Цска фото новые: Фото — ЦСКАНЬЮС.ком

Цска

Содержание

Добавленное время работает на ЦСКА – Спорт – Коммерсантъ

В центральном матче 21-го тура чемпионата России по футболу ЦСКА переиграл «Локомотив» со счетом 2:1. Для армейцев эта победа стала уже пятой подряд, и с 39 очками они пока вышли на третье место. Вторую строчку с 42 баллами по-прежнему занимает «Динамо», которое разгромило «Арсенал» — 4:1.

На старте 21-го тура внимания заслуживало не только дерби «Локомотив»—ЦСКА, хотя оно, конечно, было гвоздем всей программы. Матч «Динамо» с «Арсеналом» тоже имел большое турнирное значение, и в нем, между прочим, присутствовала и внутренняя интрига, несмотря на то, что встречались вроде бы команды разного уровня. Да, динамовцы сейчас участвуют в борьбе за медали, тогда как их соперник решает гораздо более приземленные задачи, но в Туле они не побеждали аж с 2014 года, потерпев здесь с тех пор два поражения и дважды сыграв вничью. Так что этот выезд представлял для москвичей определенные трудности.

Вместе с тем они не могли позволить себе осечку.

Поражение от «Спартака» в предыдущем туре привело к тому, что «Зенит» упрочил свое лидерство и увеличил отрыв от «Динамо» до пяти очков, а «Сочи» и ЦСКА сократили свое отставание от него до двух и трех пунктов соответственно. Кроме того, в дерби с красно-белыми бело-голубые потеряли из-за дисквалификации защитника Гильермо Варелу и нападающего Вячеслава Грулева. Зато в строй вернулся центральный защитник Роман Евгеньев.

Матч в Туле по традиции складывался для динамовцев непросто. Впрочем, счет они открыли очень легко. Федор Смолов в одном из эпизодов задержался в чужой штрафной площади, когда игра уже вышла из нее, и это не заметил защитник хозяев Иван Новосельцев, который не глядя откинул мяч назад своему вратарю и невольно ассистировал нападающему «Динамо». Смолов спокойно обвел Антона Коченкова и поразил пустые ворота. Но туляки перехватили инициативу и ответили двумя точными ударами в исполнении братьев Кангва. И если Кингсу не повезло и его гол отменили, то Эванс забил по правилам.

И все-таки во втором тайме гости сломили сопротивление «Арсенала». Опять грубую ошибку допустил Новосельцев, который сделал результативную скидку на динамовца Арсена Захаряна. Полузащитник в касание загнал мяч в сетку, а потом еще заработал пенальти, реализованный Даниилом Фоминым. Ну а Константин Тюкавин добил уже деморализованных «оружейников». «Динамо» наконец-то победило в Туле, да еще крупно — 4:1. Набрав 42 очка, подопечные Сандро Шварца отстояли вторую позицию в турнирной таблице и будут ждать, чем завершится воскресный матч «Зенита» с «Крыльями Советов» в Самаре. Пускай и слабая надежда на то, что лидер оступится и чемпионская гонка обострится, есть.

Перед очередным дерби «Локомотива» и ЦСКА статистика была в пользу железнодорожников, которые одержали пять побед в пяти последних встречах с армейцами — четыре в чемпионате и одну в Кубке страны. Таким образом, красно-синие не обыгрывали красно-зеленых с 2019 года, а в гостях — и вовсе с мая 2015-го. Однако «Локомотив» регулярно брал верх над ЦСКА под руководством Марко Николича, которого по ходу нынешнего сезона поменяли на Маркуса Гисдоля, а недавно и того след простыл.

Команду принял бывший тренер-аналитик Марвин Комппер, а при нем она бесславно вылетела из Кубка России, влетев 0:4 клубу первого дивизиона «Енисею», и с трудом одолела аутсайдера чемпионата «Химки».

Было очевидно, что ЦСКА находится в лучшем актуальном состоянии. После зимней паузы армейцы выиграли три матча, причем нельзя не отметить вклад в эти успехи их новобранца Юсуфа Языджи. Турецкий полузащитник забил два победных мяча в премьер-лиге и отдал две голевые передачи в кубковой встрече с «Сочи». Да и остальные новички довольно органично вписались в коллектив, поэтому резонно, что все они опять попали в стартовый состав.

ЦСКА вновь использовал схему без номинальных нападающих с Языджи впереди, как говорится, на лихом коне. А главное, турок сразу показал, что он прежде всего опасен как исполнитель разнообразных «стандартов». У «Локомотива» на первых минутах заметно выделялся Джирано Керк, периодически терзавший на правом фланге своего визави Ивана Облякова. Активно искал моменты и новый центрфорвард железнодорожников Ян Кухта. Чех проверил бдительность Игоря Акинфеева после подачи углового, но чаще приходилось вступать в игру коллеге опытнейшего голкипера ЦСКА — Даниилу Худякову. Особенно досаждал 18-летнему вратарю «Локомотива» Хорхе Карраскаль. Именно колумбиец, владеющий широким диапазоном футбольных приемов, стал зачинщиком голевой атаки. Его пас вызвал переполох в обороне хозяев, Бактиер Зайнутдинов нанес первый удар, с которым справился Худяков, а Языджи подобрал отскок и дослал мяч в сетку.

Гости повели на 39-й минуте, однако не сумели удержать перевес до перерыва. Уже на 42-й минуте отличился Вилсон Изидор, который технично обработал прострел Дмитрия Живоглядова в штрафную и мощно пробил под Акинфеева. В принципе такой результат больше соответствовал содержанию матча, но ничья явно не устраивала команды, что они продемонстрировали во второй половине, когда на «РЖД Арене» пошел достаточно открытый футбол. «Локомотив» старался действовать в более резкой манере, без лишнего контроля мяча и едва не преуспел. Рифат Жемалетдинов убежал один на один с Акинфеевым и даже обыграл его. Многие, наверное, уже предвкушали гол, но полузащитник не довернул стопу после обводки и промахнулся по пустым воротам. Железнодорожники дружно схватились за голову — момент действительно был убойный и, как выяснилось, редкий.

Тому же ЦСКА долго не удавалось создать ничего серьезного. Разве что Языджи снова обострил со «стандарта», когда Жан-Филипп Гбамен чудом не замкнул его навес. Только в концовке армейцы все же расшатали защитные порядки «Локомотива». Вышедшие на замену Антон Заболотный и Чидера Эджуке упустили стопроцентные возможности для взятия ворот. В первом случае хозяев спас Худяков, а затем защитник Максим Ненахов. В итоге гости забили уже в добавленное время с углового, который, естественно, подавал Языджи. Бруно Фукс переправил мяч на дальнюю штангу, где Марио Фернандес со второй попытки загнал его в сетку. Отыгрываться железнодорожникам уже было некогда, и ЦСКА добыл пятую победу подряд в чемпионате — 2:1.

Кстати, «Нижний Новгород» в предыдущем туре красно-синие тоже дожали перед самым финальным свистком. Пока с 39 очками они вновь поднялись на третье место, но в воскресенье свой матч с «Химками» проведет «Сочи», в чьем активе 37 баллов.

Александр Ильин

Против госдолга, детей чиновников и ЦСКА: США ввели новые санкции против России

Минфин США в ночь на 23 февраля опубликовал списки санкций в ответ на признание Россией ДНР и ЛНР. Введение ранее анонсировал президент США Джо Байден.

•‎ США ужесточили действующие ограничения на сделки с российским госдолгом, говорится в сообщении Минфина. Согласно новым правилам, американским инвесторам запрещается покупать на вторичном рынке российские гособлигации, выпущенные после 1 марта 2022 года. Действующие с прошлого года санкции США уже запрещают покупать вновь выпущенные российские гособлигации на первичном рынке.

•‎ Блокирующие санкции введены против ВЭБ.РФ и опорного банка российской «оборонки» Промсвязьбанка, а также десятков подконтрольных им организаций. Среди них: лизинговая компания «ВЭБ-лизинг», футбольный клуб ЦСКА,  Российский экспортный центр, брокерская компания «ПСБ–Форекс» и другие. Блокирующие санкции означают, что имущество и доли в имуществе этих организаций должны быть заблокированы.

Реклама на Forbes

• ‎Минфин США также объявил о санкциях против «близких к Путину элит и их семей», чье имущество в США также подлежит заморозке. В этот список попали:

  • Денис Бортников — зампред правления ВТБ и сын директора ФСБ Александра Бортникова;
  • Владимир Кириенко — глава интернет-холдинга VK и сын первого замглавы администрации Кремля Сергея Кириенко;
  • Петр Фрадков — председатель Промсвязьбанка и сын бывшего директора Службы внешней разведки России Михаила Фрадкова.

Президент России Владимир Путин 21 февраля подписал указы о признании Донецкой и Луганской народных республик (ДНР и ЛНР) и соглашения о дружбе, сотрудничестве и взаимной помощи с ними. 22 февраля эти документы ратифицировал российский парламент. Совет Федерации также дал Путину согласие использовать российские вооруженные силы за рубежом в связи с ситуацией в Донбассе. 

Западные страны осудили эти действия и заявили о намерении «единым фронтом» ввести первую волну санкций. Великобритания ввела санкции против пяти российских банков, включая «Россию» и Промсвязьбанк, а также троих бизнесменов из списка Forbes: Геннадия Тимченко, Бориса Ротенберга, Игоря Ротенберга. Евросоюз объявил о санкциях против 351 депутата Госдумы, который поддержал признание ДНР и ЛНР, а также против 27 человек и организаций, которые причастны к нарушению суверенитета Украины. Президент США Джо Байден, комментируя американские санкции 22 февраля, заявил, что это только первый пакет и США намерены ужесточать ограничения в случае эскалации ситуации.

Отель ЦСКА 3*, Москва – цены гостиницы, отзывы, фото, номера, контакты

В какое время заезд и выезд в Отеле «ЦСКА»?

Заезд в Отель «ЦСКА» возможен после 14:00, а выезд необходимо осуществить до 12:00.

Сколько стоит проживание в Отеле «ЦСКА»?

Цены на проживание в Отеле «ЦСКА» будут зависеть от условий поиска: даты поездки, количество гостей, тарифы.

Чтобы увидеть цены, введите нужные даты.

Какие способы оплаты проживания предусмотрены в отеле?

Способы и сроки частичной или полной предоплаты зависят от условий выбранного тарифа. Отель «ЦСКА» принимает следующие варианты оплаты: Visa, Euro/Mastercard, Maestro, American Express.

Есть ли скидки на проживание в номерах «ЦСКА»?

Да, Отель «ЦСКА» предоставляет скидки и спецпредложения. Чтобы увидеть актуальные предложения, введите даты поездки.

Какой общий номерной фонд у Отеля «ЦСКА»?

В Отеле «ЦСКА» 60 номеров.

Как можно добраться до «ЦСКА» от ближайшего аэропорта и ж/д вокзала?


от ж/д вокзала: на автобусе № 456, 904, 905 или маршрутном такси № 456м или троллейбусе № 12, 70, 82 до улицы Серегина, затем 950 метров до отеля.
от от аэропорта: на электричке до Белорусского вокзала, затем на автобусе № 456, 904, 905 или маршрутном такси № 456м или троллейбусе № 12, 70, 82 до улицы Серегина, затем 950 метров до отеля.

Какие категории номеров есть в Отеле «ЦСКА»?

Для бронирования доступны следующие категории номеров:
Одноместный (Стандартный одноместный номер с душем)
Двухместный (Двухместный номер с 2 отдельными кроватями и душем)
Двухместный (Двухместный номер «Комфорт» с 1 кроватью)
Двухместный (Двухместный номер с 1 кроватью)
Семейный (Семейный номер)
Семейный (Улучшенный семейный номер)

Отель «ЦСКА» предоставляет услугу парковки?

Да, в Отеле «ЦСКА» предусмотрена услуга парковки вашего автомобиля. Пожалуйста, перед бронированием уточните возможную дополнительную оплату и условия стоянки.

Стадион ЦСКА будет 140-метровым в высоту. ФОТО :: Городская недвижимость :: РБК Недвижимость

Стали известны подробности проекта строительства нового стадиона ЦСКА в Москве. Как пишет «Комсомольская правда», новый стадион ЦСКА будет первым самоокупаемым спортсооруженим в столице: с гостиницей, офисами и огромной подземной парковкой.

Так, помимо трибун и футбольного поля, здесь появится огромная, 142 метра высотой (38 этажей), башня. В ней разместятся офисы. В углах трибун откроются еще три башни: одна восьмиэтажная и две по 11 этажей. Там тоже будут офисы, гостиница, помещения спортивного клуба ЦСКА и фирменный магазин, где станут продавать символику клуба. В проекте предусмотрена парковка, а также два яруса машино-мест в подтрибунных помещениях. Общее количество парковочных мест — 1,4 тыс.

Как ожидается, стадион достроят за 2,5-3 года. Но чемпионат мира по футболу здесь проводить не будут. Стадион отдадут лишь под тренировки команд-участниц.

Напомним, стадион ЦСКА на улице Песчаной, недалеко от метро «Сокол», открылся еще в 1961 году. К 2000 году он настолько обветшал, что его снесли. Новый начали было строить. Залили фундамент южной трибуны, успели соорудить монолитные конструкции двух подземных этажей юго-восточной трибуны и свайное поле под юго-западной трибуной. Но помешал кризис. Сейчас на Песчаной лишь котлован, бетон и куски арматуры. На днях, однако, работы возобновились, пишет «КП».

«Зенит» получит самый дорогой стадион в истории

БСА «Лужники» могут построить заново к ЧМ по футболу в 2018 году

При строительстве стадиона «Спартак» выявлено 89 нарушений

Поиграли с огнем: что стоит за инцидентом на матче ЦСКА–«Зенит» | Статьи

Болельщики ЦСКА напомнили о себе во время матча на стадионе «ВЭБ Арена»: после несанкционированного пиротехнического шоу фанатский сектор почти в полном составе оказался в территориальных отделах полиции. В подробностях и причинах массового задержания разбирались «Известия».

Зарево над стадионом

Матч Российской премьер-лиги (РПЛ) стал одним из самых обсуждаемых спортивных событий недели, но вовсе не из-за исхода встречи (выиграл «Зенит» со счетом 2:0). Во втором тайме сразу несколько десятков болельщиков команды ЦСКА зажгли на трибунах файеры. После завершения встречи фанаты были заблокированы в секторе — большинство из них были доставлены в территориальные органы полиции «для разбирательства и решения вопроса о привлечении к установленной законом ответственности».

Новость широко обсуждалась в СМИ в связи со значительным числом задержанных — сообщалось о нескольких сотнях человек, среди которых были и несовершеннолетние.

Администрация Российской премьер-лиги констатировала, что инцидент негативно повлиял «не только на имидж РПЛ, но и всего российского футбола в целом».

Болельщики ЦСКА на матче чемпионата России по футболу между командами ЦСКА и «Зенит»

Фото: ТАСС/Сергей Фадеичев

«Мы осуждаем тех, кто совершил эти противоправные действия, но в то же время считаем, что невиновные страдать не должны. Мы продолжим контактировать с правоохранительными органами, чтобы как можно быстрее разрешить сложившуюся ситуацию. Клуб также обеспечит бесплатную юридическую консультацию для наших болельщиков», — заявило руководство ЦСКА

По данным ГУ МВД России по Москве, в отношении нарушителей порядка был составлен 51 административный протокол, в том числе 25 по статье 20.31 КоАП РФ «Нарушение правил поведения зрителей при проведении официальных спортивных соревнований», из них 14 — за использование пиротехнических изделий; 23 — по статье 20.20 КоАП РФ «Потребление (распитие) алкогольной продукции в запрещенных местах либо потребление наркотических средств или психотропных веществ, новых потенциально опасных психоактивных веществ или одурманивающих веществ в общественных местах»; два — по статье 20.1 КоАП РФ «Мелкое хулиганство» и один — по статье 20.25 КоАП РФ «Уклонение от исполнения административного наказания».

Юридические риски

По ст. 20.31 КоАП в зависимости от части статьи грозит штраф, обязательные работы или административный арест до 15 суток, говорит Александр Малахов, адвокат МКА «Клишин и партнеры». Помимо этого, нарушителям могут запретить посещение мест проведения официальных спортивных соревнований на срок от шести месяцев.

Однако хулиганские выходки на стадионе могут повлечь и уголовную ответственность.

— Зачинщикам или особо активным участникам беспорядков может грозить ответственность по ч. 1 или 2 ст. 213 УК РФ («Хулиганство») — санкция до семи лет лишения свободы — либо (в зависимости от наличия доказательной базы) привлечение к ответственности по ст. 212 УК РФ «Организация массовых беспорядков, сопровождавшихся насилием, погромами, поджогами, уничтожением имущества…», санкция по которой — от восьми до 15 лет лишения свободы.

Дым от файеров во время матча чемпионата России по футболу между командами ЦСКА и «Зенит»

Фото: ТАСС/Сергей Фадеичев

Помимо этого, клуб также может быть наказан за поведение болельщиков в соответствии с регламентом Российского футбольного союза (РФС), говорит Малахов. Среди санкций — штраф, замечание, проведение матчей без зрителей, аннулирование итогов матча, присуждение поражения и другие. Конкретную санкцию будет определять контрольно-дисциплинарный комитет РФС.

Уже известно, что РФС рассмотрит инцидент на трибуне.

«На одну из трибун болельщиков домашней команды были пронесены десятки файеров, применение которых поставило под угрозу безопасность других зрителей. Организация обеспечения безопасности и факты использования пиротехники будут рассмотрены на ближайшем заседании КДК (Контрольно-дисциплинарного комитета. — «Известия»)», — говорится в сообщении организации.

Трибунный пикет

Источник в правоохранительных органах, курирующий работу с околофутбольной публикой, намекнул «Известиям», что подоплека субботней акции несколько шире, чем просто желание устроить шоу во время игры.

— Скорее всего, это своеобразная акция протеста против введения Fan ID (паспортов болельщика). И акция спланированная. И тот факт, что в нужное время не работала система видеофиксации (она вышла из строя во втором тайме), вряд ли совпадение. Не исключаем, что это диверсия, — сообщил источник.

Фото: ИЗВЕСТИЯ/Дмитрий Коротаев

Напомним, что в МВД официально заявили, что стадион, где проводилось мероприятие, не соответствовал требованиям безопасности. В частности, силовики указали, что не проводилась видеофиксация событий в секторе для активных фанатов.

По словам другого источника в правоохранительных органах, именно тот факт, что система видеофиксации оказалась выведена из строя, и стал одной из причин массового задержания.

— Если не проводится видеофиксация, приходится фиксировать вручную, — пояснил собеседник «Известий».

Мнение фанатского сообщества

Среди болельщиков распространено противоположное мнение, что акция была провокацией именно с целью продвижения введения паспортов болельщика. Однако из объяснений не совсем понятно, кому она могла бы понадобиться.

— Версий много — от интересантов проекта паспортизации болельщиков до старой администрации стадиона, — считает один из представителей фанатского сообщества. — Но это всё домыслы, во всяком случае пока. Факт в том, что несколько раз во время файер-шоу прошел заряд [речевка]: «Нам не нужен Fan ID», — все это слышали».

По его словам, те, кто зажег файеры, прекрасно знали, на что идут, и отдавали себе отчет в том, что полиции такое представление не понравится.

Фото: ИЗВЕСТИЯ/Дмитрий Коротаев

Часть фанатского сообщества настроена жестко против Fan ID. Эти люди считают, что излишняя подконтрольность может убить фанатский дух.

— У полиции уже сегодня нет никаких проблем с идентификацией людей на трибунах, когда речь идет о беспорядках, нарушениях или преступлениях. У всех, кто ходит на «фанатку», уже давно есть свой Fan ID — в профильном отделе полиции и у участкового по месту жительства.

Относительно возможности сохранения старых, не вполне легальных, но ярких традиций движения в фанатской среде настроения пессимистические.

— Лично я не против Fan ID, но нужно разрешить использование файеров. Разумеется, с соблюдением техники безопасности, на условиях собственников стадиона… Но отказываться от такого зрелища не стоит — это часть фанатской культуры, — говорит болельщик ФК «Спартак-Москва». — Если гайки окончательно закрутят, движение просто умрет. За границей к файерам относятся более лояльно — взять хотя бы Сербию. Посмотрите на фото, какая там красота на трибунах во время дерби «Црвена Звезда» – «Партизан».

Осколки былого величия

Еще одним импульсом к акции армейцев могло стать напоминание о некогда бурной фанатской жизни. В последние годы о движении почти не слышно.

Фото: ИЗВЕСТИЯ/Зураб Джавахадзе

— Еще 10–20 лет назад было больше драйва, больше противоправных действий со стороны фанатских группировок, — рассказывает источник в столичной полиции. — Сейчас этого практически нет. Есть небольшие группировки молодежи, но о них известно профильным подразделениям силовиков. Их поведение под контролем. Лидеры знают об этом и ведут себя тихо. Как и в давние времена, представители разных фирм меряются друг с другом силами, но только за городской чертой, — говорит источник в полиции. По его словам, групповые драки организуются в лесополосах, изредка в спортзалах. В них участвуют добровольно, без оружия. Условия оговариваются между противниками заранее.

«Почему мы вдруг должны стать ненавистны всему миру?» Станислав Ерёмин – об изоляции, легионерах и историческом шансе

Представили, что ждёт российский баскетбол и спорт.

После исключения сборной России из всех турниров, массового отъезда легионеров и отстранения, пускай и временного, клубов из Евролиги и Кубка Европы российский баскетбол изменился до неузнаваемости. Та модель, по которой он жил в последние тучные годы, разрушилась за считанные дни, а что ждёт нас в будущем остаётся загадкой.

Бывший главный тренер УНИКСа, а ныне советник президента клуба Станислав Ерёмин застал нечто подобное в 90-х, когда пала мощная система советского спорта, а на её месте ничего не появилось. Некогда всесильный ЦСКА Ерёмину пришлось выстраивать почти с нуля, не надеясь ни на топ-легионеров, которые тогда были недоступны нашим клубам, ни на сильнейших российских игроков, которые уезжали в другие чемпионаты за высокими зарплатами.

Тем не менее, Ерёмин в разговоре с «БИЗНЕС Online» не согласился, что в будущем нас ждут новые 90-е. «Такая страна, как Россия, не может всё время быть в изоляции», – уверен он. И всё же работать по-старому уже не выйдет. На чём нужно сконцентрироваться российскому баскетболу мы обсудили в этом интервью.

Станислав Ерёмин / фото: Alexander Chernykh, Russian Look, globallookpress.com

«У УНИКСА БЫЛ ТАКОЙ ШАНС!»

– Станислав Георгиевич, в последние дни весь российский спорт изменился до неузнаваемости – и баскетбол оказался в числе первых, кто попал под удар. Нас временно отстранили из всех еврокубков и пригрозили аннулировать результаты. Могли ли вы представить ещё две недели назад, что российским клубам с их богатой историей в еврокубках, по сути, укажут на дверь?

– Сложилась ситуация, которую никто не мог предсказать. У меня есть несколько друзей с разным социальным положением и разными взглядами на мир, и мы стали делиться прогнозами по будущему России. Я предложил записать их на бумагу, а потом проверить где-нибудь через полгода. Хорошо, что я ничего не записал, потому что все бы мы сильно ошиблись. 

Если говорить про баскетбол, сейчас самое главное, что чемпионат Единой Лиги ВТБ продолжается. Подождём решения Евролиги по дальнейшей судьбе российских клубов.

– Когда ситуация нормализуется, верите ли вы, что УНИКС, ЦСКА, «Зенит» и другие клубы вернут в Евролигу и Кубок Европы? Или для нас это законченная история?

– Хочется верить, что нас вернут. Всё-таки нельзя держать такую большую страну, как Россия, в бесконечной изоляции. Я понимаю Евролигу, которая находится территориально в Евросоюзе и оказалась в последние дни под большим политическим давлением. Но своим решением она сама же поставила под сомнение результаты этого сезона. Она исключила, пускай и временно, три команды, которые были в зоне плей-офф и могли претендовать на высокие места. Их искусственно убрали! Любая команда, которая станет чемпионом по итогу сезона, будет понимать, что выиграла трофей без конкуренции российских клубов. Так что, повторюсь, от этого решения пострадала сама Евролига, не говоря уже о наших клубах.

В особенности мне обидно, как несправедливо поступили с УНИКСом. Клуб уже признали главной сенсацией Евролиги, он запомнился победами над «Реалом», «Барселоной», ЦСКА, «Эфесом» и другими. Такой шанс был выступить удачно! Какая великолепная была проведена селекционная работа! Я лично видел, как Богдан Евгеньевич летом не вылезал из «Баскет-холла» и не спал ночами в поиске игроков. Как все иностранцы заиграли в команде! Джон Браун проводил свой лучший сезон, Хезонья проводил свой лучший сезон, многие другие… Такого шанса преуспеть в Евролиге у УНИКСа не было ещё ни разу в истории.

Фото: Сергей Елагин, БИЗНЕС Online

– В последние дни УНИКС и остальные клубы в России столкнулись с массовым оттоком легионеров. Казань в этом плане пострадала меньше остальных: остались четыре иностранных игрока и весь тренерский штаб. Тем не менее, потери есть. Вас удивило, как легионеры резко собрали вещи и покинули клубы?

– Это их право. Я понимаю, в какой тяжёлой ситуации они оказались. Мне тоже приходилось быть в нелёгких условиях. Мне вспоминается, как я работал в Сирии после завершения игровой карьеры. Это был мой опыт работы тренером. Я приехал в процветающую страну, а уезжал уже во время блокады. Военных действий не было, но была полная изоляция и полный дефицит. Мне даже продукты передавали из СССР через знакомых лётчиков. Тем не менее, я как советский человек отработал контракт до конца. А у нынешних иностранцев другая ментальность, её тоже нужно понимать и принимать. Это у нас есть желание войти в положение, понять и простить. А у них всё по-другому, это я ещё понял во времена работы тренером. У нас в УНИКСе играл белый американец, лет 15 назад. Мы всеми силами уговаривали его остаться в Казани и сыграть в матче, который перенесли на другую дату, но он всё равно уехал в тот же день, когда его контракт подошёл к концу. Эти люди привыкли жить по определённым правилам.

– Но сейчас легионеры сами же нарушают правила. Они покидают расположения клубов при действующих контрактах, отказываются от выплат компенсаций, ведут переговоры с другими. А у наших клубов не остаётся каких-либо рычагов давления: их вряд ли выслушают в ФИБА или спортивном арбитраже.

– Вопрос очень тонкий. На них наверняка оказывается давление от федераций, консульств, общественности, в конце концов, от родных и близких. В то же время никаких реальных предпосылок уезжать у них не было. У нас разве сезон завершён? Ладно, нас временно отстранили от Евролиги, но кто отменял Единую лигу ВТБ? Разве в стране введено военное положение или произошёл какой-то катаклизм? Так что я поддерживаю Евгения Борисовича в том, что к тем людям, которые покинули клуб самовольно и без каких-либо договоренностей, следует применить санкции. При этом я уверен, что УНИКС сохранит свою репутацию как одного из самых финансово надёжных клубов в европейском баскетболе. Те, кто останутся в Казани, получат все положенные деньги.

– Как вы думаете, почему те немногие легионеры, которые остались в России, всё-таки остались?

– Я уверен, что на тех, кто остался, всё равно оказывается давление. Просто, видимо, кто-то ещё помнит, что человек сам должен определять свою судьбу и своё отношение к любому событию. Невозможно всегда быть конформистом, невозможно сегодня идти в одну сторону, а завтра – в другую. Если человек решил для себя, что спорт выше политики, это надо уважать.

В этом плане мне нравится, как ведёт себя главный тренер УНИКСа Велимир Перасович. Сейчас всего мысли сосредоточены на спорте. Когда мы разговаривали в последний раз, он волновался, как проводить тренировки с одиннадцатью игроками: четыре иностранца и семь россиян. Он хочет выигрывать в Единой лиге ВТБ и настроен на победы.

Велимир Перасович / фото: Сергей Елагин, БИЗНЕС Online

«У НАС ИСТОРИЧЕСКИЙ ШАНС ПОДНЯТЬ БАСКЕТБОЛ»

– Наши клубы могут восстановить юридически, но вряд ли кто-то компенсирует репутационные потери. Сейчас складывается впечатление, что иностранцы вообще не хотят ассоциировать себя с Россией в любом виде – и даже большая зарплата не в состоянии перекрыть это. Мы вообще увидим легионеров в российских клубах?

– Увидим. Всё-таки для большинства спортсменов финансовая сторона стоит на первом месте. Могут высказываться и диктовать своё мнение только те, кто уже успел заработать сотни миллионов долларов, а таких мало. Рано или поздно ситуация нормализуется. В то же время нельзя исключать, что общее количество иностранцев станет меньше.

Сейчас хороший шанс для российских игроков показать себя. Теперь уже нельзя сказать, что тебе не давали шансов, не давали времени. Вот, пожалуйста, демонстрируй свой уровень. Конечно, общий уровень чемпионата с увеличением времени российских игроков упадёт – не надо строить иллюзий. Но этот момент может послужить точкой, когда наш баскетбол оторвется ото дна.

– Вы хорошо отметили, что российский баскетбол на дне, но оказался он там ни вчера, и не позавчера. Не кажется ли вам, что этот факт удавалось маскировать как раз успехами в еврокубках и приглашением звездных иностранцев? Такое чувство, что и все деньги в наш баскетбол приходили под этот элемент престижа, под возможность пошуметь за пределами страны.

– Большинство из тех, кто готов вкладывать свои средства в баскетбол, требуют побед если не сегодня, то завтра. Я видел это во многих регионах. Всем важен сиюминутный результат. Поэтому, несмотря на победы в целом, в российском баскетболе  была завышенная оценка и российских, и иностранных игроков. Надеюсь, мы обратим внимание на многих талантливых игроков, которые раньше не могли найти рабочие места в Единой лиге ВТБ. Есть миллион примеров, как мальчишка ярко проявляет себя на юношеском уровне, два — три года не находит себе возможности играть, а затем пропадает. Сейчас у нас есть исторический шанс поднять российский баскетбол.

ЦСКА в «Финале четырёх» Евролиги / фото: Marius Becker, dpa, globallookpress.com

– Один из резервов для Единой лиги ВТБ – суперлига. Там сейчас есть команды, которые могут усилить высший дивизион?

– Как мне кажется, три-четыре клуба можно запустить в чемпионат. Много амбиций в Самаре, Екатеринбурге, хороший проект в Москве у «МБА» и у «Руны». Столько лет эта суперлига проводилась без какой-либо цели: ты побеждаешь – и не можешь никуда выйти. Сейчас есть шанс это исправить.

– Стоит ли российскому баскетболу искать альтернативы Евролиге? Скажем, вступить в Адриатическую лигу – баскетбольном турнире с участием стран бывшей Югославии?

– Не могу сказать насчёт Адриатической лиги, но могу сказать, что участие в международных соревнованиях обогащает баскетбол любой страны. Так что к этому нужно стремиться.

– Готовы ли мы к этому штурму или будем цепляться за осколки старого мира? Тяжело представить, что сейчас все клубы резко поменяют свои приоритеты. Наверняка все застынут в надежде, что всё вернётся на круги своя…

– Нужно будет время, сейчас много непонятного. Где будут государственные программы, где будут льготы? Но после встряски, я уверен, баскетболу нужно будет меняться. Надо в первую очередь подумать над детским и юношеским спортом. Причём это должна быть государственная политика. Это вопрос не отдельных бизнесменов и не отдельных клубов – это вопрос государства.

– Раньше все говорили, что у баскетбольной пирамиды нет основания. Есть большие клубы с большими задачами, но нет детско-юношеского спорта. А теперь нет опасений, что не будет уже наконечника?

– Если есть крепкий фундамент, всегда можно достроить вершину. А если есть только вершина и нет никакого фундамента, это страшно и опасно.

– Насколько государству нужен баскетбол в новой реальности с особо выраженным антиамериканизмом? Игра-то ведь американская. Не лучше ли развивать наш русский хоккей?

– А разве хоккей придумали не в Канаде? Футбол не в Англии? Здесь можно только отметить, что мы недоработали информационно. У нашей молодёжи теперь идол – НБА. Я как-то подарил  магнитики с игроками ЦСКА молодым ребятам, которые тренировались у меня. Спрашиваю: «Знаешь кто это?» Отвечает: «Не знаю». А там был Нандо де Коло, который играл здесь пять лет! Всё, достаточно! Зато он наверняка знает Кобе Брайанта, Леброна Джеймса и Кевина Дюрэнта. Американцы молодцы, бизнес построили. Но я был в Америке 25 раз. Ни в одном штате не думают о Европе и тем более о России. Это как Антарктида. Нет ничего важнее, чем свой дом, своя улица, свой штат. А у нас? Мы живём здесь, а головами там. Много кто знает Виктора Хряпу? Много кто знает Сергея Моню? Это лучшие игроки нашей страны. Если бы они танцевали и матерились по телевизору, стали бы известными личностями. Получается, чем скромнее, тем хуже.

Сергей Моня / фото: Сергей Елагин, БИЗНЕС Online

«НЕ ВЕРЮ, ЧТО МЫ СКАТИМСЯ ДО 90-Х»

– Будет ли баскетбол ближайшего будущего похож на баскетбол 90-х?

– Нет. В 90-е ещё играли люди советской закалки. Нам не платили зарплату много месяцев, а мы всё равно играли, бились за клуб, сборную. Сейчас выросло новое поколение с другими ценностями. Когда мы сорвали все завесы, мы, пожалуй, взяли из-за рубежа всё худшее. А ведь могли взять многие положительные качества, например, чувство патриотизма По Газоля, который в 40 лет играл за сборную Испании…

Если же говорить в целом о баскетбольной системе, я не верю, что мы скатимся до 90-х. Не может быть такого, что в один момент ты занимался современным хозяйством и вдруг откатился на миллион лет назад и схватился за каменный топор.

– В 90-е лучшие российские игроки уезжали за границу. Теперь так будет?

– Для начала нужно, чтобы выросли игроки, интересные за границей. Не будем говорить про НБА, давайте поговорим хотя бы об Испании. Кого из наших игроков готовы взять в испанский чемпионат прямо сейчас?

– Швед, Антонов, Карасёв, Кулагины…

– А согласятся ли они на испанские зарплаты?

– Зависит от того, сколько российские игроки будут получать в России. Что вы думаете на этот счёт? Зарплаты вырастут ещё больше?

– Не думаю. Цена будет соответствовать качеству – и это не только про баскетбол, но и про футбол. Про футбол даже в первую очередь. В баскетболе высокие зарплаты хоть как-то подтверждены классом игроков. А что в футболе?

– То есть платить будут меньше. Значит, те, кто к привык к высоким зарплатам, будут уезжать?

– Привыкнут к маленьким…

– При худшем сценарии нас ждёт полная изоляция. Будет ли по нашему баскетболу скучать Европа? Будет ли условная «Барселона», когда выиграет Евролигу, плакать, что не поборолась с ЦСКА, УНИКСом и «Зенитом»?

– Нет, не будет. Ещё раз повторюсь: не верю, что изоляция затянется. Какой будет баскетбол без наших клубов? Какой будет хоккей без сборной России? Каким будет фигурное катание без наших спортсменок? Вообще, международным сообществом акценты были расставлены неправильно. В этих вопросах не должно быть коллективной ответственности. Можно быть несогласным с политикой, но при чём здесь баскетболисты? Почему такая большая страна, как Россия, должна вдруг стать ненавистной всему миру? Мне это непонятно.

0:4 не в пользу Никитина. ЦСКА выбил бывшего тренера из Кубка Гагарина | Хоккей | Спорт

В спорте нередко случается так – предвкушение того или иного зрелища оказывается куда ярче самого события. Так получилось и в первом раунде плей-офф Кубка Гагарина сезона-2021/22. Противостояние ЦСКА и ярославского «Локомотива» завершилось в минимальные сроки.

Город, влюбленный в хоккей

Хоккей в Ярославле обожают. Отношение к местному клубу здесь всегда было особенным, трепетным. В городе очень сильная хоккейная школа, поэтому в основной состав пробивается немало местных талантливых парней. Задачи перед «Локомотивом» всегда ставятся самые высокие, несмотря на то, что в последние годы «Локо» было трудно тягаться с такими монстрами, как «Ак Барс», «Авангард», магнитогорский «Металлург», СКА или ЦСКА.

В прошлом сезоне «Локомотив» под руководством Андрея Скабелки финишировал четвертым в Западной конференции, в первом раунде плей-офф попал на финский «Йокерит», который буквально разнес со счетом 4:0.

Во втором круге «Локомотив» Скабелки встречался с ЦСКА Игоря Никитина. Ярославль начал с победы в Москве, и затем ни в чем не уступал команде, считавшейся фаворитом Кубка Гагарина. В итоге серия прошла всю семиматчевую дистанцию, и армейцы лишь на самом финише смогли склонить чашу весов в свою пользу.

Перемена мест

Но вот парадокс – Скабелку сняли, заменив его на …Никитина, которого, в свою очередь, убрали из ЦСКА. Все это происходило в сентябре 2021 года, то есть фактически уже на старте нового сезона, уже после прохождения коллективами предсезонной подготовки. Оба решения смотрелись весьма странно – Никитину не простили проигрыш в финале Кубка Гагарина, посчитав его стиль слишком блеклым и чересчур оборонительным, а что касается Скабелки, то боссы «Локо», видимо, решили, что он уже достиг потолка своих возможностей.

Ко всему прочему, ЦСКА принял Сергей Федоров, титулованный хоккеист, однако не имеющий никакого опыта самостоятельной работы. Что, однако, не помешало ему затем оказаться в штабе сборной России по хоккею на Олимпиаде, где наши в финале уступили финнам.

Марафон завершает Соркин

Так или иначе, но странноватый хоккейный сезон уже в первом раунде плей-офф свел Никитина и Федорова, «Локомотив» и ЦСКА. И от экспертов железнодорожники получили массу комплиментов и благоприятных для них прогнозов. Считалось, что бывший тренер ЦСКА способен по атомам разобрать построения армейской команды, которые не слишком изменились, несмотря на то, что Федоров, принимая коллектив, обещал прививать атакующую игру.

Но в первых двух встречах красно-синие сумели справиться с железнодорожниками, хоть и не без труда. Первый матч в Ярославле получился изматывающим и для игроков, и для зрителей – армейцы вели в счете в концовке третьего периода, но Шалунов, в свое время ушедший из ЦСКА, точным броском перевел встречу в овертайм. Дополнительное время превратилось в борьбу на выживание – победный гол был забит лишь на 127-й минуте Максимом Соркиным. 21-летний армеец вообще стал героем серии – две победные шайбы в двух овертаймах.

После подобных марафонов трудно восстанавливаться, особенно тогда, когда ты их проигрываешь. У «Локо» же ситуация была вообще аховая – при 0:3 в серии больше права на ошибку не оставалось.

Надежды и реальность

Нужно заметить, что исход легионеров в связи с текущими политическими событиями не сильно пока влияет на хоккей – по крайней мере, ни москвичи, ни ярославцы потери бойцов не заметили. Более того, Никитин отправил в запас голкипера Эдди Паскуале просто потому, что в текущей серии он, что называется, не потащил. В отличие от своего визави Федотова, который играет так, будто и не было у него за плечами поражения в олимпийском финале.

Начался четвертый матч для хозяев хуже некуда – уже на первой минуте последовало удаление игрока «Локомотива», которое оперативно реализовал Каменев – 1:0 в пользу ЦСКА.

«Локо» встрепенулся, взвинтил темп, начал создавать опасные моменты, и на исходе 10-й минуты Коршков сравнял счет – 1:1. Добившись этого, хозяева, видимо, решили перевести дух, и напрасно – Окулов, ставший косвенным виновником ответной шайбы, оперативно реабилитировался, выведя на 13-й минуте на точный бросок Провольнева – 2:1 в пользу армейцев.

Для команды Никитина этот пропущенный гол стал фатальным. Поднять себя на новый штурм «Локомотив» не смог. Времени была масса, но для железнодорожников оно уходило впустую.

Последние надежды на 47-й минуте разметал армейский маэстро Григоренко, завершивший розыгрыш большинства точным броском в пустой угол ворот – 3:1. А спустя еще две с половиной минуты Карнаухов поставил точку – 4:1.

«Факт налицо»

Удивительное дело – последние восемь серий 1-го раунда плей-офф Кубка Гагарина ЦСКА неизменно заканчивает всухую. Нынешняя победа стала 32-й (!) подряд. И это при том, что безоговорочного доминирования коллектива Федорова не ожидал никто.

«За сегодняшнюю игру, конечно, неприятно перед болельщиками. Не смогли порадовать. Первые три игры проиграли в деталях, сегодня, конечно, по делу. ЦСКА с победой. Думаю, это заслуженно, — приводит слова Игоря Никитина официальный сайт ХК «Локомотив», — Итоги, наверное, подводить рано — нужно проанализировать, «остыть». Результат, конечно, неудовлетворительный, что здесь оправдываться. Факт налицо».

Безусловно, «сухое» поражение в 1-м раунде Кубка Гагарина – это определенно не то, на что рассчитывали клубные боссы, приглашая нового тренера. И относительно дальнейшей судьбы Никитина в Ярославле нет никакой уверенности.

«У нас получилось обыграть очень хорошего, организованного соперника, который не прощает ошибок. Очевидно, что мы смогли вырвать два первых матчах, и каждая из игр запомнилась кое-какими нервными моментами. Понятно, что в третьем матче обе команды бились до последнего. Получилось так, что наше большинство наконец-то сработало и забило важный гол. Наших ребят с победой, мы прошли определённый путь, он нам поможет в дальнейшем. Время немного отдохнуть, перегруппироваться и с новыми силами в бой», — заметил, в свою очередь, наставник ЦСКА.

Надо понимать, что чтобы не происходило вокруг, от ЦСКА ждут борьбы за главный трофей лиги. И победа над «Локо» здесь лишь первая ступень. Что касается дальнейшего, то, вероятнее всего, красно-синим предстоит борьба с победителем в паре «Динамо» — «Северсталь». И это должно быть очень непросто. Зато нескучно.

Ресурсы регистратора задач — Финансы и операции | Динамика 365

  • Статья
  • 33 минуты на чтение
  • 10 участников

Полезна ли эта страница?

да Нет

Любая дополнительная обратная связь?

Отзыв будет отправлен в Microsoft: при нажатии кнопки отправки ваш отзыв будет использован для улучшения продуктов и услуг Microsoft. Политика конфиденциальности.

Представлять на рассмотрение

В этой статье

Важно

Функциональность, указанная в этом разделе, в настоящее время доступна как в автономной инфраструктуре Dynamics 365 Human Resources, так и в объединенной инфраструктуре Finance. Пока мы делаем обновления, навигация может отличаться от указанной. Если вам нужно найти конкретную страницу, вы можете использовать Поиск.

В этом разделе описывается, как использовать средство записи задач для записи бизнес-процессов.

Обзор

Регистратор заданий

Регистратор задач для приложений Finance and Operations — это утилита, которая позволяет пользователям записывать бизнес-процессы для нескольких различных вариантов использования. Вот несколько примеров:

  • Пошаговые инструкции по конкретному бизнес-процессу в самом приложении
  • Документация бизнес-процесса в виде документа Microsoft Word, который может дополнительно включать скриншоты
  • Регрессионные тесты для бизнес-процесса
  • Автоматическое воспроизведение бизнес-процесса в приложении

Регистратор задач для приложений Finance and Operations может похвастаться высокой скоростью отклика, гибким расширяемым интерфейсом прикладного программирования (API) и полной интеграцией с потребителями записей бизнес-процессов. Регистратор задач также интегрирован с инструментом моделирования бизнес-процессов (BPM) в Microsoft Dynamics Lifecycle Services (LCS), так что пользователи могут продолжать упорядочивать свои записи. Однако пользователи больше не могут создавать диаграммы бизнес-процессов из записей.

Регистратор задач может автоматически генерировать регрессионные тесты приложений на основе записей бизнес-процессов и воспроизводить ранее записанные процессы. Эти функции также включают жесты для конкретных тестов, которые позволяют пользователям в полной мере использовать возможности регистратора задач.

Архитектура

Регистратор задач может записывать действия пользователя в клиенте с точной точностью, поскольку каждый элемент управления приспособлен для уведомления регистратора задач о выполнении действий пользователя. Элемент управления уведомляет регистратор задач о том, что произошло событие, и передает всю необходимую информацию о соответствующем действии пользователя в режиме реального времени. Из этой информации регистратор задач может фиксировать тип действия пользователя (например, нажатие кнопки, ввод значения или навигация) и любые данные, связанные с действием пользователя (например, значение и тип входных данных, контекст формы). или записать контекст).Регистратор задач сохраняет информацию с достаточной детализацией, чтобы гарантировать, что воспроизведение записи может выполнять записанные действия точно так же, как они были выполнены пользователем.

Базовая конфигурация

Средство записи задач включено в каждое приложение Finance and Operations и позволяет пользователям начать запись бизнес-процессов сразу после того, как они впервые откроют клиент.

Важно

Вкладка Руководства по задачам в настоящее время недоступна в Commerce или Human Resources.В настоящее время мы работаем над тем, чтобы включить эту функцию в будущем выпуске. Руководства по задачам в интерфейсе «Начало работы» в отделе кадров по-прежнему доступны для охвата основных функций. Процедурная помощь также доступна в документации приложения Finance and Operations для Commerce и Human Resources.

Начать новую запись

Следующие шаги показывают, как использовать средство записи задач для начала новой записи.

  1. Откройте продукт и войдите в систему. Рекомендуется обновлять браузер перед каждой новой записью.Обновление создает новый сеанс пользователя и перезапускает регистратор задач. Таким образом, он обеспечивает наиболее стабильную запись.

  2. Выберите компанию, которую вы хотите использовать во время записи. Если вы впервые используете средство записи задач, вы можете следовать инструкциям, поскольку в этом учебном пособии создается образец записи на основе бизнес-процесса управления автопарком. Вам нужно будет загрузить демонстрационные данные флота, чтобы следовать:

    1. Перейдите на панель инструментов > Управление автопарком > Настройка автопарка .
    2. Щелкните Загрузить демонстрационные данные .
    3. Когда данные будут загружены, нажмите Закрыть .
    4. Вернитесь к панели инструментов , щелкнув название продукта на панели навигации.
  3. Перейдите к Настройки > Регистратор задач .

  4. Открыта панель регистратора задач . Вы можете нажать кнопку Закрыть ( X ) в правом верхнем углу, чтобы закрыть панель Регистратора задач перед началом новой записи.Вы можете снова открыть панель, выполнив предыдущие шаги.

  5. Нажмите Создать запись .

  6. Введите имя записи и нажмите Пуск . Запись начинается в момент нажатия Start . Для примера флота в этом руководстве мы будем использовать имя «Создать новое резервирование аренды».

    Во время записи можно нажать кнопку Закрыть ( X ) в правом верхнем углу, чтобы скрыть панель Регистратора задач , не останавливая запись. Вы можете снова открыть панель, нажав кнопку Регистратор задач , которая появляется в верхней части страницы. Эта кнопка появляется только во время записи.

    Примечание

    Если функция Сохраненные представления включена, записи должны создаваться с использованием либо опубликованных представлений, либо стандартного представления, чтобы обеспечить надежную работу записей для пользователей.

  7. Регистратор задач входит в режим записи . На панели отображается информация и элементы управления, связанные с процессом записи.

Теперь вы готовы записать бизнес-процесс с помощью регистратора задач. Если вы используете это руководство как новый пользователь, вы можете в качестве примера выполнить следующий сценарий управления автопарком. В противном случае вы можете записать свой собственный сценарий применения.

Запись сценария управления автопарком

  1. На панели Регистратора задач щелкните Запустить подзадачу .
  2. Установите Имя на «Создать нового клиента по аренде». Оставьте поле Комментарий пустым.
  3. Нажмите OK . Задача будет добавлена ​​в список шагов.
  4. Перейдите на панель инструментов > Управление автопарком > Управление резервированием .
  5. Перейдите к Все клиенты на вкладке Сводка .
  6. В области действий щелкните New .
  7. Введите имя и фамилию клиента.
  8. Нажмите Сохранить .
  9. На панели Регистратора задач щелкните Завершить подзадачу .
  10. Вернитесь в рабочее пространство Reservation Management , дважды нажав кнопку «Назад» в браузере.
  11. На панели регистратора задач щелкните Запустить подзадачу . Назовите задачу «Аренда автомобиля новому клиенту». Нажмите OK .
  12. Нажмите ( + ) Прокат под Сводка .
  13. В разделе Information выберите «1975 Litware McKinley» в качестве транспортного средства.
  14. В разделе Информация установите только что созданного клиента.
  15. Разверните раздел Скидки .
  16. Нажмите Добавить под Скидки и добавьте скидку для постоянных клиентов. Нажмите OK .
  17. В области действий нажмите Начать аренду .
  18. Установите дату возвращения на какую-то дату в будущем.
  19. Нажмите OK .
  20. На панели Регистратора задач щелкните Завершить подзадачу .
  21. Нажмите Stop в самом верху страницы.

Запись бизнес-процесса

После того, как вы начали запись, вы можете выполнять свой бизнес-процесс так же, как обычно, используя веб-клиент. По мере взаимодействия с продуктом в список шагов на панели регистратора задач добавляются новые шаги. В этом разделе вы узнаете о других действиях, которые вы можете выполнять во время записи бизнес-процесса, чтобы в полной мере воспользоваться возможностями регистратора задач.

Стоп

Стоп используется для завершения сеанса записи.Прежде чем нажимать Stop , следует убедиться, что запись завершена, так как это действие необратимо. Когда вы нажимаете Stop , вы попадаете на экран параметров загрузки.

Начало/Конец подзадачи

Подзадача Start/End позволяет пользователю указать начало и конец набора сгруппированных шагов в записи. Нажмите кнопку Начать подзадачу , чтобы добавить шаг «Подзадача» в конец текущего списка записанных шагов.Подзадача будет включать в себя все шаги, которые вы выполняете с этого момента, пока вы не нажмете кнопку Завершить подзадачу . При нажатии кнопки Завершить подзадачу шаг «Завершить подзадачу» также добавляется в список записанных шагов.

Примечание

Перед выполнением/записью шагов, которые вы хотите включить в задачу, необходимо запустить подзадачу. Затем, после того как вы выполнили/записали все шаги, которые хотите включить в задачу, вы должны завершить подзадачу.

Подзадачи — это чисто организационный инструмент, и потребители записей бизнес-процессов могут интерпретировать группы задач полезным образом.Поскольку задачи могут быть вложены в другие задачи, они обеспечивают гибкость для организации очень длинных и сложных бизнес-процессов.

Удалить/Восстановить шаг

Удалить/Восстановить шаг позволяет пользователю удалить шаги из записи или отменить удаление шага из записи. Сначала необходимо выбрать шаг в списке Шаги, который вы хотите удалить/восстановить, а затем нажать кнопку Удалить/Восстановить шаг .

Примечание

Поведение кнопки Удалить изменяется при воспроизведении записи. В режиме воспроизведения удаленный шаг не может быть восстановлен после того, как воспроизведение прошло точку, в которой он должен был запустить удаленный шаг. Например, вы загружаете запись, содержащую три шага, а затем удаляете шаг 2 перед началом воспроизведения. Вы можете восстановить шаг 2 только до тех пор, пока воспроизведение не запустит шаг 3. После того, как вы начнете воспроизведение, а воспроизведение «пропустит» шаг 2 (потому что вы его удалили) и запустите шаг 3, вы не сможете восстановить шаг 2. Поскольку шаг 2 не выполнялся и, следовательно, не был записан, он не может быть задним числом добавлен обратно в запись на прежнее место.

Добавить заполнитель разработчика

Добавить заполнитель разработчика позволяет пользователю добавить шаг-заполнитель в список записанных шагов. Этот шаг-заполнитель не отображается при просмотре руководства по задачам и не выполняется во время обслуживания записи. Он используется только средством автоматизации комплекта регрессии (RSAT) или генератором кода X++, который позволяет создавать тест X++ из записи задачи. Когда генератор кода создает тест X++, он автоматически добавляет заглушку метода в сгенерированный код.Затем разработчик может добавить код X++ в эту заглушку метода. Автоматизированный код вызовет проверку, когда сгенерированный тест будет запущен в той точке записи, где был добавлен этот заполнитель.

Обогащение шагов в записи

Существуют различные варианты обогащения шага в записи. Например, вы можете настроить текст, связанный с шагом, и добавить информацию о конкретном шаге. В этом разделе описываются доступные возможности пошагового обогащения.Чтобы получить доступ к этим параметрам, нажмите кнопку Изменить шаг на определенном этапе записи.

Пошаговая инструкция

Инструкция шага — это основной текст, отображаемый для этого шага в руководстве по задачам. Обычно есть 2-3 альтернативных варианта пошаговых инструкций, и они появляются в следующем порядке при редактировании аннотации.

На этом изображении показаны параметры аннотации для изменения шага.

  • Инструкция по предпочтительному значению Этот тип инструкции предлагает пользователю ввести те же данные, которые использовались при записи шага. Пример : В поле Имя введите «Джон».

  • Пример метки значения Этот тип инструкции предлагает пользователю ввести свои собственные данные, показывая, что данные, которые использовались при записи шага, были только данными Пример . Пример : В поле Имя введите значение.

    Если пользователи нажимают кнопку Подробнее на этом шаге при воспроизведении записи в качестве руководства по выполнению задач, они смогут увидеть данные, которые использовались при записи шага.Это записанное значение данных будет помечено как значение данных Пример .

    Примечание

    Шаги, не связанные с полями, такие как нажатие кнопок, открытие форм или выбор записей из поиска, не устанавливают Пример метки значения в качестве параметра при аннотировании.

  • Пользовательская метка значения Эта пошаговая инструкция содержит замещающий текст, который автор может заполнить собственным текстом. Для шагов с параметром Пример метки значения заполнитель позволяет заменить текст, который обычно определяет данные для ввода.Это полезно для сценариев, в которых ни метка предпочтительного значения , ни метка значения примера не выражают в достаточной мере данные, которые следует использовать для этого шага.

    • Пример метки : В поле Имя введите {ваш пример текста} .
    • Пример этикетки после ввода замещающего текста : В поле Имя введите имя клиента.

    Для шагов, которые не имеют параметра Метка значения примера , заполнитель позволяет заменить весь текст метки.Шаги, связанные, например, с кнопками, не имеют Пример меток значений , поэтому вы можете заменить весь текст метки своим собственным текстом.

    • Пример этикетки перед заменой : Нажмите Опубликовать.
    • Пример этикетки после замены : Чтобы опубликовать заказ, нажмите Опубликовать.

Заголовки и примечания

Заголовки и примечания предоставляют места для указанного пользователем текста, который будет связан с шагом в руководстве по задачам.

  • Заголовок — Заголовок позволяет указать текст, который отображается над пошаговой инструкцией для этого шага в руководстве по задаче.Заголовок — хорошее место для размещения текста, который вы хотите, чтобы пользователи прочитали, прежде чем они выполнят действие, указанное в пошаговой инструкции.
  • Примечание . Вы можете использовать примечание, чтобы указать текст, который появляется в расширяемом разделе всплывающего окна для этого шага в руководстве по задаче. Заметка — это хорошее место для размещения дополнительных материалов для чтения или другой информации, которая может быть полезна пользователям, но которую они не обязаны читать для выполнения действия, указанного в пошаговой инструкции.

Изменение записанных значений

Начиная с версии 10.0.12, вы можете настроить значения, записанные в основных элементах управления вводом (например, простой текст, числовые поля, поля даты и раскрывающегося списка), без необходимости повторной записи этих шагов. Обратите внимание, что элементы управления поиском и ссылочные группы в настоящее время не поддерживаются.

Скрыть из руководства по задачам

Параметр Скрыть этот шаг позволяет автору запретить отображение определенных шагов в руководстве по задачам. Этот параметр полезен для скрытия шагов, которые необходимы для запуска записи задачи в режиме воспроизведения, но которые не должны быть видны пользователям.Примеры этих шагов включают шаги копирования, шаги, созданные системой, и шаги очистки данных. Если вы скроете подзадачу, все шаги, записанные внутри этой подзадачи, также будут скрыты.

Использование жестов управления

Базовая возможность записи позволяет пользователю записывать сквозной бизнес-процесс с помощью средства записи задач, но без дополнительных затрат на процесс. В некоторых случаях можно использовать более продвинутые функции записи, чтобы создавать еще более подробные записи бизнес-процессов.Каждый из следующих жестов находится под опцией регистратора задач в контекстном меню (также известном как контекстное меню или контекстное меню) для элемента управления и вызывает добавление шага к записи. Если жест не поддерживается элементом управления, он не будет отображаться в контекстном меню этого элемента управления.

Копия

Жест Копировать позволяет скопировать значение текущего элемента управления в «буфер обмена» регистратора задач. Затем это значение можно использовать позже как часть жеста Вставить или Подтвердить .Поскольку может потребоваться вставка значений из нескольких элементов управления, в буфере обмена регистратора задач хранится список всех значений элементов управления, которые были скопированы в записи.

Паста

Жест Вставить позволяет вставить значение из предыдущего жеста Копировать в ту же запись. Функция вставки регистратора задач работает так же, как и стандартная функция вставки, с которой пользователи могут быть знакомы, но она имеет дополнительное преимущество при использовании во время записи. Поскольку регистратор задач будет воспроизводить записанные команды Копировать и Вставить во время воспроизведения, если скопированный элемент управления имеет значение, отличное от того, которое было во время записи, регистратор задач вставит текущее значение вместо значения, которое было у скопированного элемента управления во время записи. .Эта функция полезна в сценариях, где скопированный элемент управления имеет значение, которое может меняться в разных средах (например, значения recID или числовые последовательности).

Существует дополнительное преимущество использования жестов Копировать и Вставить при создании тестового кода. Для любого элемента управления, значение которого задается с помощью команды Вставить , регистратору задач не нужно создавать параметризованную входную переменную для значения этого элемента управления, поскольку оно задается на основе значения другого элемента управления. Эта функция может быть очень полезна в сценариях, когда создается объект, такой как клиент, и во время записи часто вводится идентификатор этого объекта. Вместо того, чтобы вручную повторно вводить имя или идентификатор клиента на протяжении всего сценария и заставлять регистратор задач создавать параметризованную входную переменную для каждой записи, пользователь может один раз скопировать имя или идентификатор клиента, а затем несколько раз вставить их. В этом случае регистратор задач создаст одну параметризованную входную переменную для представления имени или идентификатора клиента.Эта функция может значительно упростить изменение входных данных для сгенерированного теста.

Подтвердить

Жест Подтвердить позволяет вставить шаг, который проверяет значение целевого элемента управления. Этот жест всегда использует равенство для проверки значения элемента управления. Проверка в настоящее время не выполняется во время воспроизведения записи. Вместо этого они запускаются только при запуске сгенерированного тестового кода. Доступны два вида проверки:

  • Проверка текущего значения зафиксирует значение целевого элемента управления во время записи и использует его для создания утверждения в тестовом коде.В списке параметров проверки в контекстном меню Текущее значение всегда стоит первым.
  • Проверка эталонного значения будет использовать значение ранее скопированного элемента управления при создании утверждения в тестовом коде. Это позволяет создавать утверждения, устойчивые к изменениям данных, поскольку значение не жестко закодировано в тестовом коде. В списке параметров проверки в контекстном меню Проверка контрольного значения следует формату [Имя AOT скопированного элемента управления: текущее скопированное значение].

Дополнительные параметры доступны в версии 10.0.13 и выше. Вот несколько примеров:

  • Включено / Выключено проверяет, что состояние целевого элемента управления включено (или отключено), а затем использует этот шаг проверки для создания утверждения в тестовом коде.
  • Только для чтения / Редактируемый проверяет, что состояние целевого элемента управления доступно только для чтения (или доступно для редактирования), а затем использует этот этап проверки для создания утверждения в тестовом коде.

Добавить информацию шаг

Жест Добавить информацию о шаге позволяет вставить шаг и указать для него собственный текст. Эта функция полезна в первую очередь для создания руководств по задачам. Информационный шаг (или информационный шаг для краткости) представляет собой шаг руководства по задаче, где текст инструкции для шага задается пользователем. Информационные шаги полезны для описания действий, которые являются частью сценария, но должны выполняться вне клиента. Например, сценарий может потребовать от пользователя поиска инвентарных запасов или проверки информации по электронной почте.

Вы можете указать, где в руководстве по задаче должен появиться информационный шаг. Информационный шаг может указывать на элемент управления на странице, если шаг связан с элементом управления. Кроме того, информационный шаг может отображаться в правом верхнем углу страницы, если этот шаг является внешним по отношению к клиенту или если это пояснение, применимое ко всей странице.

Примечание

Поскольку информационные шаги задаются вручную и не записываются регистратором задач автоматически, когда пользователь выполняет действие над элементом управления, информационный шаг не может выполняться автоматически, когда пользователь завершает шаг в руководстве по задачам.Поскольку информационный шаг не связан с выполнением действия в клиенте, руководство по задачам не может определить, что пользователь выполнил, чтобы автоматически перейти к следующему шагу.

Опции после завершения записи

После того, как вы нажмете Остановить , чтобы завершить сеанс записи, отобразятся несколько параметров, позволяющих сохранить файлы, связанные с завершенной записью. Выберите Сохранить на этот ПК и сохраните пакет записи задачи на рабочий стол.Вы будете использовать этот файл позже.

Сохранить на этот ПК

После того, как вы закончите запись, вы можете загрузить пакет записи задачи (файл .axtr) на свой компьютер. Этот файл можно загрузить позже с помощью панели регистратора задач , чтобы запись можно было воспроизвести в качестве руководства по выполнению задачи или отредактировать.

Сохранить в Lifecycle Services (LCS)

Когда вы сохраняете запись в библиотеку LCS, она публикуется в указанном бизнес-процессе в библиотеке BPM.Если выбранная библиотека LCS установлена ​​в качестве библиотеки справки, вы сможете найти руководство по выполнению задачи для записи, выполнив поиск в меню Справка .

Примечание

Чтобы иметь возможность сохранить запись в библиотеке LCS, пользователь должен находиться в клиенте Azure Active Directory (Azure AD), из которого была развернута среда.

Экспортировать как документ Word

Документ Microsoft Word для вашей записи содержит записанные шаги, а также все сделанные снимки экрана.

Сохранить как запись разработчика

Необработанный файл записи (запись разработчика) полезен для сценариев разработки, таких как создание тестового кода и сценариев, в которых используется RSAT.

Воспроизведение записи

Функция воспроизведения регистратора задач может автоматически запускать этапы существующей записи, используя страницы и значения, которые были изначально записаны. Режим воспроизведения можно использовать для обновления существующей записи, если в базовое приложение были внесены изменения, и эти изменения изменили этапы бизнес-процесса, необходимые для сценария.Важно помнить, что в этом режиме регистратор задач одновременно перезаписывает шаги и воспроизводит их. Когда воспроизведение завершено, создается новая запись, которая отражает как шаги, которые были выполнены из существующей записи, так и любые новые шаги, которые пользователь выполнил вручную. Любые шаги, которые не выполняются ни пользователем, ни автоматически регистратором задач, не включаются в эту новую запись.

Чтобы воспроизвести существующую запись, выполните следующие действия.

  1. Обновить вкладку браузера.

    Примечание

    Рекомендуется обновлять браузер перед каждой новой записью.

  2. Откройте панель регистратора задач .

  3. Нажмите Запись воспроизведения .

  4. Нажмите Открыть с этого ПК , чтобы загрузить запись из ранее загруженного пакета регистратора задач (файл .axtr).

    • Если вы читаете это руководство впервые и продолжаете следовать ему, выберите загруженный ранее файл «Создать новое бронирование аренды».
  5. Нажмите Пуск .

При воспроизведении записи на панели Записи задач доступны дополнительные действия.

Воспроизвести следующий отложенный шаг

Воспроизвести следующий отложенный шаг запускает следующий шаг в записи. Это действие полезно, потому что оно дает вам больший контроль над скоростью воспроизведения, когда вы хотите проанализировать эффекты одного шага. Это действие имеет побочный эффект, о котором важно знать.Когда вы нажимаете Воспроизвести следующий отложенный шаг , все открытые поисковые запросы, раскрывающиеся диалоговые окна или вкладки панели действий могут быть закрыты, поскольку это действие удаляет фокус с этих элементов. В этих ситуациях мы рекомендуем вместо этого использовать Воспроизвести все отложенные шаги .

Воспроизвести все отложенные шаги

Воспроизведение всех ожидающих шагов начинает последовательное выполнение оставшихся шагов в записи и продолжается до тех пор, пока воспроизведение не будет приостановлено или не будут выполнены все шаги.Во время воспроизведения кнопка Воспроизвести все отложенные шаги заменяется кнопкой Пауза , которую можно использовать для приостановки воспроизведения. Если воспроизведение не может успешно выполнить шаг по какой-либо причине (например, из-за того, что он не может найти кнопку, которая была переименована), средство записи задач пропустит этот шаг, и воспроизведение будет автоматически приостановлено. Таким образом, у пользователя есть возможность заменить устаревший шаг, выполнив новые шаги в клиенте. Регистратор задач запишет новые шаги и проигнорирует шаг, который был пропущен.Затем пользователь может щелкнуть Воспроизвести все отложенные шаги , чтобы продолжить воспроизведение оставшихся шагов. После завершения записи пользователь может загрузить обновленную запись. Эта запись будет содержать все шаги исходной записи, но будет исключать любые пропущенные шаги и включать любые новые шаги.

Воспроизведение до выбранного шага

Воспроизведение выбранного шага ведет себя как Воспроизведение всех ожидающих шагов , но позволяет воспроизвести только часть шагов вместо всех шагов. В списке выберите шаг, на котором вы хотите остановить воспроизведение, а затем нажмите Воспроизвести до выбранного шага . Регистратор задач начнет выполнять шаги в списке и остановится, когда выполнит выбранный вами шаг.

Редактирование записи

Хотя вы можете редактировать запись с помощью функции воспроизведения, существует также режим, позволяющий вносить простые изменения в запись без необходимости повторного воспроизведения всей записи. Чтобы получить доступ к этой функции, щелкните Редактировать запись после открытия области Регистратора задач .Вы можете использовать эту функцию для внесения следующих правок:

  • Вставка шагов в запись без перезаписи всего файла.
  • Переместить шаги подзадачи без перезаписи всего файла.
  • Настройте имя и описание записи.

Вставка шагов без перезаписи всего файла

Вы можете добавить шаг в любом месте записи задачи без воспроизведения или перезаписи всего файла.

  1. Выберите шаг, после которого вы хотите вставить новый шаг.Убедитесь, что шаг выделен.

    Чтобы регистратор задач мог вставить шаг, у вас должна быть открыта правильная страница. Правильная страница — это страница, на которой происходит новый шаг. Регистратор задач имеет механизм, который определяет активную страницу и отключает эту функцию, если нужная страница не открыта.

    Когда вы находитесь на правильной странице, становится доступным Шаг вставки .

  2. Нажмите Вставьте шаг .

    Когда вы нажимаете Вставить шаг , регистратор задач переключается в режим записи. Любое действие, которое выполняется в пользовательском интерфейсе (UI), теперь будет записано и вставлено в запись как шаги.

  3. Нажмите Стоп .

    Режим записи остановлен, теперь вы можете продолжить редактирование записи. Например, вы можете повторить этот процесс, чтобы вставить шаги в другие места записи, или вы можете переместить подзадачи, как описано в следующем разделе.

  4. Когда вы закончите редактирование записи задачи, нажмите Завершить редактирование , а затем выберите один из вариантов сохранения или публикации записи.

Перемещение шагов подзадачи без повторной записи всего файла

Вы можете перемещать шаги подзадачи без воспроизведения или перезаписи всего файла. Вы также можете переместить шаг подзадачи или шаг конечной подзадачи, если хотите сгруппировать существующий блок шагов.

  1. Выберите шаг или шаг подзадачи, который вы хотите переместить.Убедитесь, что шаг выделен.

  2. Нажмите Переместите шаг после . Чтобы получить доступ к этой команде, вам может потребоваться нажать кнопку с многоточием ( ).

  3. Выберите шаг или шаг подзадачи, после которого вы хотите переместить шаг или шаг подзадачи. Регистратор задач переместит шаг.

  4. Чтобы переместить конечный шаг подзадачи, выберите его, щелкните Переместить шаг после , а затем выберите шаг, после которого должен быть конечный шаг подзадачи.

    Если вы хотите, чтобы первый шаг в руководстве по задачам находился в подзадаче, создайте шаг подзадачи в качестве второго шага, а затем переместите в него первый шаг. Вы можете добавить или переместить столько шагов или подзадач, сколько необходимо.

  5. Когда вы закончите редактирование записи задачи, нажмите Завершить редактирование , а затем выберите один из вариантов сохранения или публикации записи.

Настройка имени и описания записи

Можно настроить значения полей Имя записи и Описание записи .Если вы хотите увидеть больше шагов на панели редактирования регистратора задач, вы также можете свернуть раздел, в котором отображается имя и описание записи.

Воспроизведение руководства по задачам

Руководство по задачам — это ориентированный на пользователя интерфейс, который позволяет пользователю следовать пошаговому набору инструкций для выполнения бизнес-сценария с использованием записи задачи. Пользователю предлагается выполнить каждый шаг с помощью анимированного всплывающего окна, которое будет перемещаться по странице и указывать на элемент пользовательского интерфейса, с которым должен взаимодействовать пользователь.Подсказка также сообщит пользователю, как взаимодействовать с элементом. Например, в нем может быть указано «Нажмите здесь» или «Введите данные в это поле». Каждый шаг, который предлагается выполнить пользователю, основан на шаге, изначально записанном в записи задачи. Поскольку файл записи задачи содержит данные, описывающие первоначально записанный шаг, руководство по задаче может автоматически определить, когда пользователь выполнил шаг, как ожидалось. Затем он автоматически переходит к следующему шагу.

Примечание

Один из способов, с помощью которого руководство по задачам определяет, что пользователь выполнил шаг, заключается в определении момента изменения значения в поле. Хотя руководство по задачам не требует, чтобы было установлено конкретное значение, оно требует, чтобы значение поля было изменено, чтобы определить, что шаг был выполнен. Пользователь должен изменить значение поля, а затем нажать клавишу Tab или щелкнуть в области за пределами элемента пользовательского интерфейса. Только в этот момент клиент обнаруживает, что значение поля изменилось, и затем может приступить к выполнению любой необходимой проверки приложения или бизнес-логики.Поэтому, прежде чем руководство по задачам сможет определить, что шаг был выполнен пользователем, оно полагается на то, что клиент обнаружит, что значение поля изменилось.

Что может позволить пользователю делать руководство по задачам?

Когда пользователь завершает руководство по задачам, клиент ведет себя так же, с теми же данными, безопасностью и правилами проверки, что и в случае, когда пользователь не выполняет руководство по задачам. В клиенте нет различий в поведении, которые позволили бы пользователю выполнить действие, которое он не мог бы предпринять иначе, если он не выполняет руководство по задачам.Когда пользователь выполняет руководство по задачам:

  • Любые данные, которые вводит пользователь, подчиняются тем же правилам проверки данных, что и в случае, когда руководство не воспроизводится.
  • Любые данные, которые вводит пользователь, могут быть сохранены, а пользователь может изменять данные в соответствии с теми же ограничениями и правилами, что и при не воспроизведении руководства по задачам.
  • Любые механизмы безопасности, с которыми сталкивается пользователь, ведут себя так же, как если бы пользователь не проигрывал руководство по задачам.
  • Любые формы или элементы управления доступом пользователя подчиняются тем же механизмам безопасности и доступа, что и когда пользователь не играет в руководство по задачам.

Функция «На ходу» в руководствах по задачам

По умолчанию, когда пользователь запускает руководство по задачам, он помещается на рельсы. Эти «рельсы» не позволяют пользователю щелкнуть на элементах, отличных от элемента, на который указывает руководство по задачам. Когда пользователь пытается щелкнуть что-то за пределами элемента пользовательского интерфейса, на который указывает руководство по задачам, всплывающее окно руководства по задачам будет анимировано, чтобы сообщить пользователю, что он не может двигаться дальше, пока не завершит текущий шаг руководства по задачам.

Хотя пользователю запрещено нажимать на других элементах, пользователю не запрещается перемещаться по другим элементам управления в форме, и пользователю не запрещается использовать сочетания клавиш. Это сделано специально, поскольку функция «на рельсах» предназначена и предназначена для начинающих пользователей, которые, как ожидается, будут в основном использовать мышь по мере знакомства с приложением.

Более продвинутые или опытные пользователи могут отключить функцию «на рельсах» при выполнении руководства по задачам.В любой момент во время руководства по задачам эти пользователи могут отключить рельсы, нажав кнопку Разблокировать , которая появляется на панели инструментов регистратора задач в верхней части страницы. Эту кнопку также можно использовать для восстановления рельсов в любой момент во время выполнения задания. В некоторых ситуациях руководство по задачам может автоматически отключать функцию «на рельсах». Когда рельсы отключены, пользователь может щелкать элементы пользовательского интерфейса так же, как если бы руководство по задачам не было запущено. Функция «на рельсах» может быть автоматически отключена в следующих ситуациях:

  • Пользователю предлагается перейти на страницу с помощью панели навигации или навигационного поиска.
    • Поскольку пользователь может использовать любую точку входа, руководство по задачам не указывает на конкретную точку входа и не запрещает пользователю использовать любую точку входа.
  • Руководство по задачам переходит в состояние ошибки (список состояний ошибки см. в следующем разделе).
  • В руководстве по задачам отображается информационный шаг.

Обнаружение ошибки

Состояние ошибки возникает, когда руководство по задачам не может указать на элемент пользовательского интерфейса, связанный с текущим шагом, поскольку этот элемент пользовательского интерфейса не отображается на экране.Когда руководство по задачам обнаружит, что текущий шаг требует от пользователя взаимодействия с невидимым элементом пользовательского интерфейса, всплывающее окно руководства по задачам переместится в верхнюю правую часть экрана. Эти причины состояния ошибки можно разделить на две категории.

Элемент управления не отображается в форме

Это состояние ошибки обычно возникает, когда пользователь открыл или закрыл неправильную вкладку, экспресс-вкладку, сворачиваемый раздел, информационную панель или всплывающее меню.

Поскольку элемент пользовательского интерфейса, необходимый для текущего шага, находится где-то в текущей форме, но не виден на экране, всплывающее окно руководства по задачам просто переместится в верхнюю правую часть экрана, отображая то же самое. инструкция, информирующая пользователя о действиях, которые ему необходимо предпринять.

Поскольку руководство по задачам не может найти элемент пользовательского интерфейса на экране, пользователь должен вручную определить причину скрытия элемента пользовательского интерфейса, а затем сделать этот элемент видимым на экране. Всплывающее окно руководства по задачам автоматически обнаружит, что элемент пользовательского интерфейса виден, и изменит свое положение так, чтобы оно указывало на видимый элемент.

Контроль отсутствует на форме

Это состояние ошибки обычно возникает, когда пользователь перешел к неправильной форме, перейдя к неправильной форме или оставив правильную форму.

Поскольку элемент пользовательского интерфейса не отображается на экране, всплывающее окно руководства по задачам переместится в верхнюю правую часть экрана. Кроме того, когда руководство по задачам обнаружит, что пользователь находится в неправильной форме, всплывающий текст руководства по задачам изменится, информируя пользователя о форме, к которой он должен перейти.

В некоторых случаях всплывающее окно руководства по задачам не будет упоминать имя формы. Это связано с тем, что пользователю может потребоваться перейти к динамической форме. Динамическая форма — это немоделируемая форма, которую часто называют формой, созданной во время выполнения.Такие формы не имеют собственного имени. Некоторые примеры форм, созданных во время выполнения, включают простые и настраиваемые поисковые запросы. Чтобы пользователь мог перейти к форме поиска, нужно повторно открыть форму поиска.

Следующий шаг и Предыдущий шаг

Кнопки Следующий шаг и Предыдущий шаг появляются во всплывающем окне руководства по задачам и позволяют пользователю вручную управлять потоком руководства по задачам. При нажатии этих кнопок руководство по задачам переходит к следующему или предыдущему шагу. Руководство по задачам не проверяет, выполнил ли пользователь шаг, прежде чем перейти к следующему или предыдущему шагу.

Руководство по задачам никогда автоматически не завершает любой шаг для пользователя, даже если используются кнопки Следующий шаг и Предыдущий шаг . Использование этих кнопок может вызвать состояние ошибки, если предыдущий или следующий шаг относится к элементу пользовательского интерфейса, которого нет на текущей странице. Когда пользователь завершает информационный шаг, единственный способ продолжить — использовать кнопку Следующий шаг . Это действие необходимо, поскольку информационный шаг не представляет собой действие, которое было записано для какого-либо элемента пользовательского интерфейса.Поскольку в записи задачи не было записано ни одного действия, в руководстве по задачам нет необходимой информации, чтобы определить, какое действие следует ожидать от пользователя.

Кнопка «Подробнее»

При нажатии кнопки Подробнее всплывающее окно руководства по задачам раскрывается, чтобы показать дополнительную информацию, связанную с шагом. Дополнительная информация часто представляет собой необязательный материал для чтения, который не требуется пользователю для успешного завершения шага. Может быть включена следующая информация:

  • Значение Пример
    • Пример значения — это значение, которое изначально использовалось при создании записи задачи.
    • Примеры значений отображаются только для шагов, в которых используются поля без поиска. Эти поля включают текстовые поля, числовые поля, поля даты, поля со списком и флажки.
  • А Примечание
    • Примечание может содержать информацию, относящуюся к конкретному сценарию, которая поможет предоставить пользователю информацию о текущем шаге руководства по задачам.

Создание снимков экрана в регистраторе задач

Используя расширение браузера Chromium предварительной версии , которое работает как с новым (на основе Chromium) браузером Microsoft Edge, так и с Google Chrome, средство записи задач может делать снимки экрана браузера, когда пользователь записывает бизнес-процесс.После того, как пользователь завершит запись, средство записи задач может использовать эти снимки экрана для создания документов Microsoft Word. Чтобы включить эту функцию, выполните следующие действия, чтобы установить предварительное расширение Chromium, которое позволяет средству записи задач делать снимки экрана во время записи.

  1. Загрузите папку FMLabTaskRecorderScreenshot , содержащую расширение, с GitHub по адресу https://github. com/Microsoft/FMLab.

  2. Только для локальных развертываний: Измените манифест расширения, чтобы он соответствовал следующему коду.Замените базовым URL-адресом для вашей среды.

      ...
    "контент_скрипты": [
        {
            "matches": ["https://*.dynamics.com/*", "<имя хоста>"],
            "js": ["screenshot.js"]
        }
        ...
      
  3. 21Только для развертываний Vianet: Настройте манифест расширения, чтобы он соответствовал следующему коду. Замените .com на .cn

      ...
    "контент_скрипты": [
        {
            "соответствует": ["https://*.динамика.сп/*"],
            "js": ["screenshot.js"]
        }
        ...
      
  4. Откройте последнюю версию браузера Microsoft Edge или Google Chrome.

  5. Выберите Настройки и другое > Расширения в Microsoft Edge (или Настройка и управление Google Chrome > Дополнительные инструменты > Расширения в Google Chrome).

  6. Выберите Режим разработчика .

  7. Нажмите Загрузить распакованное расширение .

  8. Перейдите к папке, содержащей расширение регистратора задач, используя путь FMLab-master > FMLab > TaskRecorderScreenshot , а затем выберите Select Folder .

  9. Убедитесь, что выбрано значение Включено , чтобы расширение было включено.

  10. Перезапустите браузер.

Регистратор задач теперь будет делать скриншоты вкладки, на которой запущен клиент. Эти скриншоты доступны в течение одной недели после воспроизведения записи.(Если вы используете более раннюю версию платформы, чем Обновление платформы 16, снимки экрана доступны только в течение 15 минут.) Если срок действия снимков экрана истек, вы можете восстановить их, воспроизведя запись задачи еще раз.

Обратите внимание, что средство записи задач не делает снимки экрана с других вкладок или рабочего стола пользователя.

Генерация тестов из записи

После завершения записи бизнес-процесса с помощью регистратора задач разработчик может импортировать необработанный файл записи разработчика (.xml) в Visual Studio для создания теста X++. Инструмент импорта создает удобочитаемый тест X++ из записи и переводит любые управляющие жесты, проверки или задачи в соответствующий тестовый код.

Импорт записанного теста

  1. Откройте Visual Studio с помощью средств разработки Finance and Operations.

  2. Перейдите к Dynamics 365 > Надстройки > Импорт записи задачи .

  3. В меню Запись задачи импорта используйте кнопку Обзор , чтобы найти ранее загруженный файл записи.

  4. При необходимости выберите добавление сгенерированного тестового кода в стартовый проект. Для этого необходимо, чтобы решение, содержащее проект, было установлено в качестве запускаемого проекта. Это поместит сгенерированный тест X++ в ту же модель, что и проект.

  5. Если вы создаете новый проект, выберите модель для проекта. Сгенерированный тест X++ будет помещен в эту модель. Для успешного построения сгенерированного теста модель должна иметь ссылки на модель TestEssentials .

  6. Нажмите Импорт .

  7. В диалоговом окне New Project укажите имя проекта.

  8. После создания проекта пользователь может открыть и проверить сгенерированный код.

  9. Для запуска теста соберите проект.

  10. Перейдите к Test > Windows > Test Explorer .

Приложение

Элементы управления, о которых известно, что они не полностью поддерживают регистратор задач

  • Стол
  • Панель фильтров, которая представляет собой фильтр, выдвигающийся с левой стороны.
    • При добавлении фильтров на панель фильтров шаги задерживаются.Шаги не записываются, пока пользователь не нажмет «Применить» на панели «Фильтр».
  • Расширенный предварительный просмотр
    • Поддержка записи жестов в расширенных предварительных просмотрах не планируется. Во время записи расширенный предварительный просмотр будет отключен.
  • По умолчанию никакие расширяемые элементы управления не поддерживаются, кроме Segmented Entry.
    • Владельцам расширяемых элементов управления необходимо отдельно создать поддержку регистратора задач.

Элементы управления, которые могут быть записаны, но имеют ограниченную поддержку жестов Копировать/Вставить/Проверить

  • Дата/Время
    • Не поддерживает копирование/вставку «Никогда» в качестве значения.
  • Изображение
    • Нет возможности копировать/вставлять/проверять значение изображения.
  • Панель фильтра
    • Копирование/вставка работает, но пользовательский интерфейс не отображает вставленные данные. Вы можете продолжить, как будто он вставлен правильно.
  • Окно сообщений
    • Невозможно проверить текст в окне сообщения.

Элементы управления, о которых известно, что они не полностью поддерживаются для использования в руководстве по задачам

  • Быстрый фильтр — элемент управления фильтром, который отображается над списками.
    • Не поддерживает отображение «общего значения» во время руководства по задачам.В настоящее время отображает значение, которое использовалось во время записи.
  • Панель фильтров, которая представляет собой фильтр, выдвигающийся с левой стороны.
    • Руководство по задачам не указывает на отдельные элементы на панели «Фильтр», которые необходимо щелкнуть.

TssK представляет собой тримерный цитоплазматический белок, взаимодействующий с компонентами как фагоподобных, так и мембраноякорных комплексов системы секреции VI типа

J Biol Chem. 20 сентября 2013 г.; 288(38): 27031–27041.

, ‡, 1 , §, , 2 , 2 , §, 3 , ‡, 1 , § , § , и ‡, 4 4

abdelrahim Zoued

из Macroomoleire d’ingénierie des systèmes macroomoléculaires, Институт Microbioologie de la Méditerranée, CNRS, UMR 7255, AIX-Marseille Université, 31 Chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille Cedex 20, Франция и

ERIC DURAND

§ Архитектура et foncorce des macromolecules bioologiques, Campus de Luminy, Case 932, Aix-Marseille Université, CNRS UMR 6098, 13288 Marseille Cedex 09, ФРАНЦИЯ

CECILIA BEBEACUA

§ архитектура et Fonction des Macromolécules Biologiques, Campus de Luminy, Case 932, Aix-Marseille Université, CNRS UMR 6098, 13288 Marseille Cedex 09, France

Yannick R.Brunet

от MacroomoLéculaires degénierie des systèmes macroomoléculaires, Институт Microbioologie de la Méditerranée, CNRS, UMR 7255, AIX-Marsele Université, 31 Chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille Cedex 20, Франция и

Badeddine Douzi

§ архитектура et fonction des macromolecules biologiques, Campus de Luminy, Case 932, AIX-Marseille Université, CNRS UMR 6098, 13288 Marseille Cedex 09, Франция

Chedian Cambillau

Christian §

Архитектура ET Booncation DES Macromolécules Biologiques , Campus de Luminy, Case 932, Aix-Marseille Université, CNRS UMR 6098, 13288 Marseille Cedex 09, France

Eric Cascales

Из Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Macromoléculaires Ingénierie des Systèmes Macromoléculaires , UMR 7255, Aix-Marseille Université, 31 Chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille Cedex 20, France и

Laure Journet 90 015

Из Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Macromoléculaires, Institut de Microbiologie de la Méditerranée, CNRS, UMR 7255, Aix-Marseille Université, 31 Chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille 91 91 91 Cedex 20, Франция и 900 Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Macromoléculaires, Institut de Microbiologie de la Méditerranée, CNRS, UMR 7255, Aix-Marseille Université, 31 Chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille Cedex 20, France и

the 1 , Campus de Luminy, Case 932, Aix-Marseille Université, CNRS UMR 6098, 13288 Marseille Cedex 09, France

4 Кому следует направлять корреспонденцию: Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Macromoléculaires (UMR7255), CNRS, Aix-Marseille Université, 31 Chemin Joseph Aiguier, 13402 Marseille cedex 20, Франция. , тел.: 334

156; Факс: 334

124; Электронная почта: [email protected]

1 При поддержке докторской стипендии Министерства исследований Франции.

2 При поддержке Фонда медицинских исследований (SPF20101221116).

3 Текущий адрес: Структурная и вычислительная биология, клеточная биология и биофизика, Европейская лаборатория молекулярной биологии, Meyerhofstrasse 1, 69117 Гейдельберг, Германия.

Поступила в редакцию 5 июля 2013 г.; Отредактировано 5 августа 2013 г.

Copyright © 2013 г. Американского общества биохимии и молекулярной биологии, Inc.
Дополнительные материалы

Дополнительные данные

GUID: 154B83B2-D90D-42B3-BC17-450FEE6EEE16

GUID: 3B3AFB74-3A77-42E8-B32B-9769EDE

Abstract

Система секреции типа VI (T6SS) представляет собой макромолекулярный механизм, который опосредует взаимодействия бактерии-хозяина или бактерии-бактерии. Ядерный аппарат T6SS собирается из 13 белков, образующих две подсборки: фагоподобный комплекс и трансоболочечный комплекс. Субъединицы Hcp, VgrG, TssE и TssB/C структурно и функционально родственны компонентам хвоста сократительных бактериофагов. Считается, что эта фагоподобная структура прикреплена к мембране транс-оболочечным комплексом, состоящим из белков TssJ, TssL и TssM. Однако то, как связаны два подкомплекса, остается неизвестным. Здесь мы идентифицируем TssK, белок, который устанавливает контакты с двумя субкомплексами T6SS посредством прямого взаимодействия с TssL, Hcp и TssC.TssK представляет собой цитоплазматический белок, собирающий тримеры, которые имеют трехлучевую форму, как показано с помощью анализов TEM и SAXS. Эксперименты с флуоресцентной микроскопией дополнительно демонстрируют необходимость TssK для сборки оболочки. Наши результаты предполагают центральную роль TssK, связывая оба комплекса во время сборки T6SS.

Ключевые слова: Бактериальный патогенез, мембранный транспорт, микробиология, белковые комплексы, белковая секреция, Hcp, TssK, TssL, секреция типа VI, сборка оболочки клетки, чтобы очистить экологическую нишу или вызвать заболевание (1). Одной из систем, способных доставлять токсичные эффекторы как в прокариотические, так и в эукариотические клетки, является система секреции типа VI (T6SS) 5 (2). Текущая модель функции T6SS предполагает, что она действует аналогично устройству прокалывания клеток сократительных бактериофагов (3–5).

Хотя для его функции обычно необходимы несколько вспомогательных белков, T6SS собирается из 13 белков Tss (субъединицы шестого типа), гены которых консервативны во всех кластерах генов T6SS и поэтому называются «коровыми компонентами» (6–8).Некоторые из этих консервативных субъединиц имеют структурное и функциональное сходство с сократительными белками хвоста бактериофага, включая компоненты хвостовой трубки, оболочки, втулки и базовой пластинки (4, 9-12). По этим причинам структура, собранная этими белками и визуализируемая с помощью криоэлектронной томографии и флуоресцентной микроскопии, была названа «фагоподобным комплексом». Вторая группа компонентов сердцевины представляет собой мембранные белки TssJ, TssM и TssL, которые собирают транс-оболочечный комплекс. Помимо этих двух групп, основные компоненты TssA, TssF, TssG и TssK еще не охарактеризованы.

Как кратко описано выше, фагоподобный подкомплекс структурно и функционально подобен сократительному хвосту Myoviridae. Кристаллическая структура белков Hcp (белок, совместно регулируемый гемолизином) имеет большое сходство с белком gpV хвостовой трубки бактериофага λ (10, 13–15). Шесть Hcp собираются в кольца шириной около 80–90 Å с внутренним диаметром около 30–40 Å (13–15), которые накладываются друг на друга, образуя трубки in vitro (9, 13–16).Тример VgrG (валин-глициновый повторный белок) структурно гомологичен шиповидному комплексу gp27/gp5 бактериофага T4, который используется в качестве прокалывающего устройства для перфорации оболочки клетки-хозяина (9, 17). TssE является гомологом gp25, структурного компонента базовой пластинки фага (6, 18), в то время как субъединицы TssB и TssC (также называемые VipA и VipB в Vibrio cholerae ) взаимодействуют друг с другом и образуют зубчатые трубчатые структуры около диаметром 300 Å с внутренним каналом диаметром 100 Å, напоминающим сократительную оболочку бактериофага (11, 12). Эксперименты с криоэлектронной томографией и иммуноэлектронной микроскопией выявили наличие подобных «оболочечных» структур в цитоплазме клеток T6SS + (4, 19, 20). Интересно, что эти структуры существуют в двух различных конформациях. Действительно, используя слияние TssB с зеленым флуоресцентным белком (GFP), эксперименты с покадровой флуоресцентной микроскопией продемонстрировали, что эти структуры очень динамичны и циклически перемещаются между расширенными и сжатыми конформациями посредством удлинения, сжатия и разборки (4, 19-21).Разборка контрактированных оболочек T6SS катализируется АТФазой ClpV AAA + (11, 19, 20, 22). По аналогии с процессом инфицирования бактериофагами современная модель предполагает, что T6SS функционирует как инвертированный бактериофаг и что сокращение оболочки TssB/C выталкивает трубку Hcp и VgrG за пределы клетки, чтобы проколоть клетку-мишень и доставить эффекторы токсина (2, 3). , 23). В соответствии с этой моделью белки Hcp и VgrG обычно обнаруживаются в супернатанте клеток, продуцирующих T6SS (13, 24, 25), и сокращение оболочки коррелирует с лизисом клетки-жертвы (21).

На основании изображений криоэлектронной микроскопии было высказано предположение, что этот фагоподобный комплекс прикрепляется к мембране (4). В EAEC был идентифицирован иммунопреципитируемый комплекс, состоящий из TssM, TssL и TssJ (26). Биохимические, структурные исследования и исследования белок-белковых взаимодействий дали представление о характеристиках этих субъединиц (26-31). В то время как TssL является битопным мембранным белком, N-конец которого расположен в цитоплазме (28, 30, 31), TssM имеет три трансмембранные спирали (TMH) с большим С-концевым периплазматическим доменом, взаимодействующим с липопротеином наружной мембраны TssJ (25, 27). , 29).Цитоплазматическая петля, расположенная между TMh3 и TMh4, содержит АТФ-связывающий и гидролизующий мотив Walker A, который, как было показано, необходим для функции T6SS у Agrobacterium tumefaciens (28). Транс-оболочечный комплекс обычно стабилизирован пептидогликан-связывающим мотивом, локализованным на С-конце субъединицы TssL или на дополнительном компоненте (26, 32).

Что касается этого мембранного комплекса, сравнительный биоинформационный анализ показал консервативную геномную организацию между генами tssJ , tssK , tssL и tssM (8).Среди этих генов tssK кодирует неохарактеризованный предполагаемый растворимый белок. Ген tssK организован в тандеме с tssL в 74% кластеров генов T6SS, что предполагает функциональную связь или взаимодействие между этими двумя белками (8). Ассоциация TssK с мембранным комплексом также убедительно подтверждается наблюдением, что этот белок был обнаружен связанным с протеомом внутренней мембраны у Pseudomonas aeruginosa (33). Интересно, что хотя TssK потенциально связан с мембранным комплексом, недавно было показано, что белок TssK Vibrio cholerae очищается совместно с изолированными оболочками (4).Следовательно, TssK является хорошим кандидатом для связывания как мембраны T6SS, так и фаговых комплексов. В этом исследовании мы сообщаем о характеристике белка TssK, кодируемого кластером генов sci-1 T6SS в энтероагрегативной Escherichia coli (номер доступа: EC042_4526, {«type»:»entrez-protein»,»attrs»: {«text»:»YP_006098803. 1″,»term_id»:»387609947″,»term_text»:»YP_006098803.1″}}YP_006098803.1). Мы обнаружили, что TssK1 взаимодействует с цитоплазматическим доменом двух белков внутренней мембраны TssL1 и TssM1.Мы также выявили прямые контакты между TssK1 и хвостовыми компонентами T6SS TssC1 и Hcp1. Дальнейшая биохимическая и структурная характеристика очищенного белка TssK1 с использованием эксклюзионной хроматографии, электронной микроскопии и малоуглового рассеяния рентгеновских лучей показала, что TssK1 является тримерным в растворе и образует частицы в форме трех рукавов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ

Бактериальные штаммы, условия роста и химические вещества

Штаммы E. coli и плазмиды, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S1.Штаммы E. coli K12 DH5α, W3110, BTh201 и T7-Iq pLys использовали для стадий клонирования, совместной иммунопреципитации, бактериальной двухгибридной очистки и очистки белков соответственно. Штаммы обычно выращивали в среде, богатой LB, или в минимальной среде M9 с добавлением глицерина (0,4%) и casa-аминокислот (100 мкг/мл) при встряхивании при 37 °C. Плазмиды поддерживали добавлением ампициллина (100 мкг/мл для E. coli K12, 200 мкг/мл для EAEC) или канамицина (50 мкг/мл). Экспрессию генов из плазмид, производных pASK-IBA37, индуцировали добавлением 0.1 мкг/мл ангидротетрациклина (АГТ, IBA Technology) в течение 45 мин; экспрессию гена из pBAD индуцировали 0,01% L-арабинозы в течение 1 часа, тогда как экспрессию гена из клеток T7-Iq pLys индуцировали 500 мкМ изопропил-β-d-тиогалактопиранозида (IPTG) в течение 16 часов при 17 °C. . Для анализа высвобождения Hcp экспрессию кластера генов sci-1 индуцировали добавлением хелатора железа 2,2′-дипиридила (конечная концентрация 125 мкМ) за 30 минут до сбора клеток (34). Олигонуклеотиды и плазмиды, используемые в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S1.

Конструкция штамма

Ген tssK1 был делетирован в энтероагрегативном штамме E. coli 17–2 с использованием модифицированной одностадийной процедуры инактивации (35), как описано ранее (27), с использованием олигонуклеотидов DEL-4526–3/ DW и DEL-4526-5/DW, несущие 50-нуклеотидные удлинения, гомологичные областям, прилегающим к tssK1 . Были отобраны клоны, устойчивые к канамицину, подтвержденные ПЦР колоний. Затем канамициновую кассету вырезали с использованием плазмиды pCP20.Делеция tssK1 была подтверждена колоние-ПЦР.

Plasmid Construction

Полимеразные цепные реакции (ПЦР) проводили с использованием термоциклера Biometra с использованием ДНК-полимеразы Phusion (Thermo Scientific). Ферменты рестрикции приобретали у New England Biolabs и использовали в соответствии с инструкциями производителя. Пользовательские олигонуклеотиды были синтезированы Sigma Aldrich и перечислены в дополнительной таблице S1. Энтероагрегатную ДНК E. coli 17–2 использовали в качестве матрицы для всех ПЦР.Штамм E. coli DH5α использовали для процедур клонирования. Все плазмиды (кроме pETG20-TssK1 и pOK-TssK1 HA ) были сконструированы путем клонирования без рестрикции (36), как описано ранее (26). Вкратце, представляющие интерес гены амплифицировали с олигонуклеотидами, вводящими отжиг удлинений в вектор-мишень. Двухцепочечный продукт первой ПЦР затем использовали в качестве олигонуклеотидов для второй ПЦР с использованием вектора-мишени в качестве матрицы. Для конструкции pETG20A-TssK1 tssK1 клонировали в вектор pETG20A Gateway® с использованием стандартных протоколов Gateway®.Окончательная конструкция позволяет производить TssK1, слитый с N-концевым меченым гексагистидином тиоредоксином, за которым следует сайт расщепления протеазой TEV. Для pOK-TssK1 HA , использованного в экспериментах по соосаждению, ген tssK1 был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов, вводящих сайты рестрикции EcoRI и XhoI, и клонирован в производный от pOK12 вектор pMS600 (27), расщепленный теми же ферментами, что позволило внутрирамочное слияние с С-концевым эпитопом гемагглютинина (HA). Плазмида pBAD-TssB1-sfGFP, используемая для флуоресцентной микроскопии, была сконструирована аналогично ранее описанной pBAD-TssB2-sfGFP (21).

Флуоресцентная микроскопия и обработка изображений

EAEC 17-2, δ TSSK1 или дополнены δ TSK1 клетки, несущие плазмиду PBAD33-TSSB1-SFGFP, разбавляли до A 600 нм ~ 0,05 в минимальную среду M9. A 600 нм ∼1,0. Клетки промывали в фосфатно-солевом буфере (PBS), ресуспендировали в PBS до A 600 нм ~50 и наносили на тонкий слой 1.5% агарозы в PBS, накрыли покровным стеклом и инкубировали в течение одного часа при 37 ° C перед получением микроскопии. Для каждого эксперимента десять независимых полей определялись вручную с помощью моторизованного предметного столика (Prior Scientific) и сохранялись (X, Y, Z, PFS-смещение) в нашей пользовательской системе автоматизации, предназначенной для покадровых экспериментов. Флуоресцентные и фазово-контрастные микрофотографии снимали каждые 30 с с помощью автоматизированного и инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа TE2000-E-PFS (Nikon, Франция), оснащенного системой Perfect Focus System (PFS).PFS автоматически поддерживает фокусировку, так что интересующая точка в образце всегда остается в фокусе, несмотря на механические или тепловые возмущения. Изображения были записаны с помощью CoolSNAP HQ 2 (Roper Scientific, Roper Scientific SARL, Франция) и объектива 100×/1,4 DLL. Возбуждающий свет излучался металлогалогенной лампой мощностью 120 Вт. Изображения sfGFP были записаны с использованием набора фильтров ET-GFP (Chroma 49002) с временем экспозиции 100–200 мс. Фазовый контраст и флуоресценция были скорректированы и объединены с помощью ImageJ 1.46ж.

Бактериальный двухгибридный анализ (BACTH)

Бактериальный двухгибридный метод на основе аденилатциклазы (37) использовали, как было опубликовано ранее (38). Вкратце, пары тестируемых белков сливали с изолированными каталитическими доменами Т18 и Т25 аденилатциклазы Bordetella . После трансформации двух плазмид, продуцирующих слитые белки, в репортерный штамм BTh201 планшеты инкубировали при 30°С в течение 48 часов. Три независимые колонии для каждой трансформации инокулировали в 600 мкл среды LB с добавлением ампициллина, канамицина и IPTG (0.5 мм). После ночного роста при 30°С. По 10 мкл каждой культуры наносили на чашки MacConkey и LB с добавлением бром-хлор-индолил-галактопиранозида (X-Gal) и инкубировали в течение 16 ч при 30°С. Эксперименты проводились по крайней мере в трех экземплярах, и показан репрезентативный результат.

Эксперименты по ко-иммунопреципитации

100 мл клеток W3110, продуцирующих два белка из независимых плазмид, выращивали до A 600 0,4 и экспрессию клонированных генов индуцировали IPTG и AHT в течение 45 мин.Клетки собирали, осадки замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С в течение 1 часа. Затем осадки ресуспендировали в Tris-HCl 20 мМ, pH 8,0, NaCl 100 мМ, сахарозе 30%, лизоциме 100 мкг/мл, 1 мМ ЭДТА, ДНКазе 100 мкг/мл, РНКазе 100 мкг/мл, полной смеси ингибиторов протеаз (Roche ) до A 600 из 80 и инкубировали на льду в течение 15 мин. Клетки лизировали тремя пассажами во French Press (800 psi), добавляли MgCl 2 в конечной концентрации 2.5 мм и лизаты осветляли центрифугированием при 13000× g в течение 10 мин. Лизаты инкубировали с Tween 20 0,2% или CHAPS 10 мм в течение 1 ч при комнатной температуре при энергичном встряхивании и, наконец, центрифугировали при 15 000 × g в течение 10 мин. Супернатанты использовали для совместной иммунопреципитации с использованием аффинного геля Anti-FLAG® M2 (Sigma-Aldrich). Через 3 ч инкубации гранулы дважды промывали 1 мл Tris-HCl 20 мМ, pH 8,0, NaCl 100 мМ, 15% сахарозы, Tween 0,2% или CHAPS 10 мМ и один раз Tris-HCl 20 мМ, pH 8.0, NaCl 100 мМ. Гранулы извлекали и ресуспендировали в 25 мкл SDS-загрузочного буфера и нагревали в течение 10 минут при 96 °C перед анализом SDS-PAGE и Вестерн-блоттингом.

Очистка TSK1

E. Coli T7 IQ Клетки, несущие PETG20-TSSK1, выросли при 37 ° С в потрясающем бульоне до A 600 ~ 0,9 и EXSK1 выражение было индуцировано с IPTG (0,5 мм) в течение 16 ч при 17 °С. Клетки собирали, ресуспендировали в Трис-HCl 20 мМ, pH 8,0, NaCl 150 мМ и лизоциме (0.25 мг/мл) и разрушается ультразвуком. Растворимые белки отделяли от телец включения и клеточного дебриса центрифугированием в течение 30 мин при 20 000 × g . Слитый белок TssK1 иммобилизовали с помощью аффинной хроматографии с ионами металлов на предварительно заполненной колонке Ni 2+ HisTrap (GE Healthcare) с использованием системы AKTA FPLC и элюировали ступенчатым градиентом имидазола. Фракции, содержащие слитый белок TssK1, объединяли, и белок расщепляли в течение 16 часов при 4 °C протеазой вируса травления табака (TEV), меченной гексагистидином, с использованием соотношения протеаза: белок 1:10 (вес/вес).Затем протеазу TEV и примеси связывали на втором аффинном хроматографе Ni 2+ , а нативный белок TssK1 собирали в проточном режиме и концентрировали на препаративной колонке для гель-фильтрации Superdex 200 (GE Healthcare), уравновешенной трис-HCl 20. мм, рН 8,0, NaCl 150 мм. Конечная концентрация раствора TssK1 составила 8,8 мг/мл. Белок EAEC Hcp1 очищали аналогично TssK1 с использованием производной плазмиды pETG20A, кодирующей TRX-His-Hcp1.

Аналитический гель-фильтрационный анализ и эксклюзионная хроматография в сочетании с MALS/QELS/UV/RI

Для аналитической гель-фильтрации по 2 мг каждого белкового стандарта (овальбумин [43 кДа], кональбумин [75 кДа], альдолаза [158 кДа] и ферритин [440 кДа] (GE Healthcare)) и 1 мг очищенного белка TssK1 анализировали отдельно на аналитической колонке Superdex 200 10/30 (GE Healthcare), уравновешенной в Tris-HCl 20 мМ, pH 8. 0, NaCl 150 мМ. Эксклюзионную хроматографию (ЭХ) выполняли на системе ВЭЖХ Alliance 2695 (Waters) с использованием колонок KW803 и KW804 (Shodex) в Tris-HCl 20 мм, pH 8,0, NaCl 150 мм при 0,5 мл/мин. MALS, УФ-спектрофотометрия, QELS и RI были достигнуты с помощью MiniDawn Treos (Wyatt Technology), Photo Diode Array 2996 (Waters), DynaPro (Wyatt Technology) и Optilab rEX (Wyatt Technology) соответственно, как описано (39). Расчет массы и гидродинамического радиуса был выполнен с помощью программного обеспечения ASTRA (Wyatt Technology) с использованием значения dn / dc , равного 0.185 мл/г.

Анализ поверхностного плазмонного резонанса

Стационарное состояние взаимодействия между TssK1 и Hcp1 было выполнено с использованием BIAcore T200 при 25 °C. Все буферы перед использованием фильтровали через мембраны 0,2 мкм. Сенсорный чип HC200m (Xantech) был покрыт Hcp1, иммобилизованным аминовым связыванием (ΔRU = 4300). Контрольную проточную кювету покрывали тиоредоксином, иммобилизованным путем связывания с амином, в той же концентрации, что и Hcp1 (ΔRU = 4100). Следы связывания в результате прохождения очищенного TssK1 (пять концентраций в диапазоне от 3.от 125 до 100 мкм) в буфере HBS-EP (Hepes 10 мМ, NaCl 150 мМ, ЭДТА 3 мМ, полисорбат 20 0,005%) в Hcp1 и контрольных проточных ячейках регистрировали в двух экземплярах. Сигнал от контрольной проточной кюветы и отклик буфера вычитали из всех измерений. Значения K D были получены с использованием инструмента подбора программного обеспечения BIAevaluation (BIAcore).

Трансмиссионная электронная микроскопия, анализ отдельных частиц и реконструкция изображения

Очищенный белок TssK1 (50 мкг/мл) иммобилизовали на угольной сетке с тлеющим разрядом путем инкубации в течение 1 мин, а затем окрашивали 2% уранилацетатом.Затем сетки сушили на воздухе и собирали изображения 2k × 2k с помощью микроскопа FEI Tecnai Spirit, работающего при 120 кВ, при увеличении 60 000 и размере 3,5 Å/пиксель. Приблизительно 5000 частиц были отобраны из десяти изображений с помощью программы Boxer из пакета EMAN2 (40), выделены в блоки размером 72 × 72 пикселя и объединены в единый набор данных. Этот набор данных был предварительно обработан с использованием пакета SPIDER (41) и представлен для классификации и сопоставления с максимальным правдоподобием (ML) (42) с использованием пакета Xmipp (43).Затем выровненный набор данных был классифицирован с помощью анализа основных компонентов (PCA) с использованием SPIDER на классы с > 10 членами/класс. Первоначальная модель была построена так, чтобы сформировать бесформенную сферу эквивалентного размера средним значениям класса, и сначала была уточнена с помощью трехмерного уточнения ML с использованием средних значений класса, а затем всего набора данных с частотой дискретизации 5 °, накладывая симметрию C3 для получения окончательной модели. с разрешением ∼26 Å согласно оценке с помощью корреляции Фурье-оболочки (FSC) и ½-битового порогового критерия (44).Карта электронной микроскопии ЕАЭС ЦсК1 депонирована в банк данных электронной микроскопии (EMDB) под регистрационным кодом EMD-5739.

Анализ малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и трехмерная реконструкция формы ab initio энергия 12,5 кэВ (λ = 0,931 Å).
Тридцать микролитров белкового раствора на 1,1, 2,8, 5,3, 7,9, 11 и 15.7 мг/мл в Tris-HCl 20 мМ, pH 8,0, NaCl 150 мМ с помощью роботизированной системы загружали в 2-мм кварцевый капилляр, установленный в вакууме, и собирали десять независимых 10-секундных экспозиций на детекторе Pilatus 6 мФ, размещенном на расстоянии 2,85 м для каждой концентрации белка. Отдельные кадры обрабатывались автоматически и независимо на линии луча с помощью программного обеспечения для сбора данных (BsxCUBE), что давало радиально усредненные нормализованные интенсивности как функцию переданного импульса q, где q = 4πsin(θ)/λ, где 2θ — полный угол рассеяния. λ — длина волны рентгеновского излучения.Данные были собраны в диапазоне q = 0,04–6 нм -1 . Десять кадров были объединены, чтобы получить среднюю кривую рассеяния для каждого измерения. Точки данных, затронутые агрегацией, возможно, вызванной радиационным повреждением, были исключены. Рассеяние только от буфера также измеряли до и после анализа каждого образца, а среднее значение этих двух измерений буфера использовали для вычитания фона с помощью программы PRIMUS (45) из пакета ATSAS (46). PRIMUS также использовался для выполнения анализа Гинье (47) данных с низким q, который дает оценку радиуса вращения ( R g ).Регуляризованные непрямые преобразования данных рассеяния проводились с помощью программы GNOM (48) для получения P( r ) функций межатомных расстояний. Функция P( r ) имеет максимум на наиболее вероятном межмолекулярном расстоянии и стремится к нулю при D max , максимальном внутримолекулярном расстоянии. Значения D max были выбраны так, чтобы соответствовать экспериментальным данным и иметь положительную функцию P( r ). Трехмерные (3D) модели шариков, соответствующие данным рассеяния, были построены с помощью программы DAMMIF (49).Было выполнено десять независимых запусков DAMMIF с использованием профиля рассеяния TssK1 с данными, распространяющимися до 0,35 нм -1 , с использованием настроек медленного режима, предполагая симметрию P3 и допуская максимум 500 шагов для обеспечения сходимости. Модели, полученные в результате независимых прогонов, были наложены друг на друга с помощью пакета DAMAVER (50). Это привело к начальному выравниванию структур на основе их осей инерции с последующей минимизацией нормализованного пространственного расхождения (NSD) (51). Таким образом, NSD был рассчитан между набором из десяти независимых реконструкций с диапазоном NSD от 0.678 до 0,815. Выровненные структуры затем усреднялись, давая эффективную занятость каждому вокселу в модели, и фильтровались при половинной максимальной занятости для создания моделей соответствующего объема, которые использовались для всех последующих анализов. Все модели были подобны с точки зрения согласия с экспериментальными данными, измеренными параметром DAMMIF χ и качеством подгонки к экспериментальной кривой.

Разное

Анализы высвобождения Hcp (27) и фракционирования (26) выполняли, как описано ранее.Для солюбилизации мочевины мембранные фракции инкубировали на колесе с мочевиной 8 м в течение 20 мин при комнатной температуре с последующим 40-минутным ультрацентрифугированием при 100000 × g . Для иммуноокрашивания белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны и иммуноблоты зондировали антителами и козьими вторичными антителами, связанными со щелочной фосфатазой, и проявляли в щелочном буфере в присутствии 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата и нитросинего тетразолия. Поликлональные антитела против TolB взяты из нашей лабораторной коллекции, в то время как моноклональные антитела против HA (клон 3F10, Roche), против FLAG (клон M2, Sigma Aldrich), против EFTu (Roche) и козьи антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой. — вторичные антитела кролика, мыши или крысы (Millipore) были приобретены, как указано.

РЕЗУЛЬТАТЫ

TssK1 является цитоплазматическим белком

Предполагается, что ген tssK1 кодирует растворимый белок массой 50 кДа без предсказанного пептидного сигнала или трансмембранного сегмента. Для определения его субклеточной локализации клеток tssK1 , продуцирующих N-концевой FLAG-меченый белок TssK1 (TssK1 FLAG ), подвергали процедуре фракционирования. показывает, что TssK1 локализуется совместно с цитоплазматическим маркером EFTu. Однако в общей мембранной фракции было обнаружено небольшое количество белка.Это может соответствовать периферической ассоциации TssK с мембраной или с мембранными белками, так как он солюбилизирован мочевиной, такой как TolB, периплазматический белок, связанный с мембраной (4). Альтернативно, поскольку tssK1 сверхэкспрессируется из плазмиды и, вероятно, экспрессируется в более высоких количествах, чем другие компоненты T6SS, белок TssK1, обнаруженный в этой фракции, может соответствовать агрегатам. Стоит отметить, что в цитоплазматической фракции также была обнаружена полоса ∼36 кДа, соответствующая N-концевому продукту деградации.Кроме того, во всех клетках и в цитоплазматической фракции можно наблюдать полосы с более высокой молекулярной массой, что указывает на то, что TssK1 может образовывать олигомеры, которые не поддаются анализу в SDS-PAGE.

ЦсК1 кофракционирует с цитоплазматическими белками. Процедуру фракционирования применяли к клеткам EAEC tssK1 , продуцирующим TssK1 с маркировкой FLAG (TssK1 FL ). Тотальные клетки ( Т ) отделяли от культурального супернатанта ( SN ) и фракционировали для выделения периплазматической ( Р ), цитоплазматической ( С ) и мембранной фракций ( М ).Мембраны обрабатывали мочевиной для растворения агрегированных и/или периферически связанных белков (Sol, растворимая фракция; Ins, нерастворимая фракция). Белки из клеток 10 9 (T) и 2 × 10 9 (SN, P, C, M) клеток разделяли с помощью SDS-PAGE и иммунодетектировали моноклональными анти-FLAG (TssK1 FL ), анти-EF- Tu (цитоплазматический маркер) и TolB (периплазматический маркер, периферически связанный с наружной мембраной) антитела. Положения TssK1 (TssK1 FL ) и продукта деградации TssK1 (*) указаны на справа .Маркеры молекулярной массы (в кДа) указаны слева .

Сеть взаимодействия TssK1

Чтобы лучше понять функцию белка TssK1, мы провели бактериальный двухгибридный (BACTH) скрининг для выявления парных взаимодействий между субъединицами TssK1 и T6SS, включая TssA1, TssB1, TssC1, TssE1, TssF1. , растворимые белки TssG1, Hcp1 и VgrG1 и растворимые домены TssL1 (цитоплазматический домен, остатки 1–184, TssL1c), TssM1 (цитоплазматический домен, остатки 62–360, TssM1c; периплазматический домен, остатки 386–1129, TssM1p) и TssJ1 (лишенные мотива ацилирования) ассоциированные с мембраной белки.Домены T18 или T25 аденилатциклазы Bordetella были слиты с N-концом TssK1, а различные белки-жертвы были слиты с T18 или T25 либо на их N-, либо на C-конце. Представленные результаты указывают на то, что TssK1 взаимодействует с TssL1c и TssM1c. В соответствии с цитоплазматической локализацией TssK1 не было обнаружено взаимодействия с периплазматическим доменом TssM1 или с липопротеином внешней мембраны TssJ1. Помимо этих взаимодействий с компонентами мембранного комплекса, TssK1 взаимодействует с белками хвостовой трубки и оболочки Hcp1 и TssC1 и с нехарактерной субъединицей TssA1.

Сеть взаимодействия TssK1, идентифицированная бактериальным двугибридным анализом. Репортерные клетки BTh201, несущие пары плазмид, продуцирующих указанные белки T6SS, слитые с доменом T18 или T25 аденилатциклазы Bordetella , наносили на чашки с индикатором X-Gal-IPTG LB с агаром, как описано в разделе «Экспериментальные процедуры». Для белков, закрепленных на мембране, использовали только цитоплазматический ( с ) или периплазматический ( р ) домены. Контроли включают слияния T18 и T25 с TolB и Pal, двумя белками, которые взаимодействуют, но не связаны с T6SS.

TssK1 взаимодействует с цитоплазматическим доменом TssL1

В соответствии с совместным присутствием генов tssK и tssL (8), анализ BACTH показал, что TssK1 взаимодействует с белками трансоболочечного подкомплекса. Для дальнейшего подтверждения этих взаимодействий, обнаруженных с помощью BACTH, мы провели эксперименты по иммунопреципитации. Для проверки прямого взаимодействия белки были получены в штамме E. coli K12 W3110, лишенном генов T6SS.Клетки, продуцирующие как HA-меченый TssK1 (TssK1 HA ), так и FLAG-меченые цитоплазматические домены TssL1 (TssL1c FLAG ) или TssM1 (TssM1c FLAG ), подвергали иммунопреципитации с использованием смолы против FLAG. Как показано на рис., TssK1 HA ко-иммунопреципитировался с TssL1c FLAG , но не с TssM1c FLAG . В качестве контроля специфичности TssK1 HA не реагировал со смолой против FLAG и не образовывал иммунопреципитируемого комплекса с неродственным T6SS белком Pal FLAG .Таким образом, анализ коиммунопреципитации подтвердил взаимодействие между TssK1 и TssL1, но не с TssM1.

TssK1 ко-иммунопреципитирует с цитоплазматическим доменом TssL1, но не с TssM1. Растворимые лизаты из 10 11 клеток E. coli K12 W3110, продуцирующих HA-меченый TssK1 (TssK1 HA ) отдельно или в комбинации с FLAG-мечеными цитоплазматическими доменами TssL1 (TssL18TsM FL), TssM1c FL ) или неродственный T6SS-белок Pal (Pal FL ) подвергали иммунопреципитации с использованием шариков, связанных с анти-FLAG. Общий растворимый ( Tot ) и иммунопреципитированный ( IP ) материал разделяли с помощью SDS-PAGE с 12,5% акриламида и иммунодетектировали с помощью анти-HA (TssK1 HA ; , верхняя панель ) и анти-FLAG (TssL1c ). FL , TssM1c FL и Pal FL ; , нижняя панель ) моноклональные антитела. Маркеры молекулярной массы (в кДа) указаны слева от .

TssK1 взаимодействует с фагоподобными компонентами Hcp1 и TssC1 и неохарактеризованным белком TssA1

Затем мы проверили взаимодействие TssK1 с двумя родственными фагам субъединицами, идентифицированными с помощью BACTH, Hcp1 и TssC1, и неохарактеризованным белком TssA1.Анализы совместной иммунопреципитации проводили, как описано выше, с использованием клеток E. coli , продуцирующих два исследуемых белка. Как показано в , A–C , TssK1 HA специфически совместно иммунопреципитируется с TssA1 FLAG , TssC1 FLAG или Hcp1 FLAG. Прочность взаимодействия Hcp1-TssK1 была дополнительно проанализирована с помощью поверхностного плазмонного резонанса ( D ). Белки Hcp1 и TssK1 очищали до гомогенности с помощью аффинной хроматографии с ионами металлов и гель-фильтрации.После иммобилизации очищенного белка Hcp1 на чипах HC200m в микрожидкостный канал вводили TssK1 и записывали сенсограммы. Из этих сенсограмм мы определили, что TssK1 связывается с Hcp1 с константой диссоциации ( K d ) 26,5 ± 2,3 мкм ( D ). Взаимодействие TssK1 с компонентами хвостовой трубки и оболочки T6SS подняло вопрос, необходим ли этот белок для сборки или сокращения динамических трубчатых структур T6SS.Как описано ранее, белки TssB и TssC образуют динамическую цитозольную тубулярную структуру, которая подвергается циклам удлинения, сокращения и разборки, как это наблюдается с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием слитого белка TssB-sfGFP (4, 19-21). Существование трубчатых структур TssB1-sfGFP и их динамическое поведение анализировали в мутантных клетках tssK1 . Записи флуоресцентной микроскопии с интервальной съемкой показали, что флуоресценция TssB1-sfGFP кажется диффузной, и никаких фокусов не наблюдается с течением времени ( A ), что указывает на то, что TssK1 необходим для правильной сборки трубчатых структур оболочки.Текущая модель предполагает, что сокращение оболочки T6SS продвигает трубку Hcp наружу. Действительно, белок Hcp обычно обнаруживается в культуральном супернатанте клеток T6SS + . Как и ожидалось от предыдущих систематических исследований, проведенных на Edwardsiella tarda, V. cholera и Agrobacterium tumefaciens (25, 52, 53), анализ высвобождения Hcp показал, что белок Hcp1 не высвобождается в культуральном супернатанте tssK1 . ячейки ( B ). Динамика TssB1 и секреция Hcp1 были восстановлены до уровней, сравнимых с клетками WT, после того как FLAG- и HA-меченые белки TssK1, использованные в этом исследовании, были получены в мутантных клетках Δ tssK1 .Взятые вместе, эти данные показали, что мутация Δ tssK1 не оказывает полярного эффекта на нижележащие гены и что TssK1 необходим для функции Sci-1 T6SS и сборки канальцев TssB1/TssC1.

TssK1 взаимодействует с компонентами фагоподобного комплекса T6SS. TssK1 ко-иммунопреципитирует с TssA1 ( A ), TssC1 ( B ) и Hcp1 ( C ). Растворимые лизаты от 10 11 E.coli 9091 E.coli K12 W3110 Клетки, продуцирующие HA-TAGED TSSK1 (TSSK1 HA ) и флаг-TSA1 (TSSA1 FL , A ), TSSC1 (TSSC1 FL , Белки B ) или Hcp1 (Hcp1 FL , C ) подвергали иммунопреципитации с использованием шариков, связанных с анти-FLAG.Общий растворимый ( Tot ) и иммунопреципитированный ( IP ) материал разделяли с помощью SDS-PAGE с 12,5% акриламида и иммунодетектировали с анти-HA (TssK1 HA , , нижняя панель ) и анти-FLAG (TssA1 ). FL , TssC1 FL и Hcp1 FL , , верхняя панель ) моноклональные антитела. Маркеры молекулярной массы (в кДа) указаны слева . D , анализ поверхностного плазмонного резонанса комплекса TssK1-Hcp1. Hcp1 иммобилизовали на чипе HC200m и записывали сенсограммы ППР (изменение плазмонного резонанса в условных единицах (ΔRU) в зависимости от времени реакции (в секундах)) при прохождении указанных концентраций TssK1 (TssK) ( левая панель ).График, показывающий ΔRU как функцию концентрации TssK1 (TssK) (, правая панель ), использовали для оценки константы диссоциации комплекса TssK1-Hcp1 (26,5 ± 2,3 мкМ).

ЦСК1 требуется для сборки оболочки и выпуска Hcp1. А , отсутствие ЦСК1 отменяет сборку оболочки Т6СС. Покадровые записи флуоресцентной микроскопии, показывающие динамику оболочки в клетках WT, tssK1 и дополненных tssK1 ( tssK1 + ), продуцирующих TssB1-sfGFP.Отдельные изображения делались каждые 30 с. События сборки и сжатия указаны над замедленными изображениями. Шкала баров составляет 2 мкм. B отсутствие TssK1 препятствует высвобождению Hcp1. Выпуск HCP1 HA был оценен путем разделения целых ячеек ( C ) и культуральный супернатант ( SN ) Фракции от 2 × 10 9 мас. , TSK1 или дополняют TSK1 ( TSSK1 + ) клетки, продуцирующие HA-меченый Hcp1. Белки были разделены на 12.5% акриламид SDS-PAGE и Hcp1 иммунодетектировали с использованием моноклонального антитела против HA (, нижняя панель ). Периплазматический белок TolB (выявленный с помощью поликлональных антител против TolB, , верхняя панель ) использовали в качестве маркера для проверки отсутствия лизиса.

TssK1 является тримером в растворе

Полосы более высоких молекулярных масс, наблюдаемые после анализа SDS-PAGE (см. ), побудили нас проанализировать, может ли TssK1 олигомеризоваться. Сначала мы протестировали in vivo с использованием анализа BACTH.Когда слияния T18-TssK1 и T25-TssK1 были получены совместно, экспрессия репортерного гена активировалась, демонстрируя, что TssK1 олигомеризуется ( A ). Эта олигомеризация была дополнительно подтверждена экспериментами по совместной иммунопреципитации с использованием клеток E. coli K12, продуцирующих как TssK1 FLAG , так и TssK1 HA ( B ). Однако эти анализы, хотя и подтвердили мультимеризацию TssK1, не позволили провести различие между различными олигомерными состояниями.Поэтому мы воспользовались доступностью очищенного нативного белка TssK1 для анализа его состояния олигомеризации in vitro с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии. В то время как ожидаемая молекулярная масса мономера TssK1 составляет 49,9 кДа, белок элюировался в виде одного пика со средней массой 160 кДа, что указывает на то, что TssK1 ведет себя как тример в растворе ( C ). Тримерная организация TssK1 была подтверждена экспериментами MALS/QELS/UV/RI (многоугловое рассеяние лазерного света/квазиупругое рассеяние света/детекторы поглощения/показателя преломления) (технология Wyatt) (дополнительный рис.С1).

ЦсК1 олигомеризуется и в растворе является тримерным. A , TssK1 взаимодействует сам с собой, как показал бактериальный двугибридный анализ. Репортерные клетки BTh201, несущие пары плазмид, продуцирующих указанные белки T6SS, слитые с доменами T18 или T25 аденилатциклазы Bordetella , наносили на чашки с индикатором X-Gal-IPTG LB с агаром, как описано в разделе «Экспериментальные процедуры». Контроли включают анализы взаимодействия TssK1 с TolB и Pal, двумя белками, которые взаимодействуют, но не связаны с T6SS. B , TssK1 HA ко-иммунопреципитирует с TssK1 FLAG . Растворимые лизаты из 10 11 клеток E. coli K12 W3110, продуцирующих HA-меченый TssK1 (TssK1 HA ) отдельно или с FLAG-меченым TssK1 (TssK1 FL ), подвергали иммунопреципитации с помощью FLAG-гранул. . Общий растворимый ( Tot ) и иммунопреципитированный ( IP ) материал разделяли с помощью 10%-акриламидного SDS-PAGE и иммунодетектировали с помощью анти-FLAG (TssK1 FL ; , верхняя панель ) и анти-HA (TssK1). НА ; нижняя панель ) моноклональные антитела. Маркеры молекулярной массы (в кДа) указаны слева . C , аналитическая эксклюзионная хроматография очищенного TssK1 (сплошная линия) на колонке Superdex 200, откалиброванная с использованием маркеров молекулярной массы 43, 75, 158 и 440 кДа ( пунктирных линий ). Молекулярная масса каждого маркера (в кДа) указана над соответствующим пиком. Теоретическая масса мономера TssK1 49,9 кДа, его элюирование при ~160 кДа свидетельствует о том, что в растворе он ведет себя как тример.

TssK1 имеет трехлучевую структуру

Попытки кристаллизовать белок TssK1 не увенчались успехом. Чтобы лучше понять структуру TssK1, очищенный белок был проанализирован с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Приблизительно 5000 частиц были отобраны и обработаны с использованием методов анализа отдельных частиц. Частицы и средние значения класса (, A и B ) демонстрируют четкие черты трехкратной симметрии. Следовательно, мы применили 3-кратную симметрию при обработке данных. Трехмерная реконструкция частицы TssK1 с разрешением ~26 Å ( C ) показывает, что тримерный белок выглядит как три «руки», запутанные в пирамидальной форме ( D ). Длина стороны треугольника составляет 95 Å, тогда как высота частицы равна 70 Å ( D ). Тримерная организация белка и его общая укладка при низком разрешении были подтверждены в растворе анализом SAXS (1). В соответствии с анализами гель-фильтрации и MALS/QELS/UV/RI, молекулярная масса TssK1, полученная из его экспериментального I(0), составила 151 ± 1.2 кДа ( А ). Проверка графика Гинье белка TssK1 под малыми углами показала хорошее качество данных и отсутствие агрегации белка ( B ). Радиус инерции R g TssK1, определенный в приближении Гинье, составляет 40,7 ± 0,6 Å ( B ). Функции распределения парных расстояний P( r ) оценивали по кривым SAXS. Функции P( r ) указывали на максимальный размер 155 Å и демонстрировали колоколообразную кривую со слегка расширенным профилем для более высоких расстояний, что указывает на преимущественно глобулярную конформацию с удлиненными элементами ( C ). Общая огибающая TssK1 была рассчитана ab initio по его профилю рассеяния с использованием DAMMIF (49) с разрешением ∼18 Å. Реконструкция с меньшим нормализованным пространственным расхождением (NSD = 0,678) была выбрана как «наилучшая репрезентативная» модель ( D ). Десять моделей ab initio были сопоставлены с использованием DAMAVER (50) для получения усредненной модели, которая отображает характеристики, идентичные характеристикам «наилучшей репрезентативной» модели (не показана). Когда ЭМ-карта тримера TssK1 была помещена в оболочку SAXS ( D ), оказалось, что плечи находятся в вытянутой конформации в растворе (SAXS), тогда как после подготовки ЭМ-образца они согнуты под центральную треугольную форму, что свидетельствует о потенциальная конформационная гибкость TssK1.

Трехмерная форма TssK1, выявленная с помощью просвечивающей электронной микроскопии и анализа отдельных частиц. Отрицательно окрашенные сырые частицы ( А ) и средние классы ( В ) очищенного ЦсК1. Масштабная линейка составляет 10 нм. C , корреляция Фурье-оболочки ( FSC ) и кривые ½-битного порогового критерия, используемые для оценки разрешения трехкратной симметричной реконструкции ЭМ-изображения TssK1 (∼26 Å), показанной в D .

Данные малоуглового рентгеновского рассеяния и структура низкого разрешения ЦсК1. A , экспериментальные данные рассеяния ( точек ) и аппроксимирующая кривая ( сплошная линия ), рассчитанная по модели ab initio TssK1. B , график Гинье ( точек ) с линейной подгонкой ( непрерывная линия ). C , функция распределения по расстоянию ЦсК1. D , Конверт SAXS ( светло-серая сетка ) «лучшего представителя» модели ЦСК1. Для сравнения, модель ЭМ, показанная на ( темно-серая плоская поверхность ), помещена в оболочку SAXS.Каждый вид поворачивается на 90° вокруг оси Y. Масштабная линейка составляет 3 нм.

ОБСУЖДЕНИЕ

Недавно были достигнуты важные успехи в сборке фагового комплекса T6SS и идентификации эффекторных белков, доставляемых с помощью этого аппарата. Однако роль нескольких основных компонентов T6SS остается загадочной. В этом исследовании мы сообщаем о характеристике белка TssK, кодируемого в кластере генов sci-1 T6SS энтероагрегативного штамма E.палочка . Схематическое изображение основных результатов работы показано на рис. Сначала мы обнаружили, что этот консервативный белок необходим для функции T6SS, что согласуется с наблюдениями о том, что генов tssK из E. tarda, V. cholera и A. tumefaciens необходимы для T6SS функционирует у этих микроорганизмов (25, 52, 53). Эксперименты по покадровой флуоресцентной микроскопии с использованием слитого белка TssB-sfGFP также показали, что динамика оболочки T6SS отменяется в клетках tssK1 .В отличие от клеток V. cholerae , P. aeruginosa и EAEC WT, в которых оболочки T6SS подвергаются циклам сборки и сокращения (4, 19–21), или клеток V. cholerae Δ clpV , в которых контрактированные оболочки не разобраны и образуют очаги (4, 20), флуоресценция TssB-sfGFP была диффузной, в клетках tssK1 точечных очагов не наблюдалось. Это говорит о том, что сборка трубочек TssB/TssC не происходит в отсутствие TssK, фенотип сходен с наблюдаемым у V.cholerae tssM , fha , hcp и tssE или мутантные клетки EAEC tssE (4, 20, 21). Таким образом, TssK1, по-видимому, участвует на стадии перед ClpV во время сборки оболочки T6SS. Попытки локализовать белок TssK1 с использованием хромосомного слияния гена tssK1-sfGFP пока не увенчались успехом из-за неопределяемых уровней флуоресценции, что свидетельствует о низкой представленности белка.

Схематическое изображение сети взаимодействия белков TssK. Представлены локализация и топология нескольких субъединиц секреции типа VI. Стрелки показывают взаимодействия, обнаруженные в этом исследовании с помощью биохимического ( красный ) или двухгибридного подходов ( синий ) (обобщено в дополнительной таблице S2). Связанные с мембраной и бактериофагоподобные узлы обрамлены зеленым и синим соответственно. ОМ : наружная мембрана, ИМ : внутренняя мембрана.

Анализы бактериальной двугибридной и коиммунопреципитации показали, что TssK1 образует олигомеры.Дальнейшие эксперименты по гель-фильтрации показали, что белок TssK1 элюируется с кажущейся молекулярной массой, соответствующей молекулярной массе тримера. Тройная организация TssK1 была подтверждена визуализацией очищенного белка с помощью электронной микроскопии. Реконструкция изображения частиц TssK1 показала, что он образует трехлучевую структуру общей пирамидальной формы. В электронной микроскопии три плеча согнуты под структурой, в то время как в растворе они находятся в открытой конформации, как показывает анализ SAXS.Хотя может существовать конформационная гибкость белка, наши данные не могут исключить того, что (i) длина плеч была недооценена из-за среднего между «изогнутой» и «удлиненной» конформациями на EM-сетках или (ii) конформация TssK1 на сетках ЭМ индуцируется подготовкой образца (процедуры фиксации или окрашивания).

В этом исследовании мы определили сеть взаимодействия TssK1 (сводка взаимодействий представлена ​​в дополнительной таблице S2). Используя бактериальный двухгибридный скрининг, мы выявили, что TssK1 взаимодействует с (i) цитоплазматическими доменами TssL1 и TssM1, двумя внутренними мембранными субъединицами мембранного комплекса T6SS, (ii) Hcp1 и TssC1, двумя компонентами фагового хвоста. подкомплекс и (iii) TssA1, основной компонент неизвестной функции.Эти взаимодействия согласуются с цитоплазматической локализацией TssK1, как показано фракционированием, поскольку и Hcp1, и TssC1 являются частью цитозольной трубчатой ​​хвостоподобной структуры. Взаимодействие TssK1-TssM1c, обнаруженное с помощью анализа BACTH, было единственным взаимодействием, которое мы не смогли подтвердить с помощью коиммунопреципитации. TssM1c может иметь другую конформацию при слиянии с доменами T18/T25, и для подтверждения этого взаимодействия потребуется дальнейший анализ. Все взаимодействия TssK1 с TssL1c, Hcp1, TssA1 и TssC1 были подтверждены с помощью коиммунопреципитации. Взаимодействие TssK1-Hcp1 также тестировали in vitro с использованием SPR, и было показано, что оно имеет K D 26 мкм. В целом эти результаты демонстрируют, что TssK1 взаимодействует с компонентами как мембранных, так и фаговых субкомплексов на цитоплазматической стороне аппарата T6SS. Связь между TssK1 и мембранным комплексом согласуется с недавними публикациями. Во-первых, биоинформатический подход показал, что ген tssK встречается совместно с генами tssL , tssM и tssJ , и была продемонстрирована тесная связь между TssK и TssL в исследованиях совместного появления и организации генома. (8).Совсем недавно было показано, что белок TssK совместно фракционируется с белками внутренней мембраны в мембранном протеоме P. aeruginosa (33). Что касается связи между TssK и структурой, подобной хвосту фага T6SS, совпадения не обнаружено, но TssK был очищен совместно с оболочками T6SS (4), что согласуется с его взаимодействием с TssC. Таким образом, можно предположить, что TssK является структурным компонентом, соединяющим фагоподобную структуру и мембранный комплекс на цитоплазматической стороне внутренней мембраны.Какова может быть его функция? Наблюдение, что в мутантных клетках tssK1 не собираются структуры, подобные оболочке T6SS, предполагает, что TssK может (i) инициировать полимеризацию Hcp-трубки или оболочки TssBC или (ii) рекрутировать фагоподобные компоненты в место сборки/секреции, , т.е. мембранный комплекс. По аналогии с сократительными бактериофагами, T6SS, вероятно, нуждается в комплексе, подобном базовой пластинке. Как отмечает Basler et al. криоэлектронных томографов показали, что оболочкообразные трубчатые структуры T6SS соединены с внутренней мембраной через расширяющуюся колоколообразную плотность, которая может соответствовать базовой пластине (4).Белок TssE, который обладает явной гомологией с клиновидным белком gp25 бактериофага, очевидно, является одним из компонентов базовой пластинки (5-7, 18). Хотя в нашем двухгибридном скрининге не было обнаружено взаимодействия между TssK1 и TssE1, а биоинформационные исследования не выявили одновременного появления генов tssE и tssK , цитоплазматическая локализация TssK1, сеть его взаимодействия и его потребность для удлинения оболочки предполагают, что она могла быть частью этого комплекса базовой пластины.Интересно, что стоит отметить, что трехлучевая форма TssK1 имеет внешний диаметр ∼155 Å, размер, близкий к диаметру оболочки (∼110 и 145 Å в вытянутой и сжатой конформациях соответственно, 4). Хотя наше хромосомно закодированное слияние TssK1-sfGFP не было произведено в достаточной степени для локализации TssK1, определение его положения в T6SS поможет лучше понять его функцию.

Благодарности

Мы благодарим членов исследовательских групп Cascales, Cambillau, Lloubes, Bouveret и Sturgis за обсуждение, Тама Миньо за флуоресцентную микроскопию, Шарлотту Гавиар, Валентина Тутагату, Анник Брун, Изабель Брингер и Оливье Удерсо за техническую помощь. и Милен Микотон за поддержку.

* Эта работа была частично поддержана Национальным центром научных исследований (CNRS), Университетом Экс-Марселя и грантом Национального агентства исследований (ANR-10-JCJC-1303-03) (в ЕС). Эта работа также была поддержана CNRS, Университетом Экс-Марселя и грантами от Genopole Марсель-Ницца, IBISA и Fondation de la Recherche Médicale (FRM DEQ2011-0421282) (для CC).

Эта статья содержит дополнительные таблицы S1-S2 и рис.С1.

5 Используемые сокращения:

T6SS
тип секреции VI
IPTG
IPTG
ISOPROPYL-β-D-Thio-GalactopyrannoSide
BACTH
бактериальный двух гибридный анализ
X-Gal
Broomo-Chloro-Indolyl-Galactopyrannoside
TEV
TEABACCO ETCH VIRUS
мл
Максимальная вероятность
PCA
Основной компонентный анализ
FSC
Фурье корреляции SAX
Saxs
Small-English рентгеновское рассеяние
NSD
Нормализованное пространственное несоответствие
Tss
Субъединица типа 6
Hcp
Корегулируемый белок гемолизина.

ССЫЛКИ

1. Хейс К.С., Аоки С.К., Лоу Д.А. (2010) Бактериальные контактно-зависимые системы доставки. Анну. Преподобный Жене. 44, 71–90 [PubMed] [Google Scholar]2. Сильверман Дж. М., Брюнет Ю. Р., Каскалес Э., Мугус Дж. Д. (2012)Структура и регуляция системы секреции типа VI. Анну. Преподобный Микробиолог. 66, 453–472 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]3. Бенеманн Г., Петросюк А., Могк А. (2010) Трубочки и пончики: история секреции типа VI. Мол. микробиол. 76, 815–821 [PubMed] [Google Scholar]4.Basler M., Pilhofer M., Henderson GP, ​​Jensen GJ, Mekalanos JJ (2012) Секреция типа VI требует динамической сократительной структуры, подобной хвосту фага. Природа 483, 182–186 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]6. Бингл Л.Э., Бейли С.М., Паллен М.Дж. (2008) Секреция типа VI: руководство для начинающих. Курс. мнение микробиол. 11, 3–8 [PubMed] [Google Scholar]8. Бойер Ф., Фихант Г., Бертод Дж., Ванденбрук Ю., Аттри И. (2009) Анализ системы секреции бактерий типа VI с помощью полногеномного анализа in silico: что можно узнать из доступных микробных геномных ресурсов? Геномика BMC 10, 104. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]9. Лейман П.Г., Баслер М., Рамагопал Ю.А., Бонанно Дж.Б., Саудер Дж.М., Пукацки С., Берли С.К., Алмо С.К., Мекаланос Дж.Дж. (2009) Аппарат секреции типа VI и белковые комплексы, связанные с фаговым хвостом, имеют общее эволюционное происхождение. проц. Натл. акад. науч. США 106, 4154–4159 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]10. Пелл Л.Г., Канелис В., Дональдсон Л.В., Хауэлл П.Л., Дэвидсон А.Р. (2009)Структура белка главного хвоста фага лямбда демонстрирует общую эволюцию длиннохвостых фагов и системы секреции бактерий типа VI.проц. Натл. акад. науч. США 106, 4160–4165 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]11. Bönemann G., Pietrosiuk A., Diemand A., Zentgraf H., Mogk A. (2009)Ремоделирование VipA/VipB канальцев с помощью ClpV-опосредованного нанизывания имеет решающее значение для секреции белка типа VI. EMBO J. 28, 315–325 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]12. Lossi NS, Manoli E., Förster A., ​​Dajani R. , Pape T., Freemont P., Filloux A. (2013) Комплекс HsiB1C1 (TssB-TssC) системы секреции Pseudomonas aeruginosa типа VI образует хвостовую оболочку бактериофага структура.Дж. Биол. хим. 288, 7536–7548 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]13. Mougous JD, Cuff ME, Raunser S., Shen A., Zhou M., Gifford CA, Goodman AL, Joachimiak G., Ordoñez CL, Lory S., Walz T., Joachimiak A., Mekalanos JJ (2006) Вирулентность локус Pseudomonas aeruginosa кодирует аппарат секреции белка. Наука 312, 1526–1530 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]14. Осипюк Дж., Сюй С., Цуй Х., Савченко А., Эдвардс А., Йоахимиак А. (2011) Кристаллическая структура секреторного белка Hcp3 из Pseudomonas aeruginosa .Дж. Структура. Функц. Геномика 12, 21–26 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]15. Джобичен С., Чакраборти С., Ли М., Чжэн Дж., Джозеф Л., Мок Ю.К., Леунг К.Ю., Сивараман Дж. (2010) Структурная основа секреции EvpC: ключевой белок системы секреции типа VI из Edwardsiella поздняя . PLoS Один 5, е12910. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]16. Баллистер Э. Р., Лай А. Х., Цукерманн Р. Н., Ченг Ю., Мугус Дж. Д. (2008) Самосборка адаптируемых нанотрубок in vitro из простого строительного блока белка.проц. Натл. акад. науч. США 105, 3733–3738 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]17. Пукатцки С., Ма А.Т., Ревел А.Т., Стертевант Д., Мекаланос Дж.Дж. (2007) Система секреции типа VI перемещает шиповидный белок фагового хвоста в клетки-мишени, где он сшивает актин. проц. Натл. акад. науч. США 104, 15508–15513 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]18. Lossi N.S., Dajani R., Freemont P., Filloux A. (2011) Структурно-функциональный анализ HsiF, gp25-подобного компонента системы секреции типа VI, в Pseudomonas aeruginosa .микробиология 157, 3292–3305 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]20. Капитейн Н., Бонеманн Г., Пьетросюк А., Сейффер Ф., Хауссер И., Локер Дж. К., Могк А. (2013) ClpV рециркулирует канальцы VipA/VipB и предотвращает непродуктивное образование канальцев, чтобы обеспечить эффективную секрецию белка типа VI. Мол. микробиол. 87, 1013–1028 [PubMed] [Google Scholar]21. Брюнет Ю. Р., Эспиноса Л., Харчуни С., Миньот Т., Каскалес Э. (2013) Визуализация уничтожения бактерий, опосредованного секрецией VI типа. Cell Rep. 3, 36–41 [PubMed] [Google Scholar]22.Пьетросюк А., Ленхерр Э.Д., Фальк С., Бонеманн Г., Копп Дж., Зентграф Х., Синнинг И., Могк А. (2011) Молекулярная основа уникальной роли ААА+ шаперона ClpV в секреции белка типа VI. Дж. Биол. хим. 286, 30010–30021 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]23. Канамару С. (2009) Структурное сходство хвостатых фагов и систем секреции патогенных бактерий. проц. Натл. акад. науч. США 106, 4067–4068 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]24. Пукацки С., Ма А. Т., Стертевант Д., Krastins B., Sarracino D., Nelson WC, Heidelberg JF, Mekalanos JJ (2006) Идентификация консервативной системы секреции бактериального белка в Vibrio cholerae с использованием системы модели хозяина Dictyostelium. проц. Натл. акад. науч. США 103, 1528–1533 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]25. Чжэн Дж., Леунг К.Ю. (2007)Рассечение системы секреции типа VI у Edwardsiella tarda . Мол. микробиол. 66, 1192–1206 [PubMed] [Google Scholar]26. Аштген М. С., Гавиоли М., Dessen A., Lloubès R., Cascales E. (2010)Белок SciZ закрепляет энтероагрегативную систему секреции Escherichia coli типа VI на клеточной стенке. Мол. микробиол. 75, 886–899 [PubMed] [Google Scholar]27. Aschtgen M.S., Bernard C.S., De Bentzmann S., Lloubès R., Cascales E. (2008) SciN представляет собой липопротеин наружной мембраны, необходимый для секреции типа VI в энтероагрегантной Escherichia coli . Дж. Бактериол. 190, 7523–7531 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]28. Ма Л.S., Lin J.S., Lai E.M. (2009)Белок семейства IcmF, ImpLM, представляет собой интегральный белок внутренней мембраны, взаимодействующий с ImpKL, и его мотив walker a необходим для опосредованной системой секреции типа VI секреции Hcp в Agrobacterium tumefaciens . Дж. Бактериол. 191, 4316–4329 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]29. Фелисберто-Родригес К., Дюран Э., Аштген М.С., Бланги С., Ортис-Ломбардия М., Доузи Б., Камбийо К., Каскалес Э. (2011) На пути к структурному пониманию систем секреции бактерий типа VI: характеристика комплекс ЦсЖ-ЦсМ патовара Escherichia coli .PLoS Патог. 7, e1002386. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]30. Aschtgen MS, Zoued A., Lloubès R., Journet L., Cascales E. (2012) Субъединица TssL, закрепленная на C-хвосте, важный белок энтероагрегативной системы секреции Escherichia coli Sci-1 Type VI, вставляется с помощью жидк. микробиологияopen 1, 71–82 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]31. Durand E., Zoued A., Spinelli S., Watson PJ, Aschtgen MS, Journet L., Cambillau C., Cascales E. (2012) Структурная характеристика и олигомеризация белка TssL, компонента, общего для бактерий типа VI и типа Системы секреции IVb.Дж. Биол. хим. 287, 14157–14168 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]32. Аштген М.С., Томас М.С., Каскалес Э. (2010)Привязка системы секреции типа VI к пептидогликану: TssL, TagL, TagP. что еще? Вирулентность 1, 535–540 [PubMed] [Google Scholar]33. Casabona MG, Vandenbrouck Y., Attree I., Couté Y. (2013)Протеомная характеристика внутренней мембраны Pseudomonas aeruginosa PAO1. протеомика 13, 2419–2423 [PubMed] [Google Scholar]34. Брюне Ю.Р., Бернард К.С., Gavioli M., Lloubès R., Cascales E. (2011)Эпигенетический переключатель, включающий перекрывающийся мех и метилирование ДНК, оптимизирует экспрессию кластера генов секреции VI типа. Генетика PLoS. 7, е1002205. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]35. Даценко К. А., Ваннер Б. Л. (2000) Одноэтапная инактивация хромосомных генов у Escherichia coli K-12 с использованием продуктов ПЦР. проц. Натл. акад. науч. США 97, 6640–6645 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]36. ван ден Энт Ф., Лёве Дж. (2006) RF-клонирование: метод без ограничений для вставки генов-мишеней в плазмиды.Дж. Биохим. Биофиз. Методы 67, 67–74 [PubMed] [Google Scholar]37. Каримова Г., Пиду Дж., Ульманн А., Ладан Д. (1998) Бактериальная двухгибридная система, основанная на восстановленном пути передачи сигнала. проц. Натл. акад. науч. США 95, 5752–5756 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]38. Баттести А., Бувере Э. (2012)Бактериальная двухгибридная система, основанная на восстановлении аденилатциклазы в Escherichia coli . Методы 58, 325–334 [PubMed] [Google Scholar]39. Шиара Г., Блэнджи С., Siponen M., Mc Grath S., van Sinderen D., Tegoni M., Cambillau C., Campanacci V. (2008) Топологическая модель базовой пластины лактококкового фага Tuc2009. Дж. Биол. хим. 283, 2716–2723 [PubMed] [Google Scholar]40. Танг Г., Пэн Л., Болдуин П.Р., Манн Д.С., Цзян В., Рис И., Людтке С.Дж. (2007) EMAN2: расширяемый пакет обработки изображений для электронной микроскопии. Дж. Структура. биол. 157, 38–46 [PubMed] [Google Scholar]41. Шейх Т. Р., Гао Х., Бакстер В. Т., Астуриас Ф. Дж., Буассе Н., Лейт А., Фрэнк Дж.(2008)Обработка изображений SPIDER для одночастичной реконструкции биологических макромолекул по электронным микрофотографиям. Нац. протокол 3, 1941–1974 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]43. Шерес С.Х., Нуньес-Рамирес Р., Сорзано К.О., Каразо Дж.М., Марабини Р. (2008)Обработка изображений для анализа отдельных частиц с помощью электронной микроскопии с использованием XMIPP. Нац. протокол 3, 977–990 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]44. ван Хил М., Шац М. (2005) Пороговые критерии корреляции оболочки Фурье.Дж. Структура. биол. 151, 250–262 [PubMed] [Google Scholar]45. Конарев П.В., Волков В.В., Соколова А.В., Кох М.Х.Дж., Свергун Д.И. (2003) PRIMUS: система на базе Windows для анализа данных малоуглового рассеяния. Дж. Заявл. Кристаллогр. 36, 1277–1282 [Google Scholar]46. Конарев П.В., Петухов М.В., Волков В.В., Свергун Д.И. (2006) ATSAS 2.1, пакет программ для анализа данных малоуглового рассеяния. Дж. Заявл. Кристаллогр. 39, 277–286 [Google Scholar]47. Гинье А. (1939) Дифракция участков X на малых углах: применение в исследованиях ультрамикроскопических явлений.Анна. физ. 12, 161–237 [Google Scholar]48. Свергун Д.И. (1992) Определение параметра регуляризации в методах косвенного преобразования с использованием перцептивных критериев. Дж. Заявл. Кристаллогр. 25, 495–503 [Google Scholar]49. Франке Д., Свергун Д. И. (2009) DAMMIF, программа для быстрого определения формы ab-initio при малоугловом рассеянии. Дж. Заявл. Кристаллогр. 42, 342–346 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]50. Волков В.В., Свергун Д.И. (2003) Однозначность определения формы ab initio при малоугловом рассеянии.Дж. Заявл. Кристаллогр. 36, 860–864 [Google Scholar]51. Козин М.Б., Свергун Д.И. (2001) Автоматическое согласование структурных моделей высокого и низкого разрешения. Дж. Заявл. Кристаллогр. 34, 33–41 [Google Scholar]52. Чжэн Дж., Хо Б., Мекаланос Дж. Дж. (2011)Генетический анализ антиамебной и антибактериальной активности системы секреции типа VI у Vibrio cholerae . PLoS Один 6, е23876. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]53. Лин Дж. С., Ма Л. С., Лай Э. М. (2013)Систематическое вскрытие системы секреции агробактерий типа VI выявляет механизмы и секретируемые компоненты для формирования субкомплексов.PLoS Один 8, е67647. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Что такое компьютерное зрение? | IBM

Ученые и инженеры уже около 60 лет пытаются разработать способы, с помощью которых машины смогут видеть и понимать визуальные данные. Эксперименты начались в 1959 году, когда нейрофизиологи показали кошке набор изображений, пытаясь сопоставить реакцию ее мозга. Они обнаружили, что он сначала реагирует на резкие края или линии, и с научной точки зрения это означает, что обработка изображений начинается с простых форм, таких как прямые края. (2)

Примерно в то же время была разработана первая компьютерная технология сканирования изображений, позволяющая компьютерам оцифровывать и получать изображения. Еще одна веха была достигнута в 1963 году, когда компьютеры смогли преобразовывать двухмерные изображения в трехмерные формы. В 1960-х годах ИИ стал академической областью исследования, и это также положило начало поиску ИИ для решения проблемы человеческого зрения.

В 1974 году была представлена ​​технология оптического распознавания символов (OCR), которая могла распознавать текст, напечатанный любым шрифтом или гарнитурой. (3) Аналогичным образом интеллектуальное распознавание символов (ICR) может расшифровывать рукописный текст с помощью нейронных сетей. (4) С тех пор OCR и ICR нашли свое применение в обработке документов и счетов, распознавании автомобильных номеров, мобильных платежах, машинном переводе и других распространенных приложениях.

В 1982 году нейробиолог Дэвид Марр установил, что зрение работает иерархически, и ввел для машин алгоритмы обнаружения краев, углов, кривых и подобных основных форм.Одновременно ученый-компьютерщик Кунихико Фукусима разработал сеть клеток, способных распознавать закономерности. Сеть, получившая название Неокогнитрон, включала в себя сверточные слои нейронной сети.

К 2000 году основное внимание в исследованиях было уделено распознаванию объектов, а к 2001 году появились первые приложения для распознавания лиц в реальном времени. Стандартизация того, как наборы визуальных данных помечаются и аннотируются, появилась в 2000-х годах. В 2010 году стал доступен набор данных ImageNet. Он содержал миллионы помеченных изображений в тысячах классов объектов и обеспечивает основу для CNN и моделей глубокого обучения, используемых сегодня.В 2012 году команда из Университета Торонто представила CNN для участия в конкурсе по распознаванию изображений. Модель под названием AlexNet значительно снизила количество ошибок при распознавании изображений. После этого прорыва количество ошибок снизилось до нескольких процентов. (5)

Pokémon Go Октябрь 2021 г. Задачи полевых исследований и руководство по прорыву

Эволюция покемона Встреча с Иви
Включите покемонов 3 раза Встреча Чармандера, Сквиртла или Бульбазавра
Включите покемонов 5 раз Встреча с Чикоритой, Синдакилом или Тотодайлом
Усильте покемона 7 раз Встреча с Трико, Торчиком или Мадкипом
Сделать снимок дикого покемона Встреча с Муркроу, Хоппипом или Янмой
Сделать 2 снимка диких покемонов призрачного типа Встреча с Шуппетом
Вылупившееся яйцо Встреча с Мантином или Пинсиром
Выведение 2 яиц Встреча с Белдумом
Spin 3 Poké Stops или тренажерные залы Встреча с Судовудо
Spin 5 Poké Stops или тренажерные залы Встреча с Ральтсом
Прогулка 2 км Встреча с Трико, Торчиком или Мадкипом
Очистить 3 теневых покемонов Встреча с медлительным
Заработайте 3 сердца вместе с другом Встреча с Пучиной
Подарить другу Встреча со Спинараком
Торговля покемонами Встреча с двебблами
Заработайте 2 конфеты, прогуливаясь с другом Встреча с Баннелби
Заработайте 3 конфеты, прогуливаясь с приятелем Столкновение со Станфиском или Соболем
Поймать теневого покемона Встреча с Ароном
Поймать покемона драконьего типа Встреча с Дратини или Багоном
Используйте 3 ягоды пинап, чтобы поймать покемона Встреча с криками
Поймать 5 покемонов с погодным ускорением Встреча Поливага, Вульпикса, Бегемота или Сновера
Поймать 5 покемонов Жуткая встреча
Поймай 7 покемонов Встреча с Магикарпом
Поймать 18 призрачных покемонов Встреча со спиритомбом
Поймать 18 покемонов темного типа Встреча со спиритомбом
Выиграйте уровень 3 высшего рейда Встреча Кабуто или Оманита
Победить в рейде Встреча с Литвиком
Победить в 5 рейдах Встреча с аэродактилем
Выиграйте битву тренеров в Go Battle League Карробласт
Победите 3 Team Go Rocket ворчит Встреча со Скайтером
Сделать 5 отличных бросков подряд Встреча со Спиндой
Сделать 3 отличных броска Встреча с Аноритом, Снаббуллом или Лилипом
Сделать 3 отличных броска подряд Встреча с Ониксом
Сделать 5 хороших бросков Встреча с Данспарсом
Сделать 5 хороших бросков подряд Встреча с Гондуром
Сделать 3 отличных броска подряд Встреча с Гиблом
Сделать 2 отличных броска Встреча с Алоланом Граймером
Включите покемонов 5 раз 10 Мега Бластойз или Чаризард Энерджи
Включите покемонов 5 раз 10 Мега Пиджот Энерджи
Использовать 10 сверхэффективных заряженных атак 20 Мега Генгар Энергия
Поймать 10 покемонов обычного типа 10 Мега Пиджот Энерджи
Спин 10 покестопов или тренажерных залов 200 звездной пыли, 3 ягоды разз, ягода пинап, 5 серебряных ягод пинап или 5 покеболов
Поймать 10 покемонов 200 звездной пыли, 3 ягоды разза, 1 ягода пинап или 5 покеболов
Поймать 5 покемонов с погодным ускорением 200 звездной пыли, 3 ягоды разза, 1 ягода пинап или 5 покеболов
Поймать покемона драконьего типа 1500 звездной пыли, 3 редких конфеты, 2 ягоды золотого разза или 10 ультрашариков
Используйте 5 ягод, чтобы помочь поймать покемона 500 звездной пыли, 6 ягод разза, 2 ягоды пинап или 5 больших шаров
Поймать 10 покемонов с погодным ускорением 500 звездной пыли, 6 ягод разза, 2 ягоды пинап или 5 больших шаров
Поймать 10 покемонов обычного типа 500 звездной пыли, 6 ягод разза, 2 ягоды пинап или 5 больших шаров
Поймай то же самое 1500 звездной пыли, 3 редких конфеты, 2 ягоды золотого разза или 10 ультрашариков
Сделать 3 отличных броска 200 звездной пыли, 3 ягоды разза, 1 ягода пинап или 5 покеболов
Сделать 5 хороших бросков 200 звездной пыли, 3 ягоды разза, 1 ягода пинап или 5 покеболов
Сделать 2 хороших броска крученым мячом подряд 200 звездной пыли, 3 ягоды разза, 1 ягода пинап или 5 покеболов
Сделать 5 бросков крученым мячом подряд 500 звездной пыли, 6 ягод разза, 2 ягоды пинап или 5 больших шаров
Сделать 3 хороших броска подряд 500 звездной пыли, 2 ягоды пинапа, 5 отличных мячей или 2 ультрашара
Сделать отличный бросок 500 звездной пыли, 2 ягоды пинапа, 5 отличных мячей или 2 ультрашара
Сделать 3 отличных броска крученым мячом 1000 звездной пыли, 1 редкая конфета, 9 ягод разза, 3 ягоды пинап, 10 покеболов или 5 ультрашаров
Сделать 3 отличных броска подряд 1500 звездной пыли, 3 редких конфеты, 2 ягоды золотого разза или 10 ультрашариков
Заработайте 3 сердца вместе с другом 2 серебряных ягоды пинап
При поддержке: Отправить 3 подарка друзьям 1000 звездной пыли или редкая конфета
При поддержке: Поймай 8 покемонов 1000 звездной пыли или редкая конфета

Общие обсуждения Life is Strange™

А если серьезно, у Хлои было 2 пистолета: один от Фрэнка, а другой от Натана.Разве она не могла просто отдать пистолет Натана Максу? Даже если Макс никогда не давали огнестрельное оружие для упаковки, то Хлоя должна была ехать подбоченясь с обоими пистолетами и ректом мистера Джефферсона. Тсск… Тсск… Также я ставлю свои деньги на то, что Фрэнк* спасет Макс, но дела идут к (не очень хорошим местам), но она все еще может перематывать фото Уоррена и спасать всех, вероятно, убив Хлою, так как ее судьба заключалась в том, чтобы всегда умирать, поэтому единственный серьезный конфликт слияния в пространстве-времени — это то, что она вообще жива.Слезы брызнут, а кусты попадут в поле зрения еще более могущественного безумного Макса. 😉 Смотри, что я сделал… неважно.

Фрэнк — рой бабочек-убийц, высасывающих жизнь и душу из мистера Джефферсона в жестокой, кровавой сцене смерти. Или… тот олень, который преследовал Макса, превращается в милого антропоморфного демона, который втыкает свои злые рога в живот мистера Джефферсона, а затем продолжает злобно трясти окровавленной горящей головой, разрывая мистера Джефферсона в небытие… что так случается с призвать забвение на Аркадию* Бэй.

Аркадия в греческом митосе любима за то, что она «нетронутая, гармоничная дикая местность», поэтому, когда она находится и в пространстве (строительство квартиры и разгневанные туземцы), и во времени (спасение жизни Хлои), она пытается исправиться. Подобно тому, как Аркадия подверглась лесным пожарам в 2007 году, чтобы избавиться от электростанции Мегалополи, которая начала работу в 1970 году; это то же самое точное действие и реакция на макрокосм действий Макса, которые бросают его в надвигающуюся бурю, предвещаемую в первом эпизоде.А Мегалополис был одним из первых урбанизированных районов в Аркадии, в котором были школы (Академия Блэквелл), магазины (Закусочная «Два кита»), церкви (Вихревой клуб, те, кто публиковал предупреждения о последних днях и предвидел это еще до того, как Макс получила ее). видение), отели и другие услуги (новые жилые комплексы и другие строительные разработки, запланированные прескоттами, и их дуга — темная комната). Видите развивающийся паттерн? Давайте еще раз посмотрим…

Нет, я просто шучу.Я не какой-то конспиролог, однако это была просто шутка, однако из-за статистики я собираюсь сказать, что эти связи могли быть преднамеренными и преднамеренными с самого начала. И так как большая часть игры уже смоделирована, затекстурирована и развёрнута. Этот следующий эпизод, вероятно, будет немного легче сделать (если вы сможете вернуться в прошлое после пьяной фотосессии Уоррена на контрольно-пропускном пункте), поэтому возможность «Фрэнка» спасти Макса еще не исключена. KEK

Я должен написать для этой игры.
Черт возьми, я разработчик игр…
Почему бы мне просто не сделать чертовски лучшую сюжетную игру с кучей нелепых возможностей?
Это должно произойти.
Это игра моей мечты.
Но сначала набросаю на шпагат, опубликую историю на кикстартере, соберу 10000, потом начну моделировать, ригать и анимировать, писать сценарии, а заодно пойду в художественную школу, так что будет желающий хороший голос актеры, они будут записаны на новом оборудовании, купленном на кикстартере, и я закончу игру в качестве ведущего дизайнера, кое-где работая по контракту на лицензирование музыки для маркетинга.
Что сказать?

LOL, шучу… если только ты не шутишь. В таком случае я не. Пожалуйста, дайте мне денег.

«Молодой Валландер», сезон 2: все, что мы знаем в преддверии февраля 2022 г. Дата выхода

Молодой Валландер — Изображение: Netflix

Молодой Валландер вернется во 2-м сезоне в феврале 2022 года, и, хотя отзывы были неоднозначными, сериал вызвал отклик и получил второй сезон. Вот последняя информация обо всем, что мы знаем о втором сезоне сериала «Молодой Валландер ».

Для тех, кто не в курсе, сериал основан на популярной франшизе Хеннига Манкелла, которая ранее была адаптирована в виде сериала BBC, Валландер .

Шоу было продлено еще в ноябре 2020 года, всего через пару месяцев после его дебюта в сентябре 2020 года. С таким сверхбыстрым продлением вы, возможно, подумали, что у нас будет второй сезон в 2021 году (Deadline даже сообщил, что это будет случае), но этого не произошло.

Young Wallander имел успех, особенно в Швеции, где ему удавалось оставаться в топ-10 чартов в общей сложности 35 дней.Он также хорошо зарекомендовал себя в других странах Северной Европы. В Соединенных Штатах сериал появлялся в топ-10 только 3 дня, а в Соединенном Королевстве — 8 дней.

18 января 2022 года Netflix представил 2-й сезон, который будет проходить под подзаголовком « Молодой Валландер: Тень убийцы ».

Новый тизер (приведен ниже) сопровождался подписью:

«Возможно ли вернуться после того, как вы думали, что оставили все позади? Курт Валландер погрузится в новое дело в фильме «Молодой Валландер: Тень убийцы»

Первый взгляд на второй сезон #YoungWallander под названием «Тень убийцы», который выйдет на Netflix 17 февраля.https://t.co/HJxtzTkrjl pic.twitter.com/CHl2LWRJoS

— Что на Netflix (@whatonnetflix) 18 января 2022 г.


Чего ожидать от юного Валландера 2 сезон

Благодаря пресс-релизу, отправленному шведскому изданию Moviezine от Адама Полссона, он рассказал несколько вещей о новом сезоне.

В переводе на английский он сказал розетке:

«Я думаю, что новый кейс будет более живым, более захватывающим и еще более захватывающим. Мы идем дальше, и история расширяется, когда мы еще больше узнаем Резу, Раска, Мону и других персонажей.Мы словно нашли дом: мы лучше знаем вселенную и героев, знаем, какой палитрой рисовать и каким прикосновением»

У нас будет новый босс, который возьмет на себя бразды правления отделом по тяжким преступлениям, который вернет Курта Валландера в свои ряды (подробнее о роли этого персонажа ниже).

Во втором сезоне Валландер принимает предложение вернуться и получает задание раскрыть, казалось бы, простое дело: инцидент с заражением возле оживленного ночного клуба.


Сколько серий будет во 2 сезоне сериала «Молодой Валландер»?

Во втором сезоне снова будет шесть эпизодов. Продолжительность не была объявлена, но мы знаем, какие эпизоды будут снимать Йенс Йонссон и Мани Мазеррат во втором сезоне.


Кто вернулся и кто новичок в актерском составе 2 сезона «Молодого Валландера»?

Подтверждено, что только Адам Полссон и Ясен Атур (который играет Курта Валландера и Резу Аль-Рахмана соответственно) вернутся во 2-й сезон сериала Валландер .

В список «Молодой Валландер сезона 2» добавлен ряд новых актеров.

Томива Эдун был выбран на роль Самуэля Осея во втором сезоне. На протяжении многих лет Эдун играл разные роли, включая роль Эдди в сериале Netflix «, что случилось в понедельник, ». У него также были роли в Доктор Кто , Золушка, и Мерлин . Как упоминалось выше, Сэмюэл станет новым боссом, взяв на себя управление подразделением по тяжким преступлениям.

Во-вторых, у нас есть Лиза Хаммонд, которая сыграет Роберту Модин в новом сезоне. Хаммонд известен ролями в таких играх, как EastEnders и Vera .

Молодой Валландер сезон 2 – Изображение: Yellowbird


Когда 2 сезон Валландера выйдет на Netflix?

Сериал возвращается в феврале 2022 года. В частности, весь второй сезон (снова названный «Тень убийцы») выйдет на Netflix 17 февраля 2022 года.

Для заядлых Юных поклонников Валландера мы рекомендуем вам ознакомиться с некоторыми дополнениями, которые Netflix все еще смотрит на Netflix, которые были загружены за последний год или около того.Лучшее видео — это интервью, в котором актеры рассказывают о своем пребывании на съемочной площадке.

Также стоит отметить, что Yellowbird, продюсерская компания Young Wallander, работает над своим следующим крупным проектом Netflix в форме Spotify Untold .

Вы с нетерпением ждете 2 сезона сериала Молодой Валландер ? Дайте нам знать об этом в комментариях.

COVID-19: Целевая группа отказывается от всеобщих блокировок

Источник изображения: PTI/ПРЕДСТАВИТЕЛЬ.

Оперативная группа говорит, что нет общих ограничений COVID.

Lancet Комиссия по Covid-19 Целевая группа Индии не рекомендовала полную блокировку на национальном уровне или на уровне штата, в отличие от локализованных, поэтапных ограничений или закрытий.

В его отчете говорится, что опыт прошлого года показал, что экономические закрытия наиболее разрушительны для беднейших слоев общества. В городских районах работники, получающие поденную заработную плату, работники неформального сектора и низкоквалифицированные работники чаще всего обеднеют из-за сбоев в экономической деятельности.

Тем не менее, опыт других стран показал, что блокировки действительно помогают снизить скорость передачи.

В Индии потребуется средний подход. «Мы рекомендуем, чтобы в районах с высоким уровнем заражения основное внимание уделялось разрыву цепочки передачи посредством местных действий. Мы рекомендуем выпускать рекомендации, настоятельно призывающие всех, кто может оставаться дома (например, белых воротничков, которые могут работать из дома) для этого», — говорится в сообщении.

«Мы также рекомендуем закрыть места, где собираются большие собрания, и запретить мероприятия, поощряющие большие собрания», — добавил он.Но ограничения на передвижение или работу работающей городской и сельской бедноты должны быть сведены к минимуму и определяться на местном уровне путем создания микрозон сдерживания в районах с высокой заболеваемостью.

Решения о местной изоляции или комендантском часе лучше оставить на усмотрение местных властей, и они должны основываться на местных тенденциях эпидемиологических данных (передача, показатели положительных результатов тестов, госпитализации и показатели смертности). Эти решения должны приниматься после подробных консультаций с местными предприятиями, общественными лидерами и ассоциациями работников.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.