор, выпускник «Школы инвестиций» ФРИИ. Мы познакомились по рекомендации, привлекали его именно как инвестора, в команде он скорее выполняет роль трекера. У него достаточно серьезные компетенции в бизнесе, мы еще до ФРИИ еженедельно встречались, обсуждали текущие бизнес-показатели и ставили задачи. Так что к трекшн-митингам Акселератора мы уже были морально готовы. Есть еще соучредитель, с которым мы изначально стартовали проект.
До запуска этого проекта у меня была студия разработки ПО, оттуда я забрал технический костяк команды из двух человек. Плюс в команде есть человек, который занимается продажами.
Мотивация ключевых членов команды выстроена как фиксированный оклад плюс опцион, завязанный на KPI. Для рядовых менеджеров по продажам — это прогрессивная шкала, в зависимости от сделок, и в перевыполнения нормы предоставляем процент от суммы сделки. Большая часть сотрудников в штате, только несколько технических — на аутсорсе. Ищем сотрудников через fl.ru, facebook и рекомендации.
Основной критерий выбора партнера — компетенции в нужной сфере, а также «зараженность» продуктом».
Подытожим
Сооснователи бывают разные.
Выборка небольшая, поэтому это далеко не исчерпывающий список:
1. Партнеры, близкие к равноправным.
Равноправные партнеры чаще всего вместе запускают проект. В этом случае у каждого из партнеров значимая доля в проекте. Либо возможен вариант, когда партнера привлекают под какую-то компетенцию. Вовлеченность в этом случае, скорее всего, полная, плюс партнер со значимой долей обычно вкладывается деньгами.
2. Основатель + инвестор, выступающий трекером
Партнер-инвестор, обычно — бизнес-ангел из отрасли, которого привлекают уже в проект с первыми результатами. Вовлеченность — неполная, выступает в роли ментора или трекера, делится опытом и связями.
3. Сооснователи, выросшие из сотрудников.
Ключевые сотрудники, которые доросли до опционов, выполнив определенные KPI. Деньгами не вкладываются, по формату работы все же остаются подчиненными лидера проекта, а не партнерами.
Критерии подбора сооснователей и/или сотрудников
-
«Зараженность» идеей проекта
-
Компетенции под роль сотрудника в команде (либо способность учиться им)
-
Порядочность — из предыдущего опыта работы или рекомендаций
Способы мотивации
-
Доля в компании — для ключевых членов команды
-
Опцион, завязанный на KPI сотрудника и/или время работы в компании — для ключевых членов команды и дорогих специалистов
-
В зависимости от роли сотрудника — фиксированная часть оклада + процент, завязанный на KPI
-
«Второй уровень» мотивации — бонусы для всей команды при достижении общего плана
-
Премии формата «сотрудник года»
Каналы поиска сооснователей и/или сотрудников
Рекомендации знакомых, facebook, hh, fl.ru, avito.ru
Способы оформления сотрудников
-
Большая часть команды на аутсорсе, парт-тайм — в случае, когда хочется привлечь дорогих специалистов.
-
Большая часть команды на аутсорсе, фултайм — если необходима вовлеченность сотрудника, но приходится экономить.
-
Большая часть команды в штате на фултайм — а на аутсорсе только некоторые, второстепенные функции вроде дизайна и части разработки. Если команда уже достаточно зарабатывает.
«Волга» сотворила первую сенсацию чемпионата России :: Футбол :: РБК Спорт
Нижегородская «Волга» уже в третьем матче стартового тура сотворила первую сенсацию чемпионата России, обыграв в меньшинстве на своем поле московское «Динамо».
Читайте нас в
Новости НовостиФото: ФК Динамо
ОБЗОР МАТЧАНижегородская «Волга» уже в третьем матче стартового тура сотворила первую сенсацию чемпионата России, обыграв в меньшинстве на своем поле московское «Динамо».
Суммарная статистика по итогам первого тайма, мягко говоря, удивила: на двоих команды нанесли одиннадцать ударов по воротам! Цифры – одно, но вспомнить что-либо крайне интересное в первые сорок пять минут было невозможно. Позиционная борьба, обилие столкновений, попытки дальних ударов. Из сюрпризов можно было выделить наличие в нападении «Волги» Алексея Сапогова. Лидер почившего в бозе «Нижнего Новгорода» Дмитрий Кудряшов наряду с другими своими бывшими одноклубниками остался в резерве. В «Динамо» не оказалось в заявке хорватского новичка Гордона Шильденфельда. Андрей Воронин также не нашёл себя в списке игроков на матч, зато Игорь Семшов из числа мятежников вышел в ранге «титуларов». Атака «бело-голубых» представляла собой дуэт Кевин Кураньи – Александр Кокорин, отмечает Еврофутбол.
Громкие по именам динамовские футболисты действовали слишком академично, чтобы можно было надеяться на резкие атаки и запоминающиеся удары. Один раз Кокорин попробовал с острого угла, практически от самой лицевой линии поля, головой закрутить мяч в дальний угол. Илье Абаеву в основном приходилось отражать дальние удары и наблюдать за тем, как его полузащитники блокируют попытки соперников. По-настоящему кипер волжан засветился в начале второго тайма. Защитники «Волги» прозевали у своих ворот Кевина Кураньи, нанесшего удар в касание с нескольких метров. Абаев быстро сориентировался и ногами отправил мяч подальше от ворот.
Динамовский навал подбирался к штрафной хозяев поля всё сильнее и сильнее, покуда не получил весомую подпитку со стороны футболистов «Волги». Илья Максимов в центре поля прямой ногой пошёл на Кристиана Нобоа. Судья принял жёсткое, но справедливое решение удалить с поля атакующего игрока хозяев. В численном меньшинстве Гаджи Гаджиев поспешил снять с игры Андрея Каряку, имевшего, пожалуй, самый убедительный момент для открытия счёта на табло. Андрей бил с десяти метров без сопротивления по центру ворот, но на его беду мяч прошёл левее штанги.
Без Максимова больший оперативный простор получил Кевин Кураньи. В его направлении следовали почти все разрезающие передачи. В одном случае немецкий бомбардир опоздал с выходом в атаку, и защитники успели накрыть удар новоявленного капитана «бело-голубых». Кураньи, чувствуя за собой вину, пытался заработать пенальти, но Сергей Лапочкин грамотно рассудил эпизод. В следующем эпизоде мяч оказался на перекладине Абаева…
Разбазарив кучу моментов, динамовцы поплатились за свою ошибку. Дмитрий Айдов ввёл мяч в игру из аута с левого края поля, Алексей Сапогов красиво ушёл от двух человек на финте, от лицевой навесил на дальнюю штангу, откуда Александр Шуленин переиграл со «второго этажа» Александра Кокорина. Шунин ничего не мог поделать с подобной комбинацией. Динамовцам ничего не оставалось, кроме как идти вперёд и рисковать. Волжане получили шанс с выходом двое на одного, но Шуленин откровенно пожадничал и не отпасовал на свободного Дворнековича. Шуленин вместе с другими товарищами по команде мог поплатиться за свои эмоции, если бы Абаев проиграл ближний бой Кураньи. У Кевина было три стопроцентных момента, и во всех ситуациях Илья Абаев оказывался на высоте. Сказав «спасибо» своему голкиперу, «Волга» записала себе в актив первые три балла.
Чемпионат России. Премьер-Лига. 1-й тур
«Волга» (Нижний Новгород) — «Динамо» (Москва) — 1:0 (0:0)
Гол: Александр Шуленин, 69
Предупреждения: Александр Белозеров, 9
Удаление: Илья Максимов, 51
21 июля, 16:30. Нижний Новгород. Стадион «Локомотив»
«Волга»: Илья Абаев, Дмитрий Айдов, Александр Белозеров, Гиа Григалава, Андрей Буйволов, Илья Максимов, Андрей Каряка (Александр Шуленин, 56), Руслан Аджинджал, Александр Харитонов, Шота Бибилов (Матия Дворнекович, 74), Алексей Сапогов (Мерсудин Ахметович, 78)
«Динамо»: Антон Шунин, Владимир Рыков, Люк Уилкшир, Леандро Фернандес (Андрей Панюков, 77), Владимир Гранат, Балаж Джуджак, Игорь Семшов, Кристиан Нобоа (Александр Сапета, 86), Звездан Мисимович, Александр Кокорин, Кевин Кураньи
Судья: Сергей Лапочкин (Санкт-Петербург)
«Исследование фазово-структурных инженерных возможностей покрытий на сплаве Д16 при микродуговом окислении в электролитах разных типов» Валерия Субботина, Олег Соболь, Валерий Белозеров, Александр Субботин, Юлия Смирнова :: ССРН
Восточно-Европейский журнал корпоративных технологий, 4 (12 (106)), 14-23. DOI: 10.15587 / 1729-4061.2020.209722
10 стр. Размещено: 11 янв 2021 года
См. Все статьи Валерии СубботинойНациональный технический университет «Харьковский политехнический институт»
Национальный технический университет «Харьковский политехнический институт»
Национальный технический университет «Харьковский политехнический институт»
Национальный технический университет «Харьковский политехнический институт»
O.Харьковский национальный университет городского хозяйства им. М. Бекетова
Дата написания: 31 августа 2020 г.
Абстрактные
Изучено влияние условий электролиза с различным составом электролита на кинетику роста, фазово-структурное состояние и твердость покрытий, полученных микродуговым окислением (МДО) на алюминиевом сплаве Д16 (основа — алюминий, основная примесь Cu).
Анализ полученных результатов показал, что выбор типа электролита и условий проведения МДО-процесса позволяет в широких пределах изменять кинетику роста и фазово-структурное состояние покрытия на алюминиевом сплаве Д16.Для всех типов электролитов с увеличением содержания KOH, Na2SiO3 или KOH + Na2SiO3 скорость роста МДО-покрытий увеличивается.
Установлено, что в МДО-покрытиях, полученных в щелочном (КОН) электролите, формируется двухфазное (фазы γ − Al2O3 и α − Al2O3) кристаллическое состояние. Увеличение концентрации КОН приводит к увеличению относительного содержания фазы α – Al2O3 (корунда). При образовании в силикатном электролите фазовый состав МДО-покрытий с увеличением содержания жидкого стекла (Na2SiO3) изменяется от смеси фазы γ − Al2O3 и муллита (3Al2O3 ∙ 2SіO2) до рентгеноаморфной фазы. .Использование сложного электролита приводит к двухфазному состоянию покрытия с большим (по сравнению со щелочным электролитом) сдвигом превращения γ − Al2O3 → α − Al2O3 в сторону образования фазы α − Al2O3. Было определено, что величина твердости коррелирует с содержанием фазы α-Al2O3 в МДО-покрытии, достигая максимального значения 1620 кг / мм2 при самом высоком содержании (около 80 об.%) Фазы α-Al2O3.
Выявлены два типа зависимости толщины покрытия от количества пропущенного электричества.Для количества пропущенного электричества 10–50 А · ч / дм2 зависимость толщины определяется как 4,2 мкм / (А · ч / дм2), что предполагает основной механизм электрохимического окисления при формировании покрытия. Для количества переданной электроэнергии 50–120 А-час / дм2 зависимость толщины определяется гораздо меньшим значением 1,1 мкм / (А-час / дм2). Это предполагает переход к другому механизму формирования покрытия — формированию покрытия с участием компонентов электролиза.
Ключевые слова: Исследование возможностей фазово-структурной инженерии покрытий на сплаве Д16 при микродуговом окислении в электролитах разных типов
Рекомендуемое цитирование: Предлагаемое цитирование
Субботина, Валерия и Соболь, Олег и Белозеров, Валерий и Субботин, Александр и Смырнова, Юлия, Исследование возможностей фазово-структурной инженерии покрытий на сплаве Д16 при микродуговом окислении в электролитах разных типов (31 августа 2020 г.) ).Восточно-Европейский журнал корпоративных технологий, 4 (12 (106)), 14-23. doi: 10.15587 / 1729-4061.2020.209722, Доступно в SSRN: https://ssrn.com/abstract=3725093COMDI 2018 — Стендовые доклады
Вторник, 11 сентября 2018 г. — 17: 10-19: 10
4-6 Перенос тепла Ab-initio в упорядоченных / неупорядоченных системах; Микеле Симончелли, Франческо Маури и Никола Марцари; представлен Микеле Симончелли (EPFL).
5-1 Классификация составных узлов Вейля типа I и типа II; Даниэль Госальбез-Мартинес, О.В. Язьев; представленный Даниэлем Госалбесом Мартинесом (EPFL).
5-2 Большой аномальный эффект Нернста в узкозонном изоляторе Черна; Йо Пьер Мизута, Хикару Савахата и Фумиюки Исии; представлен Фумиюки Исии (Университет Канадзавы).
5-3 Термоэлектричество, управляемое топологией, и неабелева статистика в импульсном пространстве; Алексей А. Солуянов; представил Алексей Солуянов (ETH Zurich).
5-4 Новые топологические полуметаллы, предсказанные на основе расчетов из первых принципов; QuanSheng Wu, Xing Feng, Changming Yue, Christophe Piveteau, Zhida Song, Bin Wen, Matthias Troyer, Олег В.Язьев; представленный QuanSheng Wu (EPFL).
5-5 Магнитосопротивление от топологии поверхности Ферми; Шэннань Чжан, ЦюаньШэн У, Лиу И и Олег В. Языев; представила Шэннан Чжан (EPFL).
6-1 SIRIUS: квантовая библиотека для расчетов электронной структуры; Антон Кожевников, Матьё Тайллефюмье, Марко Борелли, Никола Марцари, Томас Шультесс; представлен Марко Борелли (EPFL).
6-2 Окно потенциалов стабильной стехиометрии твердотельных электролитов; Тобиас Биннингер, Арис Марколонго, Валерий Вебер, Теодоро Лаино; представлен Тобиасом Биннингером (IBM Research — Цюрих).
6-3 Экосистема на основе Jupyter и AiiDA для высокопроизводительной характеристики графеновых нанолент и молекул на поверхностях; Кристьян Эймре, Оле Шютт, Эдвард Дитлер, Александр Якутович, Леопольд Талирц, Джованни Пицци, Даниэле Пассероне, Карло Пинедоли; представил Кристьян Эймре (Empa).
6-4 Поиск структуры и анализ свойств границ раздела между катодом LiCoO2 и сульфидным электролитом в твердотельной батарее методом DFT-CALYPSO; Бо Гао, Рэнди Джалем, Янмин Ма, Ёситака Татеяма; представлен Бо Гао (Национальный институт материаловедения, Япония).
6-5 Высокопроизводительный экранирование трехмерных спиновых бесщелевых полупроводников в соединениях Гейслера; Цян Гао, Инго Опахле и Хунбинь Чжан; представил Цян Гао (Технический университет Дармштадт).
6-6 Новые литий-ионные проводники из высокопроизводительного экрана; Леонид Кале, Арис Марколонго, Джулиана Матерзанини, Теодоро Лаино, Никола Марцари; представил Леонид Кале (EPFL).
6-7 Высокопроизводительный скрининг новых 2D вспомогательных материалов для катализа; Кун-Хан Лин, Николя Мунэ, Никола Марзари и Клеманс Корминбёф; представлен Кун-Ханом Линем (EPFL).
6-8 Разработка и усовершенствование твердотельных ионных проводников для приложений уровня аккумуляторных устройств; Арис Марколонго, Леонид Кале, Элиза Джиларди, Матье Мотте, Тобиас Биннингер, Джулиана Матерзанини, Федерико Циполи, Клэр Виллевьей, Даниэле Перголези, Никола Марцари, Теодоро Лайно; представлен Арисом Марколонго (IBM Research Zurich).
6-9 Определение степени окисления бинарных оксидов с помощью зарядов Бадера с использованием методов анализа больших данных; Сергей Посисаев, Ольга Мирошниченко, Дуй Ле, Матти Алатало и Талат С.Рахман; представил Сергей Посисаев (Университет Оулу).
6-10 Фотореалистичное моделирование сплавов благородных металлов; Джанлука Прандини, Фанни Лалире, Паоло Умари, Джан-Марко Риньянезе и Никола Марцари; представлен Джанлукой Прандини (EPFL).
6-11 Materials Cloud, открытый портал для вычислительного материаловедения; Леопольд Талирц, Снехал Кумбхар, Фернандо Гарджуло, Марко Борелли, Александр Якутович, Эльза Пассаро, Оле Шютт, Йост Ванде Вонделе, Томас Шультесс, Джованни Пицци, Никола Марцари; представлен Леопольдом Талирцем (EPFL).
6-12 Код расчета фононов и база данных расчета фононов; Ацуши Того, Ацуто Секо и Исао Танака; представлен Ацуши Того (ESISM, Киотский университет).
6-13 Раздел «Работа в облаке материалов»: Jupyter и Quantum Mobile для высокопроизводительных вычислений; Александр Якутович, Леопольд Талирц, Оле Шютт, Йенс Бродер, Владимир Дикан, Майкл Атамбо, Антимо Марраццо, Йост ВандеВонделе, Томас Шультесс, Беренд Смит, Джованни Пицци, Никола Марцари; представил Александр Якутович (ЕПФЛ).
6-14 Высокопроизводительный скрининг соединений Гейслера для магнитокалорических применений; Нуно Фортунато, Цян Гао, Тинтин Линь, Инго Опахле, Оливер Гутфляйш и Хунбинь Чжан; представил Хунбинь Чжан (Технический университет Дармштадт).
6-15 Платформа AiiDA с высокой пропускной способностью: последние разработки; С. Зупанос, М. Урин, С. П. Хубер, Р. А. Хойзельманн, Л. Кале, Н. Мунэ, Д. Греш, С. Кумбхар, Л. Талирз, Ж. Булье, А. Чепеллотти, Ф. Гарджуло, А. Меркис, Б. Козинский, Н. Марзари, Г. Пицци; представлен Спиросом Зупаносом (EPFL).
7-1 Хранение природного газа в 3D Углеродистые пористые материалы; Дайан Дамаскено Борхес, Эфрем Браун, Сейед Мохамад Мусави, Дуглас Гальвао, Беренд Смит; представлен Дайан Дамаскено Борхес (EPFL).
7-2 Ab initio гибкие силовые поля для металлоорганических каркасов с использованием несвязанных фиктивных моделей для описания координационных связей; Суди Джавахери, Накул Рампал, Сейед Мохамад Мусави, Мэтью Уитман, Беренд Смит; представлен Суди Джавахери (EPFL).
7-3 Повышение механической устойчивости металлоорганических каркасов за счет вторичных сетей; Сейед Мохамад Мусави, Питер Г.Бойд, Лев Саркисов и Беренд Смит; представлен Сейедом Мохамадом Мусави (EPFL).
7-4 Оценка методов уравновешивания заряда для создания электростатических полей в нанопористых материалах; Даниэле Онгари, Питер Дж. Бойд, Эмбер К. Мейс, Беренд Смит; представлен Даниэле Онгари (EPFL).
7-5 Новый метод разделения смеси Ch3 / h3 с использованием мембран на основе композитных материалов со смешанной матрицей и полимером MOF; Айдын Озджан, Озгур Язайдин, Росио Семино и Гийом Маурин; представлен Айдыном Озджаном (Университетский колледж Лондона).
7-6 Исследование свойств возбужденного состояния металлоорганических каркасов для зондирования и фотокатализа; О.А. Сызганцева; представила Ольга Сызганцева (ЕПФЛ).
Двумерные материалы
8-1 Стабильность при размещении однослойного марганца и золота, вставленного между двухмерной двухслойной системой; Ухён Бэк, Артем В. Куклин и Павел В. Аврамов; представил Ухён Бэк (Национальный университет Кёнпук).
8-2 Рост 2D листа бора на поверхности Si; Деб Санкар Де, Максимилиан Амслер, Хосе А.Флорес-Ливас и Стефан Годекер; представлен Деб Санкар Де (Базельский университет).
8-3 2D безметалловые органические каркасы на основе тетраокса [8] циркуленов: стабильность и электронные свойства; Артем В. Куклин, Павел В. Аврамов и Глеб В. Барышников; представил Артем Куклин (Национальный университет Кёнпук).
8-4 Усовершенствованные логические переключатели на основе новых двумерных материалов; Седрик Клинкерт, Арон Сабо, Кристиан Стигер, Давид Кампи, Никола Марцари и Матье Луизье; представленный Матье Луизье (ETH Zurich).
8-5 Кластеры оксида вольфрама в растворе, стабилизированном наношумом нитрида бора; Маттиас Мюлльнер, Тициана Муссо, Адриан Хемми, Ян Балайка, Майкл Шмид, Ульрике Дибольд, Марселла Яннуцци, Стейн Ф. Л. Мертенс; представила Тициана Муссо (Цюрихский университет).
8-6 Собственные и инженерные точечные дефекты в двумерном 1T’-MoS2; Микеле Пиццочеро и Олег В. Язьев; представлен Микеле Пиццочеро (EPFL).
8-7 Решение из первых принципов для ограничения транспорта фононов в закрытых 2D-материалах с использованием 2D-DFPT и AiiDA; Тибо Сойер, Давид Кампи, Марко Гибертини и Никола Марцари; представлен Тибо Сойером (EPFL).
8-8 О структуре и динамике воды, заключенной между двухмерными материалами; Габриэле Точчи, Марселла Яннуцци, Лоран Жоли, Юрг Хаттер; представила Габриэле Точчи (Цюрихский университет).
9-1 Одноразовый расчет многокомпонентных фазовых диаграмм; R.J.N. Болдок, Н. Марзари; представлен Робертом Болдоком (EPFL).
9-2 Структура и проводимость литиевой суперионики Li10GeP2O / S12: основные принципы молекулярной динамики и экспериментальные характеристики; Джулиана Матерзанини, Леонид Кале, Арис Марколонго, Элиза Джиларди, Даниэле Перголези и Никола Марцари; представлен Джулианой Матерзанини (EPFL).
9-3 Молекулярно-динамическое моделирование кристаллизации жидкого кремнезема; Хайян Ню, Микеле Парринелло; представлен Хайян Ню (ETH Zurich / USI).
10-1 Обобщенная конструкция выпуклой оболочки для обнаружения вычислительных материалов; Андреа Анелли, Эдгар А. Энгель, Крис Дж. Пикард, Мишель Чериотти; представила Андреа Анелли (EPFL).
10-2 Представление на основе алхимического и структурного распределения для улучшенного QML; Ф. А. Фабер, А. С. Кристенсен, Б. Хуанг, О.А. фон Лилиенфельд; представлен Феликсом Фабером (Базельский университет).
10-3 Машинное обучение с учетом симметрии плотности электронов в основном состоянии; А. Грисафи, А. Фабрицио, Б. Мейер, Д.М. Уилкинс, К. Корминбёф, М. Чериотти; представлен Альберто Фабрицио (EPFL).
10-4 На пути к эффективному, точному, масштабируемому и переносимому квантовому машинному обучению с AM-ons: «ДНК» химии; Бинг Хуанг, Анатоль фон Лилиенфельд; представлен Бинг Хуанг (Базельский университет).
10-5 Эффективное машинное обучение энергий с использованием SOAP и функций симметрии; ГРАММ.Имбальзано, Б. Ранкович, А. Анелли, М. Ланговой, М. Ягги, М. Чериотти; представлен Джулио Имбальцано (EPFL).
10-6 На пути к эффективному поиску новых быстрых ионных проводников путем объединения методов DFT и подходов информатики; Рэнди Джалем, Кента Канамори, Юсуке Нода, Там Ле, Ичиро Такеучи, Ёситака Татеяма и Масанобу Накаяма; представлен Рэнди Джалем (Национальный институт материаловедения, Япония).
10-7 Межатомный потенциал машинного обучения для никелевых сплавов; Наталия Лопаницына, Эдоардо Балди, Микеле Чериотти; представила Наталия Лопаницына (ЕПФЛ).
10-8 Выявление химических закономерностей путем комбинирования карты-схемы с индикатором области перекрытия плотности; Бенджамин Мейер, Лоран Ванне, Риккардо Петралья, Мишель Чериотти и Клеманс Корминбёф; представлен Бенджамином Мейером (EPFL).
10-9 Машинное обучение для ландшафта структура-энергия-свойства молекулярных кристаллов; Феликс Мусил, Сандип Де, Джек Янг, Джошуа Э. Кэмпбелл, Грэм М. Дэй, Мишель Чериотти; представил Феликс Мусил (EPFL).
10-10 Модели машинного обучения для гомогенного катализа; Будсарин Саватлон, Бенджамин Мейер, Стефан Хайнен, Анатоль фон Лилиенфельд, Клеманс Корминбёф; представлен Boodsarin Sawatlon (EPFL).
Протеомика взаимодействия in vivo обнаруживает новый путь p38, активируемый митогеном протеинкиназой / Rack1, регулирующий протеостаз в мышцах дрозофилы
Abstract
Несколько недавних исследований показывают, что системное старение у многоклеточных животных по-разному зависит от функционального снижения в определенных тканях, таких как скелет. мышца. У Drosophila продолжительность жизни, по-видимому, тесно связана с миопротеостазом, а образование неправильно свернутых агрегатов белка является признаком старения стареющих мышц.Точно так же дефектный миопротеостаз описывается как важный фактор в патологии нескольких возрастных дегенеративных мышечных заболеваний у людей, например миозита с тельцами включения. p38 митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK) играет центральную роль в консервативном сигнальном пути, активируемом множеством стрессовых стимулов. У стареющих мух с мутантом p38 MAPK наблюдается ускоренное снижение двигательной функции, сопровождающееся повышенным накоплением агрегатов нерастворимого в детергенте белка в грудных мышцах.Химико-генетические эксперименты предполагают, что p38-опосредованная регуляция миопротеостаза не ограничивается контролем продукции активных форм кислорода или путями деградации белка, но также включает вышестоящие пути обмена, например, трансляцию. Используя аффинную очистку и масс-спектрометрию, мы идентифицировали Rack1 как новый субстрат p38 MAPK в стареющих мышцах и показали, что генетическое взаимодействие между p38b и Rack1 контролирует формирование мышечных агрегатов, двигательную функцию и продолжительность жизни.Биохимический анализ Rack1 при старении и стрессе мышц предлагает модель, посредством которой передача сигналов p38 MAPK вызывает перераспределение Rack1 между пулом, связанным с рибосомами, и предполагаемым трансляционным репрессорным комплексом.
ВВЕДЕНИЕ
Физиологический анализ старения у людей (1) и недавние молекулярно-генетические исследования на модельных многоклеточных животных открывают убедительную возможность того, что системное функциональное снижение, характерное для старения, является следствием местных дегенеративных изменений в определенных тканях (2).Неудивительно, что скелетные мышцы с их большим метаболическим и эндокринным потенциалом стали важным регулятором системного долголетия. Напр., Модуляция активности пути TOR в мышечной ткани у Drosophila (3) и Caenorhabditis elegans вызывает значительные изменения в продолжительности жизни. Однако молекулярные сигналы, запускающие старение мышц в нормальном физиологическом контексте, более сложны и до конца не изучены.
Центральная роль в старении постмитотических клеток приписывается системе механизмов, контролирующих концентрацию, конформацию и расположение клеточных белков, известной как протеостаз (4).Протеостатическая дисфункция нейронов является хорошо известной причиной распространенных нейродегенеративных синдромов, таких как болезни Паркинсона и Альцгеймера (5). В скелетных мышцах нарушение регуляции протеостаза проявляется аналогичной патологией (6). Нерастворимые белковые агрегаты накапливаются в саркоплазме, миоядрах и эндомизии, со временем вызывая дегенерацию миофибрилл. Это приводит к широкому спектру патологий, известных под общим названием миопатии белковых агрегатов (PAM). Генетические формы PAM связаны с мутациями в разнообразной группе мышечных белков, имеющих как структурные (например,g., миозин, десмин, плектин и тайтин) и неструктурные (например, DNAJB6, BAG-3 и PABPN1) функции (7). Однако наиболее распространенный PAM у пожилых людей, известный как спорадический миозит с тельцами включения (sIBM), не был связан с какими-либо конкретными аллелями одного гена (8, 9). Важно отметить, что как наследственные пациенты с ПАМ, так и спорадические пациенты с ИБГ демонстрируют широкую неоднородность во времени начала и тяжести патологических симптомов. Это клиническое наблюдение повышает вероятность того, что генетические вариации миопротеостатических путей у пациентов достаточно сильны, чтобы изменять патогенную активность белков, склонных к агрегации.В настоящее время мало что известно о клеточных механизмах, модифицирующих PAM, и отсутствуют эффективные терапевтические методы лечения этих прогрессирующих изнурительных заболеваний. Использование генетически поддающихся лечению модельных систем для изучения протеостаза (10), особенно в контексте PAM, открывает большие перспективы для возможного терапевтического вмешательства. Поскольку мышцы взрослых Drosophila повторяют многие из молекулярных, структурных и функциональных элементов ткани скелетных мышц позвоночных (11), муха стала полезной моделью для изучения миопротеостаза.
Построены три летающие модели ПАМ. Мышечная патология в этих моделях достигалась тканеспецифической экспрессией белков человека (APP [12], PABPN1 [13] и E706K мутантная тяжелая цепь миозина IIa [14]), которые, как известно, вызывают образование агрегатов. Все эти модели воспроизводят ключевые особенности заболевания человека, а именно возрастное образование агрегатов, потерю опорно-двигательной функции и сокращение продолжительности жизни. Экспериментальные манипуляции с протеостазом изменяют эти фенотипы. Например, коэкспрессия E3 убиквитинлигазы Parkin в значительной степени устраняет эффекты APP, а сверхэкспрессия компонентов пути Hsp70 или вирусного антиапоптотического белка p35 ослабляет фенотип PABPN1.Два других пути, играющих важную роль в протеостазе при старении мышц Drosophila , были недавно исследованы. Первое исследование показало, что манипуляции с активностью FOXO связаны с возрастным отложением полиубиквитилированных агрегатов в грудных мышцах. FOXO действует через свою мишень транскрипции 4E-BP / Thor, усиливая аутофагию, тем самым увеличивая обмен поврежденных белков (3). FOXO и Thor являются нижележащими компонентами сигнального пути инсулина / IGF, который во многих моделях признан ключевым регулятором функционального старения и долголетия.Однако также изучается вклад других сигнальных путей. Одним из примеров является путь митоген-активируемой протеинкиназы p38 (MAPK). Хотя роль p38 в миогенезе млекопитающих хорошо известна (рассмотрено в ссылках 15 и 16), меньше известно о его функции в стареющих мышцах. Недавнее исследование продемонстрировало, что p38b, одна из двух p38 MAPKs в Drosophila , модулирует опосредованное реактивными формами кислорода (ROS) повреждение грудных мышц (17). По-видимому, задействованы по крайней мере два пути: управляемая Mef2 экспрессия MnSOD (Sod2) и Nrf2-зависимое подавление Keap1.Таким образом, животные с дефицитом p38b демонстрируют повышенные уровни белков, поврежденных окислением, в мышцах и сокращенную продолжительность жизни.
Здесь мы сообщаем, что дефицит p38b приводит к ускоренному отложению агрегатов полиубиквитилированного белка в грудных мышцах стареющих мух, клеточной патологии, вероятно, связанной с ранее описанными локомоторными фенотипами и сокращением продолжительности жизни у этих животных. Используя химико-генетический подход, мы показываем, что эффекты p38b на миопротеостаз не ограничиваются ROS-зависимыми механизмами, но также включают регуляцию синтеза белка.Наконец, мы представляем результаты протеомного скрининга in vivo для мышечно-специфичных субстратов p38b и идентифицируем и охарактеризуем Rack1 как новый субстрат, который может напрямую контролировать скорость трансляции белка в ответ на передачу сигналов p38b.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Генетика мух и лекарственная обработка.
Мух выращивали на стандартной среде кукурузная мука-агар-патока при 25 ° C. p38bΔ45 и вышестоящая активационная последовательность (UAS) — p38bKD мух были описаны ранее (17).Мухи UAS- Sod2 и GMR-Gal4 были любезно подарены A. Hilliker и H. McNeill соответственно. UAS- p38b IR , UAS- Rack1 IR , Mef2-Gal4 , Rack1 1,8 , Rack1 EE и Rack1 902 из Фондового центра Bloomington Drosophila . Для обработки лекарств мух голодали в течение 6 часов и переносили на среду 5% сахарозы – 1% низкоплавкой агарозы (Gibco) с добавлением 5 мМ параквата (Sigma), 600 мкМ пуромицина (Sigma), 20 мМ хлорохина (BioShop). , 50 мкМ MG132 (Sigma) и 10 мкМ хелеритрина хлорид (BioShop).
Тест на восхождение и оценка долголетия.
Способность лазать была измерена с помощью простого анализа с отрицательным геотаксисом путем подсчета количества мух, которые достигают верха флакона (верхние 20% длины) за 5 с после постукивания и деления на общее количество мух. Двадцать мух были протестированы на комбинацию генотип-обработка, и измерения были повторены три раза. Для измерения продолжительности жизни мух содержали на стандартном корме из расчета 20 мух на флакон и переносили в свежие флаконы каждые 3 дня.Уцелевшие мухи подсчитывали каждые 24 часа.
Вестерн-блоттинг и дот-блот-анализ экстрактов грудных мышц.
Чтобы выделить растворимые в детергенте и нерастворимые белковые экстракты, мы модифицировали метод, описанный ранее (18). Пятнадцать грудей для каждого возраста и генотипа были свежеприготовлены и гомогенизированы в 300 мкл буфера А (20 мМ трис-HCl [pH 8,0], 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон X-100, 0,1% додецилсульфат натрия [ SDS], 0,5% дезоксихолат натрия, 0,5% коктейль ингибиторов протеазы [Sigma], 5 мМ NaF, 10 мМ β-глицерофосфат натрия, 1 мМ Na 3 VO 4 ).Лизаты инкубировали на льду в течение 30 минут с периодическим встряхиванием и центрифугировали при 16000 × g в течение 15 минут при 4 ° C. Супернатанты представляли фракцию растворимого в детергенте белка. Гранулы ресуспендировали в 100 мкл буфера B (10 мМ Трис-HCl [pH 7,5], 1% SDS, 0,5% коктейль ингибиторов протеазы [Sigma], 5 мМ NaF, 10 мМ β-глицерофосфат натрия, 1 мМ Na 3 VO 4 ), обрабатывали ультразвуком в течение 1 мин (6 импульсов по 10 с) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Экстракты очищали центрифугированием при 500 × g в течение 10 мин при комнатной температуре, получая фракции, нерастворимые в детергенте.Концентрацию общего белка в экстрагированных фракциях определяли с помощью анализа белка Dc (Bio-Rad), и нормализованные образцы обрабатывали на гелях SDS – 10% PAGE с последующей стандартной процедурой вестерн-блоттинга. Для дот-блот-анализов 3 мкл образцов наносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad) и давали высохнуть в течение ночи. Затем мембраны гидратировали и промывали трис-буферным физиологическим раствором в течение 30 минут при комнатной температуре с последующей инкубацией с блокирующим раствором Odyssey (LI-COR), соответствующими первичными антителами и вторичными антителами, меченными флуорофором в ближней инфракрасной области (козьи антикроличьи антитела). антитело 680RD и козье антимышиное антитело 800CW; LI-COR).Визуализацию и количественную оценку выполняли с использованием системы Odyssey (LI-COR), а агрегированные уровни рассчитывали как отношения флуоресцентных сигналов убиквитина и гистона h4, нормализованные по значениям у мух дикого типа.
В ходе исследования использовали следующие антитела: антиубиквитин (мышиный моноклональный, P4D1; Cell Signaling), антиактин (кроличий поликлональный, I-19-R; Santa Cruz Biotechnology), антигистон h4 (кроличий моноклональный; Cell Signaling), anti-Rack1 (кроличий моноклональный, D59D5; Cell Signaling), анти-S6 (мышиный моноклональный, 54D2; Cell Signaling), анти-фосфо-p38 MAPK (кроличий поликлональный, Thr180 Tyr182; Cell Signaling), анти- Drosophila p38 ( козий поликлональный, dN-20; Santa Cruz Biotechnology), анти-FLAG (мышиный моноклональный, M2; Sigma), анти-фосфо-ATF2 (кроличий поликлональный, Thr71; Cell Signaling) и антипуромицин (мышиный моноклональный, 3Rh21; KeraFast).
Иммунопреципитация и жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (LC-MS / MS), протеомика.
Уровни экспрессии приманки p38bKD исследовали во всех попарных комбинациях трех мышечно-специфичных драйверов (MHC-Gal4, Mef2-Gal4 и 1151-Gal4) и двух независимых линий ответчиков UAS-p38bKD. Большинство этих комбинаций продуцировало значительно более высокие уровни p38bKD по сравнению с эндогенным p38 (данные не показаны). Для протеомного анализа мы выбрали драйвер Mef2-Gal4, который продуцировал <2 раза более высокий уровень p38bKD по сравнению с эндогенным уровнем (см.).
Протеомика взаимодействия идентифицирует Rack1 как партнера по связыванию p38bKD в грудной мышце взрослого человека. (A) Трансгенные мухи Mef2 > p38bKD экспрессируют FLAG-p38bKD (приманка) на уровне, сравнимом с эндогенным p38b (вестерн-блоттинг, вверху). p38bKD и ассоциированные белки выделяют из экстрактов грудной клетки с использованием одностадийной аффинной очистки (гель, окрашенный серебром, внизу) и подвергают анализу LC-MS / MS. HC, тяжелая цепь IgG; LC, легкая цепь IgG. (B) Список белков, взаимодействующих с p38bKD, идентифицированных протеомикой (подробности см. В разделе «Материалы и методы»).Показаны результаты четырех независимых биологических повторных анализов (эксперименты с 1 по 4). Процент покрытия последовательности белка показан для каждого взаимодействующего белка с соответствующей цветовой кодировкой, показанной под таблицей. (C) Взаимодействие Rack1 и p38b было подтверждено коиммунопреципитацией эндогенного Rack1 в клетках S2, временно трансфицированных FLAG-меченными киназами p38 дикого типа, и тремя мутантами p38b, p38bAA (T183A / Y185A), p38bEE (T183E / Y185E), и p38bKD (K53R). Не наблюдается взаимодействия между Rack1 и родственными киназами, p38a и p38c.Среди конструкций p38b только мутант с мертвой киназой демонстрирует устойчивое взаимодействие, открытие согласуется с моделью ловушки субстрата. (D) Взаимодействие p38bKD-Rack1 усиливается у стареющих мух. Коиммунопреципитации проводили с использованием грудных клеток 5-, 15- и 30-дневных мух Mef2 > p38bKD , а уровни эндогенного Rack1 в преципитатах определяли с помощью вестерн-блоттинга.
Трансгенных мух, экспрессирующих p38bKD с меткой FLAG, и контрольных w 1118 мух выдерживали при 25 ° C, анестезировали и препарировали.Отдельные грудные клетки немедленно замораживали на сухом льду. Пятьдесят грудных клеток использовали в типичной иммунопреципитации, и 100 грудных клеток на биологическую повторность использовали в протеомных анализах. Образцы грудной клетки оттаивали на льду и гомогенизировали в буфере для лизиса, описанном ранее (19), с помощью 10-15 движений гомогенизатора Даунса на льду. Лизаты замораживали на сухом льду, оттаивали и центрифугировали при 14000 × g в течение 15 мин. Очищенные лизаты инкубировали с магнитными шариками anti-FLAG M2 (Sigma) в течение 2 часов при 4 ° C.Иммунопреципитацию лизатов клеток S2 проводили, как описано ранее (19). После инкубации шарики промывали, связанные белки расщепляли трипсином и идентифицировали с помощью масс-спектрометра Thermo LTQ XL, соединенного с системой нано-ЖХ (Agilent). Результаты поиска Mascot были отсортированы с помощью программы ProHits (20). Окончательный набор данных состоял из четырех биологических повторов для приманки p38KD и w 1118 контрольных образцов (см. Набор данных S1 в дополнительном материале).Белки, идентифицированные как в приманке, так и в контрольных образцах, считались неспецифическими и удалялись из последующих анализов, за исключением гликогенсинтазы, которой было> 10 раз больше в образцах приманки по сравнению с контролями. Мы также удалили белки, которые были идентифицированы менее чем в двух биологических повторах, и белки, идентифицированные одним пептидом или короткими пептидами (то есть длиной менее 10 аминокислот).
Анализ рекомбинантных Rack1 и киназ.
Полноразмерная кДНК RACK1 человека (MGC) была экспрессирована как N-концевой слитый MBP (система pMAL; New England BioLabs) в BL21 (DE3) Escherichia coli , выращенной при 37 ° C и индуцированной 0.5 мМ IPTG (изопропил-β-d-тиогалактопиранозид) в течение 2 часов. Бактерии лизировали обработкой ультразвуком на льду, и растворимый MBP-RACK1 очищали с использованием амилозной смолы (New England BioLabs) в соответствии с протоколом производителя и заменяли буфер на 25 мМ Трис (pH 7,5) –25 мМ NaCl. Конструкции киназы р38, меченные FLAG, трансфицировали в клетки S2, и клетки стимулировали 10 мМ H 2 O 2 в течение 45 мин. Активные киназы p38 очищали с использованием магнитных шариков против FLAG (Sigma), как описано ранее (19).Киназные реакции собирали путем смешивания очищенного MBP-RACK1 с киназами, связанными с гранулами, в 25 мМ Трис (pH 7,5), 5 мМ β-глицерофосфате, 2 мМ дитиотреитоле (DTT), 0,1 мМ Na 3 VO 4 , 10 мМ MgCl 2 и 200 мкМ АТФ. После 30-минутной инкубации при 30 ° C магнитные шарики удаляли и фосфорилированный субстрат повторно очищали с использованием аффинной матрицы амилозы. Фосфорилирование выявляли вестерн-блоттингом с антителами против фосфо-Ser и против фосфо-Thr (Millipore).
Анализы трансляции in vitro .Протоколы для получения экстрактов и реакций трансляции адаптированы из более ранних исследований (21, 22). Вкратце, грудные клетки лизировали в 10 мМ HEPES (pH 7,4), 5 мМ DTT и 1 × коктейле полного ингибитора протеазы (Roche) и очищали центрифугированием при 14000 × g при 4 ° C в течение 15 минут. Добавляли микрококковую нуклеазу (New England BioLabs) в концентрации 0,15 Ед / мкл и 1 мМ CaCl 2 , и экстракт инкубировали в течение 4 мин при 20 ° C с последующим добавлением 2 мМ EGTA.Смеси реакции трансляции включали 40% экстракт, 50 мМ CH 3 COOK, 0,5 мМ (CH 3 COO) 2 Mg, смесь аминокислот 60 мкМ (Promega), 0,1 мМ спермидин, 20 ед. Ингибитора РНКазы (Fisher ) на реакцию, 0,1 мкг креатинкиназы (Sigma) / мкл, 20 мМ креатинфосфата (BioShop) и 0,03 пмоль мРНК люциферазы светлячков (Promega) на реакцию. Световые единицы люциферазы нормализовали по концентрации белка в грудных экстрактах.
Рибосомное фракционирование.
Грудь, выделенная из старых мух или мух, получавших пуромицин, гомогенизировали в 20 мМ Трис (pH 7.4), 140 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ DTT, 1% Triton X-100, 0,1 мг циклогексимида (Sigma) / мл, 1 мг гепарина / мл и 50 ед. Ингибитора РНКазы (Fisher ) / мл и очищали центрифугированием при 14000 × g в течение 10 мин при 4 ° C (23). Затем супернатанты фракционировали, используя прерывистое центрифугирование в градиенте сахарозы от 10 до 50% при 35000 об / мин в течение 2 часов при 4 ° C. Двенадцать фракций собирали после центрифугирования и использовали для вестерн-блоттинга и полуколичественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Нарушение регуляции белкового гомеостаза в грудных мышцах мутантных мух по p38b.
Поскольку в предыдущей работе описан возрастной моторный дефицит у мух с нулевым p38b (17), мы проверили, может ли аномальное накопление неправильно свернутого белка в грудных мышцах быть связано с наблюдаемым функциональным снижением. Многочисленные доказательства предполагают, что состояние агрегации внутриклеточных неправильно свернутых белков определяет их цитотоксический эффект. Поэтому мы адаптировали двухэтапную процедуру экстракции белка, в которой растворимая фракция выделяется в мягком буфере, содержащем Тритон X-100, а оставшаяся фракция агрегатов солюбилизируется в присутствии 1% SDS.Образцы, полученные из грудных клеток совпадающего по возрасту мух дикого типа и мутантного p38b, исследовали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител противубиквитина (). Чтобы более точно определить уровни конъюгатов убиквитина в экстрактах грудной клетки, мы использовали дот-блоттинг и измерение интенсивности флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне (to). Более высокие уровни убиквитилирования белка наблюдаются в растворимых и агрегированных фракциях мутантных мух по p38b по сравнению с контрольными животными дикого типа независимо от возраста (). Важно отметить, что накопление конъюгатов убиквитина в агрегированных фракциях мутантных мух становится более выраженным у 30-дневных мух (), что согласуется с возрастным снижением двигательной функции.
p38MAPK регулирует накопление белковых агрегатов в стареющих грудных мышцах. (A) Повышенное накопление агрегатов убиквитилированного белка в грудных мышцах мух с дефицитом p38b. Нерастворимые белковые экстракты Triton X-100 (вверху) и Triton X-100 (внизу) получали из грудных клеток дикого типа ( w 1118 ) и изогенных p38b -null ( p38b Δ 45 ) летит через 5, 15 и 30 дней после взрыва.Уровни убиквитилированных конъюгатов определяли с использованием антиубиквитинового антитела. Актин и гистон h4 использовали в качестве контроля загрузки для растворимых и нерастворимых экстрактов соответственно. (B) Уровни убиквитилированных агрегатов количественно определяли с помощью дот-блот-анализов с использованием флуоресцентного обнаружения в ближнем инфракрасном диапазоне (см. Материалы и методы). Дот-блот-анализы проводили в трех экземплярах. Красный флуоресцентный сигнал (убиквитин) был разделен на зеленый сигнал (гистон h4) и нормализован с помощью контроля w 1118 на 5 день.Показан репрезентативный дот-блот с агрегированными образцами. (C и D) Количественное определение конъюгатов убиквитина в агрегированных и растворимых в детергенте фракциях. Столбцы представляют собой средние значения ± стандартные ошибки (SD; n = 3; NS, несущественно; *, P <0,05 [непарный двусторонний тест Стьюдента t ]).
ROS-независимый контроль миопротеостаза с помощью p38b.
Контроль окислительного повреждения, вызываемого ROS в мышцах взрослых мух, стал ключевым механизмом, связывающим активность p38b с продолжительностью жизни (17).В предложенном пути p38b потенцирует управляемую Mef2 экспрессию митохондриальной супероксиддисмутазы (Sod2), тем самым ограничивая эффекты ROS (). В соответствии с этой моделью трансгенная сверхэкспрессия Sod2 в мышечной ткани устраняет влияние дефицита p38b на продолжительность жизни (17). Поэтому мы стремились изучить связь между усиленной агрегацией белка, которую мы наблюдали в мутантной мышце p38b, и индукцией АФК.
p38MAPK регулирует накопление белковых агрегатов независимо от контроля ROS.(A) Драйвер Mef2-Gal4 , используемый на протяжении всего исследования, направляет тканеспецифическую экспрессию в грудной мышце взрослого человека (визуализировано UAS- GFP ). (B) Эктопическая экспрессия MnSOD (Sod2) в грудной мышце. Торакальные экстракты мух, несущих указанные трансгены, исследовали с помощью вестерн-блоттинга. Драйвер Mef2-Gal4 использовался для экспрессии респондеров UAS- Sod2 и UAS- p38b IR . (C) Мух, несущих конструкцию глутатион S -трансфераза D1 (GSTD1) –GFP, кормили пищей с добавлением параквата (концентрации указаны под изображениями), и экспрессия GFP была задокументирована через 24 часа (левый ряд).Изображения четырех мух из повторяющихся флаконов показаны в виде флуоресцентных фотографий. При концентрации параквата от 5 до 10 мМ увеличения интенсивности GFP не наблюдается. Мух GSTD1-GFP кормили пищей с добавлением 5 мМ параквата и снимали изображения в указанные моменты времени. Устойчивая активность промотора GSTD1 наблюдается через 16 ч после обработки (правый ряд). (D) Включение пуромицина в полипептиды в грудной мышце исследовали путем кормления w 1118 мух кормом с лекарственными добавками с последующим вестерн-блоттингом.Следующие концентрации пуромицина тестировали в каждую из указанных временных точек: 0, 100, 200, 400, 600, 800 и 1000 мкМ. Пуромицин эффективно включается во вновь синтезированные пептиды через 16 часов и в концентрации более 400 мкМ. (E) p38b может контролировать отложение агрегатов независимо от пути Mef2 / Sod2. Влияние 16-часового воздействия окислительного (паракват) и протеотоксического (пуромицин) стресса на отложение белковых агрегатов в мышцах измеряли с помощью дот-блот-анализов экстрактов.Линия РНКи на основе инвертированных повторов (UAS- p38b IR ) была использована для подавления экспрессии p38b. Эффекты лекарственного лечения были подтверждены с помощью репортера GSTD1-GFP и вестерн-блоттинга для параквата и пуромицина соответственно. Столбцы представляют собой средние значения ± стандартное отклонение ( n = 3; NS, не значимо; *, P <0,05; **, P <0,01 [непарный двусторонний тест Стьюдента t ]). (F) Схематическое изображение основных протеостатических путей. Химические модуляторы протеостаза имеют цветовую кодировку, соответствующую столбчатым диаграммам на панели и.
Во-первых, мы сравнили уровни убиквитилированных агрегатов в грудной клетке недельных мух, выращенных на обычном корме. Как и ожидалось, агрегаты были повышены у мух с мышечно-специфическим нокдауном (драйвер Mef2-Gal4) p38b по сравнению с контролем дикого типа (). Однако введение эктопического Sod2 () животным с нокдауном p38b вызвало лишь незначительное снижение образования агрегатов (). Затем мы проверили, может ли образование агрегатов усиливаться за счет мощной системной индукции ROS и способности p38b и Sod2 опосредовать этот процесс.Используя трансген GSTD1-зеленый флуоресцентный белок (GFP) в качестве датчика окислительного стресса, мы определили, что 16-часовое воздействие 5 мМ параквата на мух достаточно для системной индукции АФК (). Эти условия затем использовали для изучения влияния индукции АФК на отложение агрегатов. Мухам в возрасте одной недели давали 5 мМ параквата в течение 16 ч с последующей экстракцией белка и дот-блот-анализом убиквитилированных агрегатов. Небольшое увеличение (<25%) совокупных уровней наблюдалось у мух дикого типа и мух с нокдауном p38b по сравнению с соответствующими уровнями у мух, получавших без добавок корма.Сходное увеличение было также замечено у мух с нокдауном p38b, избыточно экспрессирующих Sod2 (). Эти наблюдения предполагают, что дефицит p38b не приводит к значительному увеличению отложения агрегатов в ответ на временную индукцию ROS и что активность Sod2 по нейтрализации ROS недостаточна для подавления образования агрегатов, вызванного дефицитом p38b.
Наконец, мы исследовали роль p38b и Sod2 в ROS-независимой модели индукции агрегатов. Пуромицин представляет собой аналог аминоацил тРНК, который связывается с рибосомой и блокирует удлинение полипептидной цепи, вызывая преждевременное высвобождение усеченных белков.Когда синтез этих усечений перекрывает пути выведения белков, они могут способствовать формированию агрегатов. Мы контролировали включение пуромициновых фрагментов в полипептидные цепи с помощью вестерн-блоттинга (), а затем кормили мух в возрасте 1 недели кормом с добавлением пуромицина 600 мкМ в течение 16 часов до агрегированной экстракции. Действительно, у мух дикого типа и мутантного p38b было зарегистрировано увеличение уровня агрегатов на ~ 80% по сравнению с контрольной группой, получавшей корм без добавок (). Важно отметить, что на уровни агрегатов у p38-дефицитных животных не влияла эктопическая экспрессия Sod2.В совокупности эти данные предполагают, что повреждения, опосредованные ROS, недостаточны для объяснения эффекта дефицита p38b на отложение белковых агрегатов.
p38b может участвовать в контроле синтеза белка в грудной мышце.
Поскольку Sod2 не полностью устраняет эффекты дефицита p38b на формирование агрегатов в мышцах, мы заключаем, что существует дополнительный ROS-независимый механизм (ы) p38b-опосредованного контроля миопротеостаза. Трансляция — это центральный узел белкового обмена, который, как известно, получает входные данные от различных сигнальных путей, в первую очередь от TOR.Чтобы проверить возможность того, что передача сигналов p38b также вносит вклад в контроль трансляции в мышцах, мы сначала попытались определить, контролирует ли p38b формирование агрегатов выше путей деградации (). Мы использовали химико-генетический подход in vivo . Мухам дикого типа и мутантным p38b в возрасте одной недели давали мощные ингибиторы протеасомы (MG132) и аутофагии (хлорохин) в отсутствие () или в присутствии пуромицина. После медикаментозного лечения уровни нерастворимых в детергентах конъюгатов убиквитина в грудных клетках мух определяли с помощью дот-блот-анализа ().Оба ингибитора вызывали умеренное увеличение нерастворимых агрегатов в мышцах дикого типа и демонстрировали аддитивность. Мы рассудили, что если p38b действует исключительно на уровне деградации белка, можно ожидать, что обработка MG132 и хлорохином нейтрализует эффект дефицита p38b. В отличие от этого прогноза, мы наблюдали значительно более высокие уровни мышечных агрегатов у мутантных p38 мух, получавших ингибитор, по сравнению с контрольными животными дикого типа. Эти различия были еще более выраженными, когда лечение ингибиторами проводилось в присутствии пуромицина ().В совокупности эти результаты предполагают, что передача сигналов p38b влияет на миопротеостаз выше путей деградации, что согласуется с возможной ролью p38b в синтезе белка.
p38b контролирует миопротеостаз перед путями деградации белка. (A) Кормление w 1118 корм для мух с добавлением 50 мкМ MG132, 20 мМ хлорохина и комбинации этих двух препаратов приводит к устойчивому накоплению убиквитилированных белков в грудных мышцах по сравнению с необработанными контролями.Показаны вестерн-блоттинги экстрактов грудных мышц. (B) Активность протеасом и аутофагия ингибировались обработкой w1118 и p38b Δ 45 MG132 и хлорохином, соответственно. Дополнительный протеотоксический стресс был вызван пуромицином. Совокупные уровни в грудной клетке определяли с помощью дот-блоттинга. Столбцы представляют собой средние значения ± стандартное отклонение ( n = 3; NS, не значимо; *, P <0,05; **, P <0,01 [непарный двусторонний тест Стьюдента t ]).
In vivo протеомный экран для мышечно-специфических субстратов p38b.Существует лишь несколько охарактеризованных субстратов киназ р38 Drosophila , и ранее не сообщалось о субстратах, непосредственно участвующих в регуляции трансляции (19). Чтобы изучить репертуар мышечно-специфических субстратов p38b in vivo , мы использовали подход ловушки субстрата (24, 25). Мутант p38b (p38bKD) с мертвой киназой, меченный FLAG, был экспрессирован в грудных мышцах (), очищен по аффинности и проанализирован с помощью масс-спектрометрии для идентификации совместно очищающих белков.Предполагается, что некоторые из белков в изолированных комплексах представляют собой настоящие субстраты, захваченные непродуктивными взаимодействиями с каталитически неактивной киназой. Мы выполнили четыре повторных очистки комплексов p38bKD от 15-дневных мух параллельно с четырьмя контрольными очистками (см. Материалы и методы). Учитывались только взаимодействующие белки, специфичные для образцов p38bKD и обнаруженные в двух или более повторах. Поскольку большое количество факторов вносит вклад в стехиометрию связывания неактивной киназы с субстратом, ранжирование потенциальных субстратов на основе покрытия белком не проводилось.Всего было идентифицировано 19 предполагаемых субстратов (), включая ранее охарактеризованные субстраты MK2 и гликогенсинтазу. Один из выделенных белков, рецептор активированной C-киназы 1 (Rack1), является компонентом 40S субъединицы рибосомы, который, как известно, регулирует инициацию трансляции (26). Мы предположили, что Rack1 может служить связующим звеном между передачей сигналов p38b и регуляцией трансляции и, таким образом, выбрали этот интерактор для дальнейшего анализа, несмотря на его относительно низкое белковое покрытие.
p38b связывает и фосфорилирует Rack1
in vitro .Чтобы проверить взаимодействие p38b и Rack1, мы экспрессировали FLAG-меченые версии p38b, p38bKD дикого типа, а также родственные киназы p38a и p38c в клетках S2 Drosophila и проверили, можно ли обнаружить эндогенный Rack1 в киназе иммунопреципитаты. Как показано на фиг.1, Rack1 специфически связывается с p38bKD, но не с p38b дикого типа или двумя мутантами с активационной петлей, что согласуется с моделью захвата субстрата. Связывания между Rack1 и p38a или p38c не наблюдается.Сходным образом p38bKD связывается с эндогенным Rack1 in vivo , и взаимодействие оказывается более сильным у старых мух (). В клетках S2 p38b образует стабильные комплексы с MK2 и др. Партнерами (19), повышая вероятность того, что Rack1 ассоциирует с p38b через др. Компоненты комплекса. Таким образом, мы выполнили in vitro анализов связывания с использованием бактериально экспрессируемого p38b и Rack1 и подтвердили прямое физическое взаимодействие между двумя белками (). Затем мы попытались определить, может ли Rack1 служить субстратом для активированного p38b.Клетки S2 трансфицировали p38b, p38bKD и p38a дикого типа, и соответствующие киназы иммунопреципитировали из нестимулированных клеток или клеток, подвергшихся окислительному стрессу (H 2 O 2 ). Бактериально экспрессируемое слияние MBP-Rack1 инкубировали с киназами p38, связанными с гранулами, и в конце реакции Rack1 повторно очищали с использованием амилозо-агарозы и тестировали на присутствие фосфорилирования с помощью вестерн-блоттинга с антифосфо-Ser и антифосфо-Thr. антитела. Чтобы подтвердить киназную активность p38 в этих анализах, мы создали параллельный набор реакций с известным субстратом p38 ATF2 ().Активированный стрессом p38b, но не p38a, был способен фосфорилировать как остатки Ser, так и остатки Thr в Rack1. Эти события фосфорилирования приписываются киназной активности p38b, поскольку в реакциях p38bKD не обнаруживается фосфо-сигнал, а уровень фосфорилирования значительно снижается в присутствии SB203580, специфического ингибитора p38.
Rack1 действует как прямой субстрат p38b, не влияя на его киназную активность. (A) Бактериально экспрессируемый MBP-Rack1 и FLAG-p38b демонстрируют связывание в тесте с пониженным уровнем, подтверждая их прямое взаимодействие.Белки визуализировали окрашиванием кумасси синим. Отмечены полосы, соответствующие p38b и Rack1. Ленточная денситометрия показала, что ок. 5% входящего Rack1 связывается с p38b, это открытие согласуется с временным взаимодействием киназа-субстрат. (B) Клетки S2 трансфицировали указанными конструкциями p38MAPK с меткой FLAG и стимулировали 10 мМ H 2 O 2 в течение 30 мин. Затем киназы очищали из лизатов S2 с помощью FLAG-иммунопреципитации и использовали в анализах in vitro киназ с MBP-Rack1.MBP и ATF2 использовали в качестве контроля. Inh, 10 мкМ SB203580. После киназных реакций MBR-Rack1 повторно очищали с использованием гранул амилозы и определяли его фосфорилирование с помощью вестерн-блоттинга. Указывается расположение полос, соответствующих MBP-Rack1 (Rack1) и MBP (Control). Состав киназных реакций in vitro , соответствующих полосам геля, показан в рамке. (C) Уровень и активность p38b были исследованы в мышцах без стресса (25 ° C) или подвергнутых тепловому шоку (37 ° C, 30 мин) нокдауна Rack1 ( Mef2 > Rack1 IR ) и контрольной ( Mef2 ). > GFP ) летает.Уровни общего и фосфо-p38b (T183, Y185) были определены с помощью вестерн-блоттинга и не показали изменений в ответ на истощение Rack1. Активированный эндогенный P-p38 иммунопреципитировали из экстрактов грудной клетки и анализировали in vitro с использованием рекомбинантного субстрата ATF2. Киназная активность P-p38 кажется неизменной у мух Mef2 > Rack1 IR по сравнению с контролем.
Взаимодействие с Rack1 не модулирует активность p38b.
Было показано, что несколько партнеров по связыванию киназ p38 влияют на активность киназы, выступая в качестве каркаса для вышестоящих киназ, шаперонов для ядерно-цитоплазматического перемещения и других механизмов (27).Поэтому мы проверили, может ли взаимодействие с Rack1 модулировать некоторые аспекты активности p38b in vivo . Однонедельные мухи с мышечно-специфическим нокдауном Rack1 ( Mef2 > Rack1 IR ) и контрольные животные, работающие только с водителем, подвергались тепловому шоку при 37 ° C для активации p38, а лизаты грудной клетки анализировали с помощью вестерн-блоттинга ( ). Несмотря на заметное истощение Rack1 у животных Mef2 > Rack1 IR , не наблюдали значительных изменений в уровнях общего p38 или индуцированного стрессом фосфо-p38.Затем дважды фосфорилированный p38 иммунопреципитировали из лизатов грудной клетки и использовали в анализах in vitro киназы с рекомбинантным ATF2 (). В этих реакциях были обнаружены примерно равные уровни фосфо-ATF2, что указывает на то, что уровень Rack1 в грудных мышцах не влияет на каталитическую активность p38b.
Генетическое взаимодействие между p38b и Rack1 усиливает накопление белковых агрегатов в мышцах и контролирует продолжительность жизни и двигательную функцию.
На основании наших биохимических результатов мы пришли к выводу, что p38b и Rack1 могут иметь общий генетический путь.Мы сначала проверили эту возможность на глаз. Гомозиготные мутантные мухи p38b ( p38b Δ 45 ) демонстрируют небольшой фенотип грубых глаз по сравнению с диким типом w 1118 глазами (верхний ряд). Напротив, омматидиальные дефекты не наблюдаются у гетерозигот p38b ( p38b Δ 45 / + ), а минимальное нарушение омматидиального рисунка наблюдается у мух с специфическим для глаза нокдауном Rack1 ( GMR > Rack1 IR ).Однако истощение Rack1 в сочетании с одной копией аллеля p38b-null ( p38b Δ 45 / + GMR > Rack1 IR ) приводит к грубым глазам, которые уменьшаются в размере (), что указывает на доминирующее взаимодействие эти два аллеля и предполагают, что p38b и Rack1, вероятно, действуют по одному и тому же пути.
Rack1 и p38b генетически взаимодействуют для контроля миопротеостаза, опорно-двигательной функции и продолжительности жизни. (A) Фенотипы глаз животных, несущих аллели p38b и Rack1 , были задокументированы с помощью сканирующей электронной микроскопии.Верхний ряд, увеличение × 150, масштабная линейка 200 мкм. Нижний ряд, увеличение × 2000, масштабная линейка 15 мкм. Меньшие грубые глаза наблюдаются, когда специфический для глаза нокдаун Rack1 ( GMR > Rack1 IR ) сочетается с гетерозиготным аллелем p38b -null ( p38bΔ45 ). (B) Отложение агрегатов в грудной клетке в значительной степени не влияет на гипоморфный фон Rack1 ( Rack1 EE / Rack1 EY128 ) по сравнению с контролем дикого типа.Однако образование агрегатов сильно усиливается путем комбинирования этих аллелей Rack1 с нокдауном p38b ( Mef2 > p38b IR ). Совокупные уровни измеряли с помощью дот-блоттинга в грудных экстрактах трехдневных мух (см. Материалы и методы). (C) Трехдневных мух кормили паракватом или пуромицином и подвергали простому анализу отрицательного геотаксиса. Генетическое взаимодействие Rack1 EE / Rack1 EY128 и Mef2 > p38b IR значительно снижает опорно-двигательную функцию при протеотоксическом стрессе.На панелях B и C столбцы представляют средние значения ± стандартное отклонение ( n = 3; NS, не значимо; *, P <0,05; **, P <0,01 [непарный двусторонний критерий Стьюдента t ]). (D) Продолжительность жизни оценивали у мух указанных генотипов путем оценки выживаемости при нормальных условиях (25 ° C, без добавок) в течение 15 дней. Пунктирная линия указывает на медианное значение выживаемости. Заметно уменьшился срок службы Rack1 EE / Rack1 EY128 ; Mef2 > p38b IR летает.
Затем мы проверили, влияет ли наблюдаемое генетическое взаимодействие на отложение нерастворимых агрегатов в грудной мышце. Для этих тестов мы использовали мух, несущих гомозиготный Rack1-нулевой аллель ( Rack1 1,8 ), которые не экспрессируют детектируемый белок Rack1 и трансгетерозиготную комбинацию сильных гипоморфных аллелей ( Rack1 EE EE EY128 ), которые выражают значительно пониженные уровни Rack1 (28).Интересно, что грудные мышцы Rack1-нулевых животных содержат высокие уровни нерастворимых агрегатов, тогда как уровни, обнаруженные у гипоморфов, не значительно выше, чем у мух дикого типа (). Однако, когда p38b истощается из-за РНК-интерференции (RNAi; Mef2 > p38b IR ) в Rack1 EE / Rack1 EY128 , мышечные агрегаты резко повышаются, и уровни мышечных агрегатов резко повышаются. превышают наблюдаемые в грудных клетках Mef2 > p38b IR в присутствии уровней Rack1 дикого типа ().
Мы пришли к выводу, что нерастворимые агрегаты, накапливающиеся в мышцах мутантов Rack1 и p38b, могут влиять на двигательную функцию и продолжительность жизни этих животных. Чтобы проверить эти возможности, мы провели отрицательный анализ геотаксиса с использованием 3-дневных животных указанного генотипа (), выращенных на нормальной пище. В этом возрасте только гомозиготные мухи Rack1 1,8 показали значительно сниженную способность лазать. Поэтому мы подвергали этих животных дополнительному протеотоксическому и окислительному стрессу, давая им корм с добавками пуромицина и параквата в течение 24 часов.В этих условиях у мух, получавших пуромицин, наблюдались наиболее выраженные изменения. Подъемные способности мух Rack1-null еще больше ухудшились, и, что важно, Rack1 EE / Rack1 EY128 ; Mef2 > p38b IR мухи страдали более чем 2-кратным снижением опорно-двигательной функции по сравнению с контролем без лекарств. Напротив, кормление паракватом вызывало лишь незначительные изменения в способности лазать, которые были ограничены животными с пониженным уровнем p38b, независимо от фона Rack1.Эти данные показывают, что взаимодействие p38b-Rack1 модулирует локомоторную функцию в ответ на протеотоксический, но не окислительный стресс.
Наконец, мы попытались сопоставить вышеуказанные молекулярные и функциональные наблюдения с продолжительностью жизни мух с соответствующими комбинациями аллелей (). Действительно, Rack1 1.8 гомозиготы и Rack1 EE / Rack1 EY128 ; Mef2 > p38b IR мухи продемонстрировали самую короткую продолжительность жизни, что согласуется с уровнями накопления агрегатов в грудных мышцах и чувствительностью к протеотоксическому стрессу.
Путь p38b / Rack1 влияет на скорость трансляции в мышцах.
Учитывая чувствительность мух с двойным мутантом p38b и Rack1 к протеотоксическому стрессу и участие Rack1 в регуляции трансляции, мы предположили, что Rack1 может служить связующим звеном между передачей сигналов p38b и контролем синтеза белка. Чтобы проверить это, мы оценили скорость синтеза белка de novo в мышцах однодневных и 15-дневных мух с помощью анализа трансляции in vitro (). Торакальные экстракты получали из взрослых, несущих аллели p38b и Rack1 , с последующим измерением трансляционной активности в этих экстрактах с использованием синтетической мРНК люциферазы светлячка.В соответствии с предыдущими результатами (29) в контроле дикого типа скорость трансляции была значительно снижена у старых мух. Напротив, экстракты молодых гомозиготных мутантов p38b и в сопоставимой степени мух Mef2 > p38b IR показали на ~ 60% более высокую скорость трансляции, а у старых животных не было обнаружено значительного снижения трансляционной активности. Экстракты из молодой мышцы Rack1 -null показали на 42% более низкую скорость трансляции по сравнению с контролями дикого типа, это открытие согласуется с положительной регуляторной ролью Rack1 в синтезе белка.Небольшое дальнейшее снижение скорости наблюдалось в экстрактах из 15-дневных мутантов Rack1. Важно отметить, что нокдаун p38b на фоне Rack1-null не влиял на скорость репортерной трансляции в экстрактах как молодых, так и старых мух. Эти результаты предполагают, что стимулирующий эффект дефицита p38b на трансляцию белка в грудной мышце зависит от Rack1 и размещает Rack1 ниже передачи сигналов p38b.
Путь p38b-Rack1 контролирует скорость трансляции в стареющих мышцах. (A) In vitro. Анализы трансляции проводили с экстрактами грудной клетки от 1- и 15-дневных мух с использованием синтетического репортера мРНК люциферазы светлячков (см. «Материалы и методы»).Столбцы представляют собой средние значения ± стандартное отклонение ( n = 3; NS, не значимо; *, P <0,05; **, P <0,01 [непарный двусторонний тест Стьюдента t ]). (B) Скорости трансляции были измерены in vivo путем кормления мух указанных генотипов (таких же, как на панели A) 600 мкМ пуромицина в течение 24 часов. После обработки грудные экстракты анализировали вестерн-блоттингом с антителом против пуромицина. Общий белок визуализировали окрашиванием Ponceau-S. Y — молодые, однодневные мухи; О, старые, 15-дневные мухи.(C) Изменения в ассоциации Rack1 и рибосомных субъединиц с мРНК у стареющих мух дикого типа и p38b -дефицитных мух исследовали с помощью олиго (dT) раскрывающегося списка и иммунопреципитации против Rack1. rpS6 и 28S рРНК использовали в качестве репрезентативных компонентов 40S и 60S рибосомных субъединиц. Уровни РНК определяли с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР. (D) Пути p38b-Rack1 и Rack1-PKC, по-видимому, действуют параллельно, влияя на скорость трансляции в мышце Drosophila . Дикий тип ( w 1118 ) и Rack1 ( Rack1 1.8 ) — и нулевые мутанты p38b ( p38b Δ 45 ) -нуль получали пищу с добавлением хелеритрина хлорида (PKC inh) с последующим измерением трансляционной активности в грудных экстрактах in vitro (см. Материалы и методы). Дефицит p38b не может противодействовать репрессивному эффекту ингибирования PCK на трансляцию. Столбцы представляют собой средние значения ± стандартное отклонение ( n = 3; NS, несущественно; *, P <0,05; **, P <0.01 [непарный двусторонний тест Стьюдента t ]). (E) передача сигнала p38b необходима для индуцированной протеотоксическим стрессом диссоциации Rack1 от полисом. Животных дикого типа и p38b-нулевых животных лечили пуромицином, а грудные экстракты фракционировали, используя центрифугирование в градиенте сахарозы. Четкое перераспределение Rack1 между фракциями RNP (верхняя часть градиента) и полисом (нижняя часть градиента) наблюдается у мух дикого типа, получавших пуромицин. У p38b -null мух Rack1 остается в значительной степени связанным с полисомной фракцией при протеотоксическом стрессе.(F) Модель, изображающая механизмы Rack1-опосредованного контроля трансляции. Предполагаемый несвязанный с рибосомами комплекс Rack1, который репрессирует трансляцию в ответ на передачу сигналов p38, показан слева.
Аналогичные результаты были получены при измерении скорости синтеза белка в грудных мышцах живых мух с помощью SUnSET (30, 31). Включение пуромицина в полипептидные цепи визуализировали вестерн-блоттингом грудных экстрактов (). Мухи дикого типа демонстрируют явное снижение скорости трансляции при старении, в то время как заметного снижения не наблюдается у 15-дневных мух с дефицитом p38b ( p38bΔ45 и Mef2 > p38b IR ).Эффект дефицита p38b зависит от Rack1, поскольку скорость синтеза белка оказалась низкой у Rack1 1,8 мух независимо от уровня p38b.
Передача сигналов p38b может направлять Rack1 к несвязанному с рибосомами репрессорному комплексу трансляции.
Rack1 сильно взаимодействует с 40S субъединицей рибосомы и также присутствует в 40S-несвязанном пуле. Как компонент 40S, Rack1 обычно считается стимулирующим инициацию трансляции путем привлечения протеинкиназы C (PKC) к эукариотическому фактору инициации трансляции 6 (eIF6) и eIF4E, но его трансляционная функция вне комплекса 40S плохо изучена (26).Таким образом, мы стремились выяснить молекулярные основы p38b-опосредованного эффекта Rack1 на синтез белка в мышцах. Во-первых, мы исследовали ассоциацию Rack1 и отдельных рибосомных субъединиц (измеренную путем обнаружения рРНК rpS6 и 28S) с общей мРНК у однодневных и 15-дневных животных дикого типа и животных без p38b. Эти мухи также несли конститутивно экспрессируемый трансген GFP, обеспечивая модель мРНК, лишенную регуляторных нетранслируемых областей. Эксперименты по выпадению олиго (dT) с использованием экстрактов грудной клетки этих животных показали снижение ассоциации 40S и 60S с мРНК у старых мух дикого типа по сравнению с более молодыми контрольными животными.В соответствии с результатами трансляции in vitro у мутантов p38b мРНК оставалась связанной с рибосомными субъединицами в любом возрасте. Важно отметить, что ассоциация Rack1 с полиаденилированными транскриптами, по-видимому, в значительной степени не изменяется независимо от возраста или генотипа p38b (). Диссоциация субъединиц 40S и 60S, но не Rack1, от мРНК в старых мышцах дикого типа может указывать на то, что передача сигналов p38b индуцирует диссоциацию Rack1 от 40S. Однако иммунопреципитация Rack1 из лизатов грудной клетки показывает, что комплекс Rack1-40S остается интактным как в молодых, так и в старых мышцах и, по-видимому, не зависит от p38b.Точно так же мРНК GFP соосаждение с Rack1 на сопоставимых уровнях во всех образцах. Напротив, четкая диссоциация субъединицы 60S происходит в стареющих мышцах дикого типа, что согласуется с результатами олиго (dT) раскрытия ().
Поскольку Rack1 положительно регулирует инициацию трансляции посредством PKC, мы затем проверили, участвует ли передача сигналов p38b также в этом пути. Однодневных Rack1- и p38b-нулевых мух лечили мощным ингибитором PKC, хелеритринхлоридом, и трансляционную активность в экстрактах мышц измеряли в реакции in vitro .Ингибирование PKC сильно ослабляет трансляционную активность в мышцах дикого типа и не оказывает значительного эффекта на мутанты Rack1, подтверждая потребность в Rack1 для трансляционных эффектов PKC (). Как было показано ранее (и), мышца, не содержащая p38b, демонстрирует повышенную трансляционную активность. Однако ингибирование PKC снижает скорость трансляции пропорционально изменению в мышцах дикого типа, указывая на то, что p38b является незаменимым для передачи сигналов Rack1 / PKC.
Эти наблюдения согласуются с возможностью того, что передача сигналов p38b противодействует Rack1-зависимому усилению инициации трансляции независимо от передачи сигналов PKC или сборки 80S и способствует ассоциации Rack1 с мРНК независимо от связывания с 40S.Более того, поскольку дефицит p38b увеличивает базальную скорость трансляции, комплекс Rack1-мРНК может быть репрессивным для трансляции (). Чтобы протестировать эту модель, мы подвергали мух дикого типа и p38b-нулевых мух протеотоксическому стрессу и фракционировали грудные экстракты на градиентах сахарозы для разделения фракций, содержащих активно транслируемые полисомы из фракций нерибосомных РНП (). Как и ожидалось, пониженные уровни Rack1 и rpS6 присутствуют в полисомах от стрессированных мух дикого типа. Одновременно значительно более высокий уровень Rack1 наблюдается во фракции RNP в отсутствие соответствующего увеличения уровня 40S.У животных с мутантами p38b протеотоксический стресс не вызывает аналогичного перераспределения рибосом и Rack1. Этот результат предполагает, что индуцированная стрессом передача сигналов p38b транспортирует Rack1 в пул, не связанный с рибосомами.
ОБСУЖДЕНИЕ
Белковый гомеостаз играет центральную роль в нормальном функционировании мышц, старении и болезнях. Высокий уровень метаболической активности в мышечной ткани создает среду, способствующую накоплению повреждений белком. Неудивительно, что клеточные механизмы, контролирующие обмен белков в этой ткани, сложны и точно настроены.Патогенная дисрегуляция миопротеостаза вызывает PAM, например sIBM, которые приводят к прогрессивному снижению мышечной функции и, вероятно, способствуют старению организма. Поскольку молекулярные поражения, управляющие sIBM, остаются неуловимыми, моделирование PAM у генетически поддающихся лечению организмов может дать столь необходимые выводы.
Основываясь на предыдущем исследовании, которое документально подтвердило локомоторный дефицит у мутанта p38b Drosophila (17), мы изучили накопление агрегатов полиубиквитилированного белка в мутантных грудных мышцах и обнаружили значительно повышенные уровни агрегатов.Хотя этот результат согласуется с известной ролью p38 в снижении ROS и окислительного повреждения белков через путь Mef2 / Sod2 (17), наши данные предполагают дополнительные механизмы, с помощью которых p38b противодействует агрегации. Во-первых, конститутивная экспрессия Sod2 оказывает минимальное влияние на агрегированные уровни в мышцах дикого типа или с дефицитом p38b. Во-вторых, кратковременная индукция АФК кормлением паракватом мух не приводит к значительному повышению уровня агрегатов. В отличие от окислительного повреждения, индуцированный пуромицином протеотоксический стресс значительно усиливает отложение агрегатов p38b-зависимым и Sod2-независимым образом.
Протеасомная деградация и аутофагия опосредуют клиренс неправильно свернутых и поврежденных белков и представляют собой вероятные нижестоящие эффекторы передачи сигналов p38b. В самом деле, у млекопитающих путь Gadd45β / Mekk4 / p38 ингибирует Atg5 путем прямого фосфорилирования (32), а p38α, по-видимому, разрушает компетентный для цикла Atg9-p38IP комплекс, конкурируя за связывание p38IP (33). Кроме того, путь MLK3 / p38, индуцированный накоплением мутантного GFAP в астроцитах, усиливает аутофагию, отрицательно регулируя фосфо-mTOR (34).Чтобы определить, являются ли эти пути деградации основными узлами протеостаза, регулируемого p38b, мы использовали химико-генетический подход. Поразительно, что фармакологическое ингибирование протеасомы, аутофагии или того и другого не помогло устранить стимулирующий агрегацию эффект дефицита p38b, что свидетельствует о существовании регулируемых p38b процессов выше путей деградации.
Ранее было показано, что p38 активирует свои субстратные киназы Mnk1 / Mnk2, которые связываются с eIF4G и фосфорилируют остаток Ser201 eIF4E (35), тем самым усиливая инициацию трансляции.Среди 19 предполагаемых субстратов p38b, выделенных в нашем протеомном скрининге in vivo , два, rpS15 и Rack1, представляют собой рибосомные компоненты, потенциально обеспечивающие прямую связь между передачей сигналов p38 и трансляционной активностью. Rack1 — это высококонсервативный многофункциональный адаптерный белок WD-повтора, который связывает 40S через 18S рРНК, rpS3, rpS16 и rpS17 (26). Наши биохимические анализы подтвердили, что p38b специфически фосфорилирует Rack1 по остаткам Ser и Thr, хотя конкретные сайты фосфорилирования еще предстоит определить.Важно отметить, что передача сигналов p38b-Rack1 оказывается однонаправленной, поскольку не наблюдается зависимых от Rack1 изменений активности p38b. Генетические данные дополнительно подтверждают нашу гипотезу, что p38b и Rack1 действуют по общему пути, влияя на формирование агрегатов в мышцах. Таким образом, гипоморфная мутация Rack1, которая сама по себе недостаточна, чтобы вызвать высокий уровень агрегатов, синергетически с RNAi-опосредованным истощением p38b, вызывая значительно увеличенное отложение агрегатов, дефекты опорно-двигательного аппарата и сокращение продолжительности жизни.
Каков молекулярный механизм p38b / Rack1-опосредованного контроля миопротеостаза? Предыдущие исследования выявили как стимулирующую, так и ингибирующую роль Rack1 в трансляции мРНК в зависимости от клеточного контекста. В качестве позитивного регулятора инициации трансляции Rack1 рекрутирует активированный PKCβII в рибосому для фосфорилирования eIF6 (36) и eIF4E (37). Однако Rack1 ассоциируется с рибосомой даже в типах клеток, которые лишены экспрессии PKCβII, что указывает на дополнительные роли связанного с рибосомами Rack1.Другие исследования отмечают повышенную трансляционную активность в Rack1-дефицитных клетках (38, 39). Экстракты из грудной мышцы мутантов Rack1-null демонстрируют пониженную активность в анализах трансляции in vitro по сравнению с контролями дикого типа, тогда как экстракты мутантов p38b показывают повышенную активность. Однако эффект истощения p38b полностью обращен на Rack1-нулевой фон, вовлекая p38b в качестве негативного вышестоящего регулятора Rack1-зависимого пути трансляции. Фармакологическое ингибирование PKC подавляет трансляционную активность в грудных экстрактах p38b-null, предполагая, что передача сигналов p38b / Rack1 не зависит от пути PKC и повышает вероятность того, что p38b действует на Rack1 вне комплекса Rack1-PKC-80S (2).Эксперименты по биохимическому фракционированию подтверждают эту модель. Во-первых, в старых мышцах дикого типа снижение трансляционной активности совпадает с ослабленной ассоциацией мРНК с субъединицами 40S и 60S, но не с Rack1 (). Во-вторых, протеотоксический стресс вызывает повышение уровня Rack1 в неполисомной фракции без соответствующего увеличения 40S (). Оба этих эффекта имеют зависимость от p38b.
Молекулярная идентичность индуцированного стрессом и потенциально несвязанного с рибосомами комплекса Rack1 и его влияние на трансляцию ассоциированной мРНК в Drosophila неизвестны.Недавнее исследование на дрожжах (40) охарактеризовало Rack1-содержащий трансляционно репрессивный комплекс SESA, который может сохраняться у высших эукариот. Комплекс SESA включает в себя KH-домен РНК-связывающий белок Scp160 / vigilin, eIF4E-связывающий белок Eap1, Smy2 / GIGYF2 и Asc1 / Rack1 и активируется дефектами дупликации тела полюса веретена для подавления трансляции подмножества клеточного мРНК, например мРНК POM34 . Наши эксперименты по протеомике взаимодействия выявили гомологичный репрессивный комплекс Rack1 / vigilin / GIGYF2 в клетках человека, который проявляет чувствительность к стрессовым стимулам (V.Belozerov, неопубликованные данные), предлагая кандидата на механистическую связь между передачей сигналов p38 и репрессией трансляции.
Ключевые факты о «Кремлевском отчете» США — World
ВАШИНГТОН, 30 января. / ТАСС /. Министерство финансов США перечислило 114 крупных российских политиков и членов руководства страны в своем «Кремлевском отчете». Премьер-министр России Дмитрий Медведев, его заместители и другие члены кабинета были включены в так называемый Кремлевский список министерства финансов США, представленный Конгрессу в понедельник.
Кроме того, в этом «списке» фигурируют первый вице-премьер Игорь Шувалов, вице-премьер Сергей Приходько, Александр Хлопонин, Виталий Мутко, Аркадий Дворкович, Ольга Голодец, Дмитрий Козак и Дмитрий Рогозин и другие 22 министра. в том числе министр иностранных дел Сергей Лавров и министр обороны Сергей Шойгу.
В список также входят глава администрации президента Антон Вайно, официальный представитель Кремля Дмитрий Песков и другие высокопоставленные члены президентской администрации, а также помощники Кремля, советники президента и полномочные представители в федеральных округах.
Другими высокопоставленными политическими лидерами в списке являются спикер Совета Федерации (верхняя палата) Валентина Матвиенко, спикер Государственной Думы (нижняя палата) Вячеслав Володин, начальник Генштаба Валерий Герасимов, мэр Москвы Сергей Собянин, генеральный прокурор Юрий Чайка и глава Следственного комитета. Комитет Александр Бастрыкин.
Михаил Федотов, возглавляющий Совет при президенте РФ по гражданскому обществу и правам человека, российский бизнес-омбудсмен Борис Титов и Уполномоченный при президенте РФ по правам ребенка Анна Кузнецова также упомянуты в Кремлевском списке.
В документе также фигурируют главы крупнейших госкорпораций, в том числе глава «Газпрома» Алексей Миллер, глава «Роснефти» Игорь Сечин, глава Сбербанка Герман Греф, генеральный директор РЖД Олег Белозеров и другие.
Кроме того, Министерство финансов США внесло 96 имен в список так называемых российских олигархов. Среди них бизнесмены Алишер Усманов, Роман Абрамович, Сулейман Керимов, а также основатель «Лаборатории Касперского» Евгений Касперский, Петр Авен и Владимир Потанин.В списке также Аркадий и Борис Ротенберги, Геннадий Тимченко и Олег Тиньков.
Список был составлен на основе Закона о противодействии противникам Америки посредством санкций от 2017 года (CAATSA).
Минфин объявил, что это не санкционный список. Никаких ограничений в отношении указанных лиц не налагается. Внесение этих лиц в список не создает препятствий для деловых контактов с гражданами США при условии, что они не подпадают под санкции.
Позиция России
Официальный представитель Кремля Дмитрий Песков заявил в понедельник, что «Кремлевский доклад» США был попыткой вбить клин между президентом России Владимиром Путиным и российской деловой элитой и повлиять на мартовские президентские выборы.
В понедельник администрация президента США должна была ввести новый пакет санкций против России, но позже Госдепартамент заявил, что Закон о противодействии противникам Америки посредством санкций (CAATSA) работает и «санкции в отношении конкретных юридических или физических лиц не потребуются. быть навязанным, потому что законодательство, по сути, служит сдерживающим фактором «. Он также отметил, что в случае введения новых ограничений они будут нацелены не на Москву, а на те иностранные организации, которые имеют деловые контакты с российскими оборонными предприятиями и спецслужбами.
Фехтование в мире
Последняя передача: 14.12.2019 12:05 | Мартин Шрайбер
Назад
№ 7 : Результаты проверены
Pi 7 | 09:00:00 |
Судья: HAZELWOOD Даниэль ГЕРОССИДЕРИС Эфстатиос
| 1 | (4) ЗАРНЕСКУ Тудор | D4 | V5 | (1) ERIKSSON Филип |
| 2 | (5) КОВАЦ Гергей | V5 | D3 | (2) КУБЛИЦКИЙ Михаил |
| 3 | (6) ГРЕКО Симоне | D2 | V5 | (3) БИРО Александр |
| 4 | (1) ERIKSSON Филип | V5 | D2 | (7) БЕЛОЗЕРОВ Михаил |
| 5 | (4) ЗАРНЕСКУ Тудор | V5 | D2 | (5) КОВАЦ Гергей |
| 6 | (3) БИРО Александр | V5 | D4 | (2) КУБЛИЦКИЙ Михаил |
| 7 | (7) БЕЛОЗЕРОВ Михаил | V5 | D4 | (6) ГРЕКО Симоне |
| 8 | (1) ERIKSSON Филип | V5 | D2 | (5) КОВАЦ Гергей |
| 9 | (3) БИРО Александр | D3 | V5 | (4) ЗАРНЕСКУ Тудор |
| 10 | (2) КУБЛИЦКИЙ Михаил | D4 | V5 | (6) ГРЕКО Симоне |
| 11 | (7) БЕЛОЗЕРОВ Михаил | V5 | D1 | (5) КОВАЦ Гергей |
| 12 | (1) ERIKSSON Филип | V5 | D4 | (3) БИРО Александр |
| 13 | (6) ГРЕКО Симоне | D0 | V5 | (4) ЗАРНЕСКУ Тудор |
| 14 | (2) КУБЛИЦКИЙ Михаил | D3 | V5 | (7) БЕЛОЗЕРОВ Михаил |
| 15 | (5) КОВАЦ Гергей | D2 | V5 | (3) БИРО Александр |
| 16 | (6) ГРЕКО Симоне | V5 | D4 | (1) ERIKSSON Филип |
| 17 | (4) ЗАРНЕСКУ Тудор | D3 | V5 | (2) КУБЛИЦКИЙ Михаил |
| 18 | (3) БИРО Александр | D3 | V5 | (7) БЕЛОЗЕРОВ Михаил |
| 19 | (5) КОВАЦ Гергей | D4 | V5 | (6) ГРЕКО Симоне |
| 20 | (2) КУБЛИЦКИЙ Михаил | V5 | D4 | (1) ERIKSSON Филип |
| 21 | (7) БЕЛОЗЕРОВ Михаил | D2 | V5 | (4) ЗАРНЕСКУ Тудор |
Моделирование бассейнов и нефтегазовых систем в зоне сочленения Александровской и Средневасюганской антиклиналей и Усть-Тымской впадины, юго-восточная часть Западно-Сибирской углеводородной провинции (Россия)
Аль-Хаджери М.М., Аль-Саид М., Деркс Дж., Fuchs T, Hantschel T, Kauerauf A, Neumaier M, Schenk O, Swientek O, Tessen N, Welte D, Wygrala B, Kornpihl D, Peters K (2009) Моделирование бассейнов и нефтяных систем.Oilfield Rev 21 (2): 14–29
Google Scholar
Alipour M, Alizadeh B, Chehrazi A, Mirzaie S (2019) Объединение биодеградации в двухмерных моделях нефтяных систем: применение к меловой нефтяной системе южной части бассейна Персидского залива. J Pet Explor Prod Technol 9 (4): 2477–2486. https://doi.org/10.1007/s13202-019-0716-8
Статья Google Scholar
Архипов С.А., Бабушкин А.Е., Волкова В.С., Гуськов С.А., Кузьмина О.Б., Кулькова И.А., Лувчук Л.К., Михайлова И.В., Сухорукова С.С. (2002) Стратиграфия нефтегазовых бассейнов Сибири.Кайнозой Западной Сибири СО РАН, ГЕО, Новосибирск
Google Scholar
Бахарев Н.К., Белова Е.В., Дубатолов В.Н., Элькин Е.А., Изох Н.Г., Клец А.Г., Конторович А.Е., Краснов В.И., Перегоедов Л.Г., Сенников Н.В., Тимохина И.Г., Хромых В.Г. (2001) Стратиграфия нефтегазовых бассейнов Сибири . Палеозой Западной Сибири СО РАН, ГЕО, Новосибирск
Google Scholar
Баур Ф., Ди Примио Р., Лампе С., Литтке Р. (2011) Расчеты баланса массы для различных моделей миграции углеводородов в бассейне Жанны д’Арк на шельфе Ньюфаундленда.J Pet Geol 34 (2): 181–198
Статья Google Scholar
Богородская Л.И., Конторович А.Е., Ларичев А.И. (2005) Кероген: методы исследования, геохимическая интерпретация. Сибирское отделение Российской академии наук, ГЕО, Новосибирск
Google Scholar
Burnham AK (2017) Глобальная химическая кинетика ископаемого топлива. Springer, Берлин
Забронировать Google Scholar
Даненберг Е.Е., Белозеров В.Б., Брылина Н.А. (2006) Геологическое строение и нефтегазоносность верхнеюрских и нижнемеловых отложений юго-востока Западно-Сибирской плиты (Томская область).Томск, Россия
Дучков А.Д., Соколова Л.С., Аюнов Д.Е. (2013) Электронный геотермальный атлас Сибири и Дальнего Востока. Недропользование. Добыча. Новые направления и технологии поиска, разведки и разработки месторождений полезных ископаемых. Геоэкология 3: 153–157
Google Scholar
Фомин А.Н. (2011) Катагенез органического вещества и нефтегазоносность мезозойских и палеозойских отложений Западно-Сибирского мегабассейна.Сибирское отделение Российской академии наук, ГЕО, Новосибирск
Google Scholar
Гайдебурова Е.А., Девятов В.П., Дзюба О.С., Ильина В.И., Казаков А.М., Меледина С.В., Могучева Н.К., Никитенко Б.Л., Шурыгин Б.Н. (2000) Стратиграфия нефтегазовых бассейнов Сибири. Юрская система СО РАН, ГЕО, Новосибирск
Google Scholar
Гурари Ф.Г., Девятов В.П., Демин В.И., Еханин А.Е., Казаков А.М., Касаткина Г.В., Курушин Н.И., Могучева Н.К., Сапяник В.В., Серебренникова О.В., Смирнов Л.В., Смирнова Л.Г., Сурков В.С., Сысолова О.Г., 2005 ) Геологическое строение и нефтегазоносность нижне- и среднеюрских отложений Западно-Сибирской углеводородной провинции.НАУКА, Новосибирск
Google Scholar
Hakimi MH, Abdullah WH, Shalaby MR (2010) Характеристика материнской породы и потенциал нефтедобычи юрской формации Мадби, прибрежные нефтяные месторождения Восточная Шабова, Республика Йемен. Organ Geochem 41 (5): 513–521
Статья Google Scholar
Hantschel T, Kauerauf AI (2009) Основы моделирования бассейновых и нефтяных систем.Springer, Гейдельберг
Google Scholar
Хигли Д., Леван М., Робертс Л., Генри М. (2006) Возможности моделирования нефтяных систем для использования при оценке ресурсов нефти и газа. U.S. Geol Surv. https://doi.org/10.3133/ofr20061024
Статья Google Scholar
Керимов В.Ю., Хантчель Т., Соколов К., Сидорова М.С. (2011) Внедрение технологий бассейнового моделирования — программного пакета PetroMod в учебный процесс РГУ нефти и газа им.М. Губкин. Автобус для нефти и газа 4: 38–47
Google Scholar
Конторович В.А. (2002) Тектоника и нефтегазоносность мезозойско-кайнозойских отложений юго-востока Западно-Сибирского осадочного бассейна. Сибирское отделение Российской академии наук, ГЕО, Новосибирск
Google Scholar
Конторович А.Е. (2004) Аналитический обзор по теории нафтидогенеза.Сибирское отделение Российской академии наук, ГЕО, Новосибирск
Google Scholar
Конторович А.Е., Нестеров И.И., Салманов Ф.К., Сурков В.С., Трофимук А.А., Эрви Ю.Г. (1975) Геология нефти и газа Западно-Сибирского осадочного бассейна. НЕДРА, Москва
Google Scholar
Конторович А.Е., Конторович В.А., Рыжкова С.В., Шурыгин Б.Н., Вакуленко Л.Г., Гайдебурова Е.А., Данилова В.П., Казаненков В.А., Ким Н.С., Костырева Е.А., Москвин В.И., Ян П.А. (2013) Палеогеография юрских отложений Западно-Сибирского бассейна .Русс Геол Геофиз 54 (8): 972–1012
Google Scholar
Космачева А.Ю. (2016) Геологическое строение, история тектонического развития и нефтегазоносность Чкаловского месторождения по данным сейсморазведки 2D и 3D и глубокого бурения. В кн .: Материалы 54-й Международной студенческой научной конференции. геология, стр. 104
Костырева Е.А. (2005) Геохимия и генезис палеозойской нефти на юго-востоке Западно-Сибирского мегабассейна.Сибирское отделение Российской академии наук, ГЕО, Новосибирск
Google Scholar
Макин YM, Абдулла WH, Пирсон MJ, Hakimi MH, Ayinla HA, Elhassan OMA, Abas AM (2016a) История образования, миграции и накопления углеводородов в суббассейне Фула, бассейн Муглад, Судан: последствия Исследование 2D бассейнового моделирования. Мар Петр Геол 77: 931–941
Статья Google Scholar
Макин Ю.М., Абдулла У.Х., Пирсон М.Дж., Хакими М.Х., Эльхассан ОМА, Хадад Ю.Т. (2016b) История термической зрелости и моделирование образования нефти для нижнемеловой формации Абу-Габра в суббассейне Фула, бассейн Муглад, Судан.Mar Pet Geol 75: 310–324
Статья Google Scholar
Нефтегазинформ (2020) Чкаловское месторождение. Независимый нефтегазовый портал. https://oilgasinform.ru/science/fields/chkalovskoe/. По состоянию на 5 октября 2020 г.
Osli LN, Shalaby MR, Islam MA (2019) Моделирование генерации углеводородов и характеристика материнской породы формации Тарату мелового-палеоценового периода, Большой Южный бассейн, Новая Зеландия. J Pet Explor Prod Technol 9 (1): 125–139.https://doi.org/10.1007/s13202-018-0511-y
Статья Google Scholar
Паровинчак К.М., Ежова А.В. (2012) Особенности геологии, обоснование комплексного освоения нефтегазоконденсатных месторождений Томской области. Sci Tech Bull ОАО НК «Роснефть» 1: 14–17
Google Scholar
Schlumberger (2011) Моделирование нефтяных систем PetroMod. Schlumberger Information Solutions, Хьюстон
Google Scholar
Наш гид по ФК «Волга»
«Волга» устанавливает новый рекорд
«Зенит» и «Волга» практически идентичные позиции в Премьер-лиге после трех туров: у обеих команд по четыре очка (победа, ничья и поражение), и равное количество голов за и против.Первые минуты нового сезона «Волги» были необычными, они забили два гола за первые 3 минуты выездного матча с «Динамо», установив новый рекорд Премьер-лиги. При этом московским хозяевам удалось отыграться вничью — 2: 2. Затем «Волга» проиграла во втором круге дома «Локомотиву» 1: 2, но в прошлую субботу перегруппировалась и с таким же счетом на выезде выиграла у «Урала». Победа «Волги» в Екатеринбурге стала третьей в истории волжской команды победой в Премьер-лиге сзади.
Каряка все еще пинает
Главным героем матча с «Уралом» стал Андрей Каряка. 35-летний полузащитник (самый опытный волжский игрок) в начале второго тайма получил травму головы. Несмотря на то, что Каряка был окровавлен, он сменил майку, наложил повязку на голову и продолжал играть, как будто ничего не произошло. Каряка на 80-й минуте выиграл пенальти, который выполнил сам, и победа принесла своей команде. После матча главный тренер «Волги» Юрий Калитвинцев ответил на вопросы журналистов: «Как себя чувствует Каряка? Он смеется и хорошо проводит время.Он боец, и сегодня он доказал это еще раз — он покинул поле только после того, как выложился на полную ».
Абаев сбежал в Москву
Матч «Локомотив» — ЦСКА неожиданно повлиял на «Волгу». «Локомотив» надолго лишился стартового вратаря Гильерме из-за травмы и срочно купил нового вратаря. «Локомотив» решил заполучить «Волги» Илью Абаева. 31-летний москвич подписал новый контракт с «Волгой» в июне и стал первым вратарем команды после того, как Михаил Кержаков уехал из Волги в «Анжи».При этом Абаев не смог отказаться от предложения «Локомотива». «Для меня уехать из Волги было действительно неожиданно. Как «Волга» без меня будет против «Зенита»? Все будет хорошо!» — сказал Абаев, уходя. Либо 29-летний вратарь Михаил Комаров, либо 22-летний Артур Нигматуллин, оба приехавшие этим летом на Волгу, получат задачу остановить «Зенит» в субботу. Похоже, Нигматуллин — более вероятный кандидат на старт в субботу. Последние три матча юноша провел на скамейке запасных «Волги».
Сычев вернулся
Новая звезда Волги — Дмитрий Сычев. 29-летний нападающий, который в свое время был звездой «Локомотива», всю весну провел в аренде минского «Динамо». Сычев провел за белорусский клуб 15 матчей, забил три мяча (один в Кубке Беларуси и два в квалификации Лиги Европы). Сычев стал волжистом в середине июля (снова в аренде). Сычев дебютировал за «Волгу» на замену в матче с «Локомотивом», а затем стартовал с «Уралом». Впрочем, ничего экстраординарного для «Волги» форвард пока не сделал.
Бок Волги претерпел летнюю трансформацию
Борта Волги этим летом существенно изменились. Помимо уже упомянутых больших изменений в линии вратарей, команда потеряла следующих игроков стартового состава: защитников Александра Белозерова, Гию Григолаву, Дмитрия Аидова, Дмитрия Кудряшова, полузащитников Руслана Аджинджала и Александра Харитонова, нападающих Артура Саркисова, а также Александр Салугин. При этом в Нижний Новгород приехала целая группа новых игроков, многие из которых уже дебютировали на Волге, в том числе известные экс-динамовцы Денис Колодин и Марцин Ковальчик, бывшие звезды спартаковского нальчика Леандро и Роман Концедалов, Игрок сборной Ямайки Лутон Шелтон и конголезский нападающий Мулумба Мукенди, которые уже забили два гола в этом сезоне.