Канейра — это… Что такое Канейра?
Марко Канейра (порт. Marco Caneira; род. 9 февраля 1979, Синтра) — португальский футболист.
Биография
Клубная карьера
Марко Канейра начал свою футбольную карьеру в 1995 году, в молодёжном составе португальского клуба «Спортинг» из Лиссабона. В 1997 году Канейра числился уже в основной команде клуба, проведя один матч Марко был отдан в аренду клубу «Салгейрош». В составе «Салгейроша» молодой защитник провёл всего 3 матча. По окончании аренды Марко был вновь отдан в аренду, на этот раз в клуб «Бейра-Мар». В составе «Бейра-Маре» Канейра получил место в основном составе. В чемпионате Португалии сезона 1998/1999 Марко провёл 12 матчей, а его клуб занял 16 место в чемпионате.
Сезон 1999/2000 Марко вновь провёл в аренде, на этот раз в клубе «Алверка», в котором Канейра провёл 17 матчей. Вернувшись из аренды в «Спортинг» Канейра был продан итальянскому «Интеру». В «Интере» Канейра так и не провёл ни одного матча, так как находился постоянно в аренде, с 2000 по 2001 год в итальянской «Реджине», с 2001 по 2002 год в португальской «Бенфике», с 2002 по 2003 год во французском «Бордо».
Став игроком «Бордо» Канейра за сезон провёл 35 матчей, после чего в 2004 году был отдан в аренду испанской «Валенсии». В 2004 году в матче Лиги Чемпионов Марко отметился двумя забитыми мячами в ворота «Бордо», в том же году Марко стал обладателем суперкубка Европы, хотя Марко так и не вышел на поле, так был в запасе. В «Валенсии» Марко сразу закрепился в основном составе, в чемпионате Испании сезона 2004/2005 Марко провёл 25 матчей и забил один мяч. После окончания аренды «Валенсия» выкупила у «Бордо» права на Канейру. В сезоне 2005/2006 Марко сыграл всего пять матчей. В январе 2006 года Марко был отдан в аренду своему бывшему клубу «Спортингу».
В «Спортинге» Канейра стал неотъемлемой частью обороны португальского клуба. Марко так же отметился голом в матче Лиги Чемпионов сезона 2006/2007 против итальянского «Интера», который состоялся 12 сентября 2007 года, матч закончился со счётом 1:0.
В составе «Спортинга» Марко став обладателем кубка Португалии 2007 года. В августе 2007 года Марко вернулся в «Валенсию», в которой провёл ещё 17 матчей и стал обладателем кубка Испании. 25 июня 2008 года Канейра подписал четырёхлетний контракт со «Спортингом»[1], сумма трансфера сделки между клубами не разглашалась.
Карьера в сборной
Свой путь в национальной сборной Португалии Марко начал с выступлений за юношескую сборной Португалии (до 16 лет), с которой Канейра выиграл юношеский Чемпионат Европы 1995 года. Марко так же выступал за молодёжную сборную (до 18 лет), с которой выиграл молодёжный чемпионат Европы 1997 года. С 1998 года Марко провёл несколько матче за молодёжную сборную Португалии до (21 года).
В 2002 году Марко получил вызов из первой сборной, для того что бы принять участие в товарищеском матче. Канейра попал в список футболистов, которым предстояло участие на Чемпионате Мира 2002 года, но на Канейра та и не сыграл ни одного матча в континентальном первенстве.
В 2006 году Канейра так же был в составе сборной Португалии на Чемпионате Мира 2006, на котором его сборная заняла четвёртое место.
Достижения
Примечания
Ссылки
definition of ВЕЛОЗУ МИГЕЛ and synonyms of ВЕЛОЗУ МИГЕЛ (Russian)
Материал из Википедии — свободной энциклопедии
| Мигел Велозу | ||
| Общая информация | ||
| Полное имя | Мигел Луиш Пинту Велозу | |
| Родился | 11 мая 1986(1986-05-11) (24 года) Коимбра, Португалия | |
| Гражданство | Португалия | |
| Рост | 180 см | |
| Вес | 79 кг | |
| Позиция | опорный полузащитник | |
| Информация о клубе | ||
| Клуб | Спортинг (Лиссабон) | |
| Номер | 24 | |
| Карьера | ||
| Молодёжные клубы | ||
|---|---|---|
| 2000—2005 | Спортинг (Лиссабон) | |
| Клубная карьера* | ||
| 2005—2006 | → Оливайш и Москавиди | 28 (7) |
2006—н. в. | Спортинг (Лиссабон) | 88 (3) |
| Национальная сборная** | ||
| 2007—н.в. | Португалия | 10 (1) |
* Количество игр и голов за профессиональный клуб считается только для различных лиг национальных чемпионатов, откорректировано по состоянию на 30 августа 2009. ** Количество игр и голов за национальную сборную в официальных матчах, откорректировано по состоянию | ||
Миге́л Луи́ш Пи́нту Вело́зу (порт. Miguel Luís Pinto Veloso; родился 11 мая 1986 года, Коимбра) — португальский футболист, центральный и опорный полузащитник лиссабонского «Спортинга» и национальной сборной Португалии.
Клубная карьера
Велозу попытался начать свою футбольную карьеру в «Бенфике», где его отец Антонио Велозу был капитаном и играл на позиции защитника в течение многих лет, но не был принят в команду из-за избыточного веса. Позднее он был принят в стан главных соперников «Бенфики» — «Спортинг», где играл на протяжении 5 лет, и в сезоне 2004—2005 его взяли в главную команду.
Свою футбольную карьеру Велозу начинал на позиции центрального защитника.
Для получения опыта и навыков в 2005 году Мигел был отправлен в аренду в «Оливайш и Москавиди». В результате хорошей игры, показанной в клубе второго дивизиона, Велозу вернулся обратно в «Спортинг». Дебют Велозу за «Спортинг» был в матче Лиге чемпионов против «Интера». «Спортинг» выиграл со счётом 1-0, а Мигел Велозу был признан лучшим игроком матча. Велозу стал проходить в основной состав команды, выдерживая конкуренцию с более опытными игроками, такими как Тонел, Андерсон Полга, Куштодиу, Марко Канейра.
В январе 2007 года Велозу продлил контракт со «Спортингом» до 2013 года[1].
Международная карьера
После хорошего выступления Велозу на чемпионате Европы среди молодежных команд в 2007 году, тренер сборной Португалии Луис Фелипе Сколари вызвал Мигела в основную команду. Дебют Велозу за сборную Португалии состоялся 13 октября 2007 года в матче против сборной Азербайджана.
Первый гол за национальную команду Мигел Велозу забил 14 октября 2008 года в отборочном турнире к чемпионату мира по футболу против сборной Мальты.
Достижения
Примечания
Ссылки
définition de %d0%9a%d0%b0%d0%bd%d0%b5%d0%b9%d1%80%d0%b0,_%d0%9c%d0%b0%d1%80%d0%ba%d0%be et synonymes de %d0%9a%d0%b0%d0%bd%d0%b5%d0%b9%d1%80%d0%b0,_%d0%9c%d0%b0%d1%80%d0%ba%d0%be (russe)
%d0%9a%d0%b0%d0%bd%d0%b5%d0%b9%d1%80%d0%b0,_%d0%9c%d0%b0%d1%80%d0%ba%d0%be : définition de %d0%9a%d0%b0%d0%bd%d0%b5%d0%b9%d1%80%d0%b0,_%d0%9c%d0%b0%d1%80%d0%ba%d0%be et synonymes de %d0%9a%d0%b0%d0%bd%d0%b5%d0%b9%d1%80%d0%b0,_%d0%9c%d0%b0%d1%80%d0%ba%d0%be (russe) Contenu de sensagent- définitions
- synonymes
- antonymes
- encyclopédie
- определение
- синоним
dictionnaire et traducteur pour sites web
Alexandria
Une fenêtre (pop-into) d’information (contenu principal de Sensagent) est invoquée un double-clic sur n’importe quel mot de votre page web. LA fenêtre fournit des explications et des traductions contextuelles, c’est-à-dire sans obliger votre visiteur à quitter votre page web !
Essayer ici, télécharger le code;
Solution commerce électronique
Augmenter le contenu de votre site
Ajouter de nouveaux contenus Add à votre site depuis Sensagent par XML.
Parcourir les produits et les annonces
Obtenir des informations en XML pour filtrer le meilleur contenu.
Indexer des images et définir des méta-données
Fixer la signification de chaque méta-donnée (multilingue).
Renseignements suite à un email de description de votre projet.
Lettris
Lettris est un jeu de lettres gravitationnelles proche de Tetris. Chaque lettre qui apparaît descend ; il faut placer les lettres de telle manière que des mots se forment (gauche, droit, haut et bas) et que de la place soit libérée.
boggle
Il s’agit en 3 minutes de trouver le plus grand nombre de mots possibles de trois lettres et plus dans une grille de 16 lettres. Il est aussi possible de jouer avec la grille de 25 cases. Les lettres doivent être adjacentes et les mots les plus longs sont les meilleurs. Participer au concours et enregistrer votre nom dans la liste de meilleurs joueurs ! Jouer
Dictionnaire de la langue française
Principales Références
La plupart des définitions du français sont proposées par SenseGates et comportent un approfondissement avec Littré et plusieurs auteurs techniques spécialisés.
Le dictionnaire des synonymes est surtout dérivé du dictionnaire intégral (TID).
L’encyclopédie française bénéficie de la licence Wikipedia (GNU).
Traduction
Changer la langue cible pour obtenir des traductions.
Astuce: parcourir les champs sémantiques du dictionnaire analogique en plusieurs langues pour mieux apprendre avec sensagent.
6021 visiteurs en ligne
calculé en 0,063s
allemand anglais arabe bulgare chinois coréen croate danois espagnol espéranto estonien finnois français grec hébreu hindi hongrois islandais indonésien italien japonais letton lituanien malgache néerlandais norvégien persan polonais portugais roumain russe serbe slovaque slovène suédois tchèque thai turc vietnamien
allemand anglais arabe bulgare chinois coréen croate danois espagnol espéranto estonien finnois français grec hébreu hindi hongrois islandais indonésien italien japonais letton lituanien malgache néerlandais norvégien persan polonais portugais roumain russe serbe slovaque slovène suédois tchèque thai turc vietnamien
Yannick Nézet-Séguin – Askonas Holt
«Дирижер добавляет французский колорит Роттердамскому филармоническому оркестру
В Пятой симфонии Прокофьева, с которой началась программа, Незе-Сеген раскрасил бравурную игру ансамбля и сочные краски отчетливым французским акцентом.
Пикантная вступительная мелодия в октавах деревянных духовых инструментов, например, сигнализировала о том, что Незе-Сеген начинает получать от исполнителей очень утонченное и элегантное звучание. Было также много сфокусированной силы, вторая часть и финал были сняты в быстром клипе, но никогда не перегружены.
Напротив, более личная, а иногда и мучительная Пятая симфония Чайковского была пронизана теплом и пугающим ритмическим контролем, особенно в заключительной части. Контролируемая самоотверженность Незе-Сегена, наряду с его способностью вызывать в воображении мириады цветов и безупречную игру оркестра, поддерживали внутреннюю драму партитуры.
… Каждая часть оркестра демонстрировала четкую идентичность, но лучшим достижением Незе-Сегена, возможно, является то, как тонко он смешивал яркие деревянные духовые, теплые медные медные, темные струнные и перкуссию, сохраняя при этом надежную фиксацию всеобъемлющей структуры каждой симфонии.
Рик Шульц, Los Angeles Times, 11 февраля 2015 г.
«Роттердам демонстрирует свою утонченность… Незе-Сеген создает впечатляющую программу Роттердамского филармонического оркестра… Музыканты Роттердамского филармонического оркестра продемонстрировали чувствительность и утонченность, но, прежде всего, музыкальную гибкость и сверхъестественная способность стать продолжением своего дирижера.
Незе-Сеген — кто угодно, только не диктатор на подиуме, и тем не менее его влияние было очевидно в каждом такте программы.Если симфонический оркестр в каком-то смысле является музыкальным инструментом, на котором играет дирижер, редко можно увидеть, чтобы он демонстрировался в такой экстремальной манере и с такими превосходными результатами.
Незе-Сеген сродни скульптору. Он всегда формирует, реформирует, смотрит под другим углом, обращает внимание на детали, не забывая при этом о более широкой форме, и удивительным было то, как оркестр реагировал на каждое его движение, будь то такое тонкое, как задержка окончания фразы всего на мгновение.
прикосновение, или столь ярко выраженное, как взрывное завершение произведения.
Однако в концерте Равеля все стали продолжением Гримо. Незе-Сеген, казалось, была в своей голове, что немаловажно, учитывая, что она играет с сочетанием спонтанности и своеволия, и, за неимением лучшего описания, с необычайной музыкальной честностью».
James Chute, San Diego Union-Tribune, 14 февраля 2015 г.
«… RPhO потребовалось всего около восьми минут, продолжительность второй части Пятой симфонии Прокофьева, чтобы убедительно и недвусмысленно доказать, что это просто фантастический оркестр. , и что Янник Незе-Сеген — феноменальный дирижер.
Энергия этой второй части, обозначенной Allegro marcato, заключает в себе замечательное взаимодействие между Незе-Сегеном и RPhO в его наиболее сжатой форме. Было интересно увидеть его за работой с оркестром.
Мастерский манипулятор, его руки и глаза повсюду. Дирижируя с широкими плечами, широко раскинув руки и без палочки, он массирует оркестр, отмечает каждую деталь, извлекает фразы, формирует мелодические линии и динамику, в то время как его музыканты реагируют с точностью до доли секунды.
Если Незе-Сеген выступал в качестве музыкального манипулятора в симфонии Прокофьева, то в соль-мажорном исполнении Концерта для фортепиано с оркестром соль мажор Равеля он играл скорее посредническую роль.
Не вмешиваясь, он соединил солиста и оркестр, воспользовавшись медитативным духом тщательно выстроенного вступительного заявления Гримо в центральной части (Adagio assai) и мягко накинув оркестр на фортепианную партию, которая превратилась внутрь в простую последовательность аккомпанирующих аккордов. .
Сюита Равеля из пяти частей Ma Mère l’Oye (Матушка Гусыня), которая открыла концерт в понедельник вечером, показала Незе-Сеген в еще одной роли ведущего. С минимальным вмешательством он позволил музыке Равеля раскрыться и естественно исходить из оркестра».
Нильс Свинкелс, San Francisco Classical Voice, 19 февраля 2015 г.
«Одним красноречивым штрихом в элегантной и обманчиво требовательной сюите Равеля «Мать Гусыня» Незе-Сеген продемонстрировал свой характер первоклассного маэстро.
Техническое изящество и выразительная чувственность маэстро, родившегося в Монреале, продемонстрированные в этих тонких воспоминаниях о Красавице и Чудовище, Томе-с-пальчике и Спящей красавице, наводят на мысль о том, что дирижер, который хорошо играет Моцарта, может сделать все, что угодно. Но Моцарт затронул мысли этого слушателя не только этим.
В оживлённом присутствии Незе-Сегена, в явном удовольствии от создания музыки, которое он излучал, а также в строгом командовании, которое он утверждал, я увидел, каким публичным музыкантом должен был быть Моцарт.Все казалось таким спонтанным и легким, хотя музыкальный результат требовал глубоких размышлений и понимания. Эта непринужденная уверенность прозвучала и в искрометном исполнении Роттердамского филармонического оркестра в сюите «Мать гусыня», и в не меньшей степени во второй части «Равеля», последовавшей за ней, — Концерте для фортепиано с оркестром соль-мажор с солисткой Элен Гримо.
… еще более поразительной, чем способность оркестра создавать сияние звука, была его очевидная способность обуздывать его, создавать неотразимую музыкальную мысль тонкими средствами.
Это настроение постоянно проявлялось в захватывающем исполнении Пятой симфонии Прокофьева».
Lawrence B. Johnson, Chicago on the Aisle, 22 февраля 2015 г.
Разработка бактериофагов Y2::dpoL1-C и Y2::luxAB для эффективного контроля и быстрого обнаружения возбудителя бактериального ожога Erwinia amylovora
Appl Environ Microbiol. 2017 15 июня; 83(12): e00341-17.
, a, B, * * , A, * , A , A , B, * и AYannick Born 1
A Institute of Food, Nutrition and Health, ETH Zurich, Zürich, Switzerland
b Agroscope, Research Division Protection Plant, Wädenswil, Switzerland
Lars Fieseler
a Institute of Food, Nutrition and Health, ETH Zurich, Zürich, Switzerland
Valentin Thöny
a Институт продуктов питания, питания и здоровья, ETH Zurich, Цюрих, Швейцария
Nadja Leimer
a Институт продуктов питания, питания и здоровья, ETH Zurich Zürich, Швейцария
Brion Duffy
b Agroscope, Research Division Plant Protection, Wädenswil, Швейцария
Martin J.
Loessner a Институт продуктов питания, питания и здоровья, ETH Zurich, Цюрих, Швейцария
Emma R. Master, EditorEmma R. Master, University of Toronto;
a Институт продуктов питания, питания и здоровья, ETH Zurich, Цюрих, Швейцария
b Agroscope, Исследовательский отдел защиты растений, Веденсвиль, Швейцария
Автор, ответственный за переписку.* Текущий адрес: Янник Борн, Институт инноваций в области продуктов питания и напитков, Цюрихский университет прикладных наук, Веденсвиль, Швейцария; Ларс Физелер, Институт инноваций в области пищевых продуктов и напитков, Цюрихский университет прикладных наук, Веденсвиль, Швейцария; Брайон Даффи, Институт наук о природных ресурсах, Цюрихский университет прикладных наук, Веденсвиль, Швейцария.
Цитата Борн Ю., Физелер Л., Тони В., Леймер Н., Даффи Б., Лесснер М.Дж. 2017. Разработка бактериофагов Y2:: dpoL1-C и Y2:: luxAB для эффективного контроля и быстрого обнаружения возбудителя бактериального ожога, Erwinia amylovora .
Appl Environ Microbiol 83:e00341-17. https://doi.org/10.1128/AEM.00341-17. Поступила в редакцию 7 февраля 2017 г .; Принято 3 апреля 2017 г.
Copyright © Американское общество микробиологии, 2017 г. Эта статья цитируется в других статьях PMC.- Дополнительные материалы
-
Дополнительный материал
GUID: C47ACD65-6D8A-40B1-9E4E-A5D7B74AB27C
GUID: 6B2868FB-4E17-476E-8136-A8C7589DF6DB
РЕФЕРАТ
Erwinia amylovora является возбудителем бактериального ожога, разрушительной болезни растений, поражающей представители Rosaceae . Крайне желательны альтернативы антибиотикам для борьбы с симптомами и вспышками бактериального ожога из-за растущей лекарственной устойчивости и жестких нормативных ограничений.Более того, имеющиеся диагностические методы либо не обладают чувствительностью, либо недостатком скорости, либо не способны отличить живые бактерии от мертвых. Благодаря своей чрезвычайной биологической специфичности бактериофаги представляют собой многообещающую альтернативу для обеих целей.
В этом исследовании вирулентный вирус Y2 E. amylovora с широким кругом хозяев был сконструирован для повышения его убивающей активности и для использования в качестве репортерного фага люциферазы соответственно. С этой целью ген деполимеразы вируса E. amylovora L1 ( dpoL1-C ) или бактериального слияния luxAB был введен в геном Y2 путем гомологичной рекомбинации.Гены помещали ниже основного капсидного белка orf68 под контролем нативного промотора. Модификации не влияли на жизнеспособность или инфекционность рекомбинантных вирусов. Фаг Y2:: dpoL1-C продемонстрировал синергетическую активность между деполимеразой, расщепляющей экзополисахаридную капсулу, и фаговой инфекцией, которая значительно усилила уничтожение бактерий. Это также значительно снижало способность E. amylovora колонизировать поверхность оторвавшихся цветков.Репортерный фаг Y2:: luxAB трансдуцировал бактериальную люциферазу в клетки-хозяева и индуцировал синтез больших количеств слитой люциферазы LuxAB.
После добавления альдегидного субстрата можно было легко контролировать биолюминесценцию, что позволило быстро и специфично обнаружить небольшое количество жизнеспособных бактерий без обогащения как in vitro , так и в растительном материале.
ВАЖНОСТЬ Бактериальный ожог, вызываемый Erwinia amylovora , представляет собой серьезную угрозу мировому производству семечковых плодов, ежегодно приводя к большим экономическим потерям.Бактериофаги представляют собой многообещающие альтернативы не только для борьбы с болезнью, но и для быстрой диагностики. Чтобы повысить эффективность биоконтроля, мы объединили желаемые свойства двух фагов, Y2 (широкий круг хозяев) и L1 (деполимераза для деградации капсулы) в одном рекомбинантном фаге. Этот фаг продемонстрировал улучшенный биоконтроль и смог уменьшить E. amylovora на цветках. Фаг Y2 также был генетически модифицирован в репортерный фаг люциферазы, который трансдуцирует бактериальную биолюминесценцию в инфицированные клетки и позволяет обнаруживать небольшое количество жизнеспособных бактерий-мишеней.
Сочетание скорости, чувствительности и специфичности превосходит ранее использовавшиеся методы диагностики. В заключение, генная инженерия может улучшить свойства фага Y2 в сторону большей эффективности уничтожения и более чувствительного обнаружения клеток E. amylovora .
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: рекомбинантный фаг, репортер, деполимераза, люцифераза, бактериофаг, бактериальный ожог, репортерный фагГрамотрицательный патоген может инфицировать несколько видов в пределах Rosaceae , представляя глобальную угрозу коммерческому производству яблок и груш, со значительными экономическими последствиями из-за мер контроля и компенсационных расходов для растений, которые необходимо уничтожить (1,–3) . Поэтому надежная диагностика и эффективные меры контроля имеют первостепенное значение для минимизации потерь и предотвращения распространения болезни.
Эффективная борьба с болезнью может быть достигнута путем применения антибиотиков (например,г., стрептомицин) в период цветения.
Однако нормативные ограничения, проблемы общественного здравоохранения и развитие устойчивых штаммов требуют альтернативных мер контроля (4, 5). Диагностика E. amylovora включает культуральные, молекулярные и иммунологические тесты (6). Для последнего был разработан иммуносорбентный анализ с быстрым латеральным потоком (Ea AgriStrip), который выявляет >5 × 10 5 КОЕ/мл в течение 15 минут (7). Однако такие анализы на основе антител часто не обладают необходимой чувствительностью.Этап предварительного обогащения может компенсировать низкую чувствительность, чтобы избежать ложноотрицательных результатов, что, однако, снижает скорость этого метода (6). Другие тесты либо требуют много времени (культуры), либо не позволяют отличить живые бактерии от мертвых (ПЦР). Система обнаружения, которая сочетает в себе желаемые свойства 4S (простота, скорость, чувствительность и специфичность), улучшит управление инфекциями и вспышками бактериального ожога.
Бактериофаги — это повсеместно распространенные бактериальные вирусы, представляющие самую многочисленную группу биологических объектов на Земле (8).
Как правило, они заражают только определенный круг бактерий-хозяев, что делает их полезными и экологически безопасными альтернативами как для обнаружения, так и для борьбы с бактериальными патогенами. Их специфичность позволяет избежать заражения комменсальными бактериями из окружающей среды и снижает риск ложноположительных результатов диагностики. Предпочтение отдается вирулентным фагам, поскольку они обычно характеризуются гораздо более широким кругом хозяев в пределах вида или рода и, в отличие от умеренных фагов, в большинстве случаев неспособны трансдуцировать ДНК хозяина (9).Было показано, что борьба с патогенами на основе фагов является многообещающей альтернативой для некоторых болезней растений (10).
С помощью генной инженерии свойства фагов могут быть специально адаптированы для определенных целей, таких как усиленное уничтожение или использование в качестве фага-репортера. Эффективность вируса Escherichia coli T7 для диспергирования биопленок может быть увеличена путем введения dspB , который кодирует фермент для деградации биопленки (11).
Молекулярная инженерия также может быть использована для изменения специфичности бактериофагов к хозяину.Введение или обмен связанных с хвостом генов позволили вирусам E. coli T2 и T7 инфицировать более широкий круг бактерий-хозяев (12,–14). Аналогично, ген хвостового отростка вируса Pseudomonas PaP1 был заменен геном фага JG004, что вызвало изменение специфичности хозяина (15). В целях обнаружения репортерные фаги индуцируют продукцию легко отслеживаемого фермента или белка. Обычными репортерами являются люциферазы бактерий или насекомых, флуоресцентные белки, гликозидазы и др. (16).Репортерные фаги были разработаны для специфического обнаружения различных грамотрицательных и грамположительных видов, таких как E. coli (17,–20), Salmonella (21, 22), Yersinia pestis (23), Шигеллы spp. (24), Listeria monocytogenes (25, 26), Bacillus anthracis (27, 28) и Mycobacterium spp. (29, 30). В недавних обзорах обобщены как обнаружение патогенов с помощью биолюминесцентных репортерных фагов, так и различные описанные методы обнаружения на основе фагов (16, 31).
Первый репортерный фаг люциферазы для обнаружения растительного патогена ( Pseudomonas cannabina pv. alisalensis), PBSPCA1:: luxAB , был описан Schofield et al. (32). PBSPCA1:: luxAB может обнаруживать P. cannabina pv. alisalensis в растительном материале и дифференцировать его от Pseudomonas syringae pv. maculicola, вызывая менее тяжелое заболевание (32).
Наличие последовательностей генома является предпосылкой для инженерии фагов и полностью секвенировано E.amylovora позволяют создавать рекомбинантные фаги для улучшения биоконтроля и экспресс-диагностики соответственно. В этом исследовании мы стремились ввести различные гетерологичные гены в вирулентный E. amylovora фаг Y2 (33), чтобы усилить его киллерную активность и создать биолюминесцентный репортерный фаг соответственно. Y2 является идеальным кандидатом для обеих целей благодаря широкому кругу хозяев и высокой специфичности в отношении E. amylovora .
Первый подход основан на наших наблюдениях за тем, что экзополисахаридная (ЭПС) капсула E.amylovora препятствует инфекции Y2, которую можно преодолеть путем добавления рекомбинантного фермента деполимеразы из фага L1 (34). Здесь мы сообщаем о вставке гена деполимеразы dpoL1 в геном Y2 и демонстрируем его свойства деградации ЭПС и его положительное влияние на заражение и уничтожение фага. Что касается репортерного фага, предпочтительным репортером была бактериальная люцифераза из Vibrio harveyi , представленная в виде гибрида luxAB . Рекомбинантный репортерный фаг позволял быстро, специфично и чувствительно обнаруживать жизнеспособные штаммы E.амиловора клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Рекомбинантный фаг Y2::
dpoL1-C продуцирует функциональный DpoL1. Синергетическая активность широкого круга хозяев фага Y2 и фермента деполимеразы фага L1 была объединена в одном рекомбинантном фаге. Здесь укороченный с N-конца вариант гена деполимеразы ( dpoL1-C ) был введен в геном фага Y2 путем гомологичной рекомбинации при инфицировании E.
В заключение, dpoL1-C , которому предшествовал участок искусственного сайта связывания рибосомы (RBS), был введен в ожидаемый локус (нуклеотид [nt] 35636).
Бляшки Y2 (слева) и Y2:: dpoL1-C (справа) на газоне E. amylovora CFBP 1430. Деполимераза образует отчетливый ореол вокруг бляшек Y2:: dpoL1-C и придает им более четкий вид.
Геномный анализ рекомбинантных фагов и сравнение с родительским фагом. (A) ПЦР-анализ области генома, в которую были интегрированы гетерологичные гены. (B) Рестрикционное переваривание ДНК фага VspI. Переулки: 1, Y2; 2, Y2:: dpoL1-C ; 3, Y2:: лкAB .Размеры указаны.
Введение дополнительной последовательности не привело к потере остальной информации.
Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов применяли для подтверждения интеграции гетерологичного гена и для определения того, были ли затронуты другие области генома, особенно его концы. Сравнение паттернов рестрикции () подтвердило наличие дополнительных участков ДНК в геноме Y2:: dpoL1-C .
Все фрагменты VspI, кроме одного, были одинакового размера.Фрагменты, несущие orf68 (Y2, 3365 п.н.; Y2:: dpoL1-C , 5312 п.н.), различались по количеству нуклеотидов, интегрированных в фаговый геном. Концевые фрагменты (2745 и 11580 п.н.) остались без изменений.
Y2::
dpoL1-C имеет идентичный диапазон хостов и аналогичный период задержки, но отличается по размеру пакета от родного Y2.Диапазон хозяев рекомбинантного фага был идентичен родительскому фагу Y2 (см. Таблицу S1 в дополнительных материалах).В одностадийном эксперименте по выращиванию инфицированные фагом клетки E. amylovora начали высвобождать потомство Y2:: dpoL1-C приблизительно через 30 мин после инфицирования, что очень похоже на латентный период родительского фага (4). Расчетный размер пакета Y2:: dpoL1-C составил 10 фагов на клетку. Это меньше, чем размер взрыва Y2, который дает в среднем 18 потомков на инфицированную клетку.
Одношаговые кривые роста фагов Y2 и Y2:: dpoL1-C .
Y2::
dpoL1-C обладает повышенной инфекционностью и эффективностью уничтожения. Были проведены эксперименты по заражению, чтобы проверить, обладает ли Y2:: dpoL1-C повышенным потенциалом лизировать культур E. amylovora . Важно отметить, что лечение только DpoL1-C не влияло на рост бактерий (). Мы показываем, что эффективность фага Y2 может быть сильно увеличена за счет внешнего добавления DpoL1-C. Смесь фаг/фермент снижала количество жизнеспособных клеток почти на 4 log 10 в течение 2 часов. Повышенная эффективность уничтожения рекомбинантного Y2:: dpoL1-C по сравнению с исходным фагом стала очевидной при более длительных периодах инкубации.Хотя уменьшение количества бактерий было одинаковым в течение первых 8 часов после заражения, количество жизнеспособных клеток продолжало меняться в противоположных направлениях между 8 и 24 часами после заражения. Через 24 ч количество клеток, инфицированных Y2:: dpoL1-C , уменьшилось примерно на 3 log 10 по сравнению с Y2 дикого типа.
Интересно, что окончательные количества клеток в культурах, обработанных либо отдельными фагом и ферментом (Y2/DpoL1-C), либо фермент-продуцирующим рекомбинантным Y2:: dpoL1-C , были одинаковыми.
In vitro фаговая инфекция E.amylovora CFBP 1430. Бактерии обрабатывали фагом и/или DpoL1-C и отслеживали количество жизнеспособных клеток с течением времени. Показаны средние значения трех экспериментов, проведенных в трех повторностях ± стандартное отклонение (SD).
Y2::
dpoL1-C снижает загрязнение цветов E. amylovora . Отделенные цветки использовали в качестве в модели planta для изучения эффективности биоконтроля Y2:: dpoL1-C . Бактерии могут легко размножаться на поверхности растений.Через 48 часов количество бактерий в необработанных контрольных группах достигало 8,8 × 10 7 , 2,2 × 10 8 и 4,1 × 10 8 КОЕ/цветок, соответственно, в зависимости от уровня инокуляции (1).
Жизнеспособные бактерии уменьшались с помощью Y2:: dpoL1-C в зависимости от инокулята. На цветках, инокулированных 10 2 КОЕ/мл, Y2:: dpoL1-C вызывал снижение конечного числа клеток примерно на 6 log. Следует подчеркнуть, что из 95% образцов цветков этой группы не удалось выделить никаких бактерий.Эффективность Y2:: dpoL1-C была ниже на цветках, инокулированных более высоким количеством бактерий, где средние концентрации бактерий достигали 5,4 × 10 4 КОЕ/цветок (посевной материал, 10 4 КОЕ/мл) и 5,1 × 10 5 КОЕ/цветок (10 6 КОЕ/мл). Это соответствовало снижению на 3,6 и 2,9 log 10 соответственно по сравнению с необработанным контролем. Опять же, выбросы сильно повлияли на среднее количество клеток. Жизнеспособные клетки не были выделены из 81% обработанных фагом цветков, инокулированных 10 4 КОЕ/мл, в то время как эта скорость была иной для цветков, инокулированных 10 6 КОЕ/мл, где только 19%, по-видимому, были свободны от Э.
амиловора клеток. Эти результаты указывают на критический порог соотношения бактерия/фаг, выше которого эффективность фага значительно падает.
Активность Y2:: dpoL1-C на оторвавшихся цветках. Цветки инокулировали различными концентрациями E. amylovora CFBP 1430 NalR (как указано) и обрабатывали Y2:: dpoL1-C . Клетки подсчитывали через 48 ч после инфицирования. Столбцы представляют собой средние значения плюс стандартное отклонение для трех повторных экспериментов, которые были повторены дважды.
Конструкция, изоляция и характеристика Y2::
luxAB . Слитый ген luxAB был введен в геном Y2 для получения репортерного фага Y2:: luxAB . При создании Y2:: luxAB использовалась та же стратегия, что и для Y2:: dpoL1-C . Поскольку морфология бляшек Y2:: luxAB идентична Y2, скрининг и выделение проводили с использованием продукции люциферазы и биолюминесценции клеток, инфицированных предполагаемыми фагами, кодирующими люциферазу, в качестве считывания.
После выделения и размножения идентифицированных фагов, трансдуцирующих люциферазу, правильная интеграция luxAB в геном Y2 была подтверждена с помощью ПЦР.Праймеры Y2-ctrl генерировали продукт ПЦР ожидаемого размера (2404 п.н.) (), а секвенирование подтвердило интеграцию 2055 п.н. в ожидаемом сайте без делеций, вставок или сдвигов рамки считывания. Сайт вставки luxAB , которому предшествует искусственная область RBS, был расположен в положении 35636, непосредственно ниже главного капсидного гена ( orf68 ) для достижения высокой экспрессии luxAB с промотора orf68 .
Анализ фрагментов ДНК, расщепленной VspI, подтвердил, что фрагмент Y2:: luxAB , несущий orf68 , был больше (5420 п.н.), чем фрагмент Y2 (3365 п.н.) (), и что концы физического генома не изменились, я.е., фрагменты были одинакового размера (2745 и 11580 п.н.).
Как и ожидалось, диапазоны хозяев Y2:: luxAB и родительского фага были идентичными. Были протестированы дополнительные грамотрицательные бактерии, которые оказались устойчивыми к заражению Y2:: luxAB (см. Таблицу S1 в дополнительном материале).
Экспрессия люциферазы повышена в клетках, обработанных DpoL1.
Экспрессия люциферазы и эмиссия сигнала биолюминесценции от клеток, инфицированных Y2:: luxAB , зависела от температуры инкубации и достигала пика на 70 мин при 17°C, 50 мин (22°C) и 40 мин (27°C) постинфекционный ().После этого репортерный сигнал обычно быстро снижался, вероятно, из-за лизиса клеток. Наибольшие значения были при 22°C. Хотя добавление DpoL1 не вызывало временного сдвига светового излучения, экспрессия люциферазы обычно была выше, когда клетки подвергались воздействию фермента деполимеразы.
Культуры, обработанные DpoL1, демонстрировали на 25% (17°C), 12% (22°C) и 18% (27°C) более высокую пиковую активность люциферазы, соответственно, чем необработанные культуры.
Экспрессия люциферазы Y2:: luxAB -инфицированные E.amylovora CFBP 1430 клеток, выращенных в различных условиях. (A) Зависимость от температуры и времени. Клетки E. amylovora CFBP 1430 выращивали в бульоне LB (●) или бульоне LB с добавлением деполимеразы (○) и инфицировали Y2:: luxAB . Экспрессию люциферазы измеряли через равные промежутки времени, и отображались средние значения трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение. (B) Чувствительность Y2:: люкс AB на основе обнаружения. Серию разведений E. amylovora CFBP 1430 инфицировали Y2:: luxAB и через 50 мин измеряли эмиссию света.Отображаются средние значения трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение, и они сравниваются с контролями только с бактериями. Фоновые уровни обычно составляли около 100 RLU (горизонтальная линия), а звездочки указывают на значительное увеличение по сравнению с неинфицированным контролем ( P <0,05; тест Стьюдента t ).
Y2::
luxAB выявляет небольшое количество жизнеспособных клеток E. amylovora .Серийные разведения культуры E. amylovora инфицировали репортерным фагом люциферазы для определения нижнего предела обнаружения.Концентрация 3,8 × 10 3 КОЕ/мл была самой низкой для непосредственного получения значений RLU, которые были значительно выше, чем в контроле ( P <0,05; тест Стьюдента t ) (). Выше этого предела количество инфицированных клеток и светоотдача напрямую коррелировали примерно на 4 порядка. Таким образом, значения RLU также можно использовать для оценки концентрации клеток E. amylovora в неизвестном образце. Опять же, применение внешнего фермента DpoL1 для удаления материала капсулы EPS немного повысило общую чувствительность анализа и еще больше снизило предел обнаружения.
Y2::
luxAB для обнаружения E. amylovora в полевых образцах. Y2:: luxAB использовали для обнаружения жизнеспособных клеток E..jpg)
amylovora в вырезанном растительном материале с симптомами бактериального ожога. Световое излучение всех образцов ( n = 24) было значительно выше, чем у контроля ( P > 0,05; тест Стьюдента t ) (). Значения RLU для нескольких образцов превышали значения, определенные для образцов с самой высокой степенью заражения в эксперименте с добавлением (см. ), что указывает на то, что отобранный растительный материал был сильно заражен.Этот вывод был дополнительно подтвержден с помощью системы обнаружения Ea AgriStrip, которая менее чувствительна и имеет предел обнаружения 5,0 × 10 5 КОЕ/мл (7). Здесь этот метод, основанный на иммуноферментном анализе (ELISA), дал положительные результаты для всех 24 образцов. Присутствие E. amylovora было дополнительно подтверждено посевом на агар Кинга Б, где в каждом случае можно было идентифицировать типичные колоний E. amylovora .
Обнаружение E. amylovora в образцах тканей растений методом Y2:: luxAB .
Значения указывают средние значения двух измерений. Минус («-») указывает на отрицательный контроль.
ОБСУЖДЕНИЕ
Фаг Y2 E. amylovora , обладающий широким спектром хозяев, вирулентный и все же специфичный для хозяина, был модифицирован для усиления биоконтроля и быстрой диагностики путем введения деполимеразы dpoL1-C или luxAB ген люциферазы соответственно. Заражению и уничтожению рекомбинантным фагом Y2:: dpoL1-C больше не препятствует EPS-капсула, как в случае с Y2, а заражение Y2:: luxAB позволяет быстро и чувствительно обнаруживать жизнеспособные клетки E .amylovora менее чем за 1 час.
Исследуемые гены dpoL1-C и luxAB должны экспрессироваться на максимально возможном уровне. Таким образом, мы следовали стратегии, которую мы использовали ранее для конструирования рекомбинантного фага Listeria (26), и вставляли их сразу после основного капсидного белка orf68 .
Экспрессия dpoL1-C и luxAB в Y2:: dpoL1-C и Y2:: luxAB соответственно теперь находится под контролем сильного позднего промотора.Однако введение нового генетического материала в геном фага без удаления какой-либо другой последовательности потенциально может превысить ограничения, продиктованные размером капсида, и привести к неконтролируемой потере других генов и, возможно, снизить инфекционность или даже поставить под угрозу жизнеспособность фага. Анализ полученных здесь рекомбинантных фагов подтвердил не только то, что гетерологичные гены были введены в целевом положении, но и, что более важно, отсутствие потери информации о последовательности.
Введение dpoL1-C в геном Y2 объединило синергическую активность фага и фермента, разрушающего капсулу, в одном агенте. Эта стратегия постулировалась ранее для разрушения бактериальных биопленок (35, 36). В элегантном подходе Escherichia coli фаг T7 был оснащен ферментом, разрушающим биопленки ( dspB ) для улучшенного рассеивания биопленок (11). Однако dspB не имеет фагового происхождения, в отличие от dpoL1-C .Насколько нам известно, подход, используемый здесь для достижения синергизма за счет комбинации активностей фага и гетерологичного фермента, кодируемого другим фагом из другого морфотипа (миовирус Y2 и подовирус L1), является новым.
Следует также отметить, что повышенную эффективность заражения и уничтожения Y2:: dpoL1-C следует рассматривать как вторичный эффект, поскольку DpoL1-C не присутствует в качестве структурного компонента рекомбинантного фага. Фактически, деполимераза отсутствовала при первом заражении бактерий Y2:: dpoL1-C , но экспрессировалась только во время этого первого цикла инфекции, и фермент высвобождается только после того, как клетки начинают лизироваться.Затем его активность способствует последующему заражению любых оставшихся бактериальных клеток. Таким образом, хотя действие, опосредованное ферментом, несколько отсрочено, здесь мы показали, что его, тем не менее, достаточно для значительного улучшения способности инфицировать инкапсулированные клетки-хозяева E.
amylovora . EPS E. amylovora , по крайней мере, частично удаляется ферментом и больше не действует как барьер, увеличивая подверженность бактериальных клеток атаке фага.
Было обнаружено, что эффективность борьбы с патогенами на основе фагов на отслоившихся цветках зависит от исходного инокулята.Выше определенного порога эффективность Y2:: dpoL1-C резко снижалась. Вполне вероятно, что большинство бактерий заразились сразу после применения фага. Однако оставшиеся (неинфицированные) клетки, возможно, смогли восстановиться, потому что диффузия фаговых частиц как основной детерминант фаговой инфекции затруднена на поверхности растений. В естественных условиях окружающей среды УФ-инактивация также может усложнить биоконтроль на основе фагов (37, 38). Таким образом, раннее вмешательство до того, как бактерии достигнут критической концентрации in vivo , может быть наилучшей стратегией, и ожидается, что повторное применение фага еще больше повысит эффективность.
Клетки E. amylovora можно было быстро обнаружить путем измерения активности бактериальной люциферазы, трансдуцированной Y2:: luxAB . Зависимость от температуры соответствовала характеристикам роста бактерий-хозяев. Самые высокие значения RLU были достигнуты раньше всего при 27°C, что близко к оптимальной температуре для роста E. amylovora (39). При этой температуре пик наблюдался через 40 мин, что кажется более быстрым, чем для большинства других репортерных фагов luxAB (23, 26,–28, 32, 40, 41).Температуры выше 27°C не тестировались из-за присущей ферменту слияния нестабильности при повышенных температурах (26, 42). Быстрое снижение значений RLU при всех температурах (биолюминесценция типа вспышки), скорее всего, связано с ограниченным запасом FMNH 2 , что также вызвано фаг-опосредованным лизисом клеток (26).
Было обнаружено, что предел прямого обнаружения (без обогащения) клеток E. amylovora после заражения Y2:: luxAB составляет всего 3.
8 × 10 3 КОЕ/мл. Пределы обнаружения других репортерных фагов люциферазы варьировались от нескольких клеток на миллилитр до примерно 10 3 до 10 4 КОЕ/мл (23, 24, 26, 27, 32, 40, 41). Было показано, что из них системы, включающие умеренные фаги, имеют самые низкие пределы обнаружения, основанные на длительном непрерывном производстве репортерного белка (20, 27, 40). Однако Y2:: luxAB является вирулентным фагом, а умеренные вирусы E. amylovora еще не обнаружены (43).Таким образом, лучшим вариантом повышения чувствительности анализа Y2:: luxAB является этап предварительного обогащения, который не только увеличивает количество бактерий до определяемых значений, но и обеспечивает метаболическое восстановление клеток-мишеней. Это согласуется с более ранними исследованиями, которые также продемонстрировали полезность этапа обогащения перед обнаружением с помощью репортерного фага (26, 44).
Было обнаружено, что биолюминесценция напрямую связана с количеством бактериальных клеток.
Интересно, что световая эмиссия клеток, обработанных DpoL1, в каждом случае была выше.Поскольку количество клеток в образцах, обработанных и не обработанных DpoL1, было одинаковым, это открытие свидетельствует о том, что в присутствии DpoL1 инфекция с помощью Y2:: luxAB более эффективна. Определенная часть клеток дикого типа (необработанных) может оставаться неинфицированной из-за их обширной капсулы EPS, которая действует как барьер против фагов, не содержащих деполимеразы, таких как Y2 дикого типа. Добавление экзогенного рекомбинантного DpoL1 является одним из способов помочь фагам без деполимеразы как в обнаружении, так и в контроле E.амиловора . Однако здесь мы демонстрируем, что этот громоздкий подход можно обойти путем модификации фага для экспрессии собственной растворимой деполимеразы.
Y2:: luxAB был высокоэффективен и точен при обнаружении E. amylovora в реальных полевых образцах, а на активность фага не влияли другие микроорганизмы, присутствующие в экстрактах тканей или растений.
Эксперименты продемонстрировали, что случайные полевые изоляты E. amylovora дикого типа все чувствительны к инфекции Y2:: luxAB , что связано с широким кругом хозяев Y2, и сводит к минимуму возможные ложноотрицательные результаты.Из-за чрезвычайной специфичности Y2 к хозяину риск ложноположительных результатов также чрезвычайно низок. Более того, чувствительность анализа Y2:: luxAB в целом достаточна для целей обнаружения in vivo . Хотя полевые образцы, протестированные здесь, были сильно заражены (> 5,0 × 10 5 КОЕ/мл), бактериальная нагрузка в среднем полевых образцах с симптомами обычно находится в диапазоне от 10 5 до 10 6 КОЕ/г (6 ). В целом, репортерный фаг люциферазы Y2:: luxAB предлагает полезное сочетание специфичности жизнеспособных клеток, высокой чувствительности и скорости и, по-видимому, превосходит тесты на основе ELISA.
В заключение, желаемые свойства E. amylovora фага Y2 могут быть дополнительно улучшены в двух направлениях путем введения гетерологичных генов.
Оба рекомбинантных фага сочетают в себе преимущества родительского фага с дополнительным преимуществом. Рекомбинантный Y2:: dpoL1-C индуцирует продукцию и высвобождение EPS-деполимеразы, которая делает другие клетки-хозяева более доступными для фаговой атаки и побочного повреждения. Кроме того, фаговое происхождение dpoL1-C делает Y2:: dpoL1-C гибридом, а не трансгенной фаговой частицей, что является потенциально важным аргументом в пользу законодательства о применении фага в сельском хозяйстве.Репортерный фаг Y2:: luxAB представляет собой идеальный инструмент для быстрой диагностики бактериального ожога в растительном материале. Он специфически обнаруживает E. amylovora и различает живые и мертвые клетки, в отличие от молекулярных методов или иммунологических анализов. Анализ быстрее, чем любой культуральный метод. Хотя чувствительность анализа уже лучше, чем у обычного ИФА, его предел обнаружения можно еще больше снизить, введя стадию обогащения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Вектор pBlue::Y2-
dpoL1-C для сайт-специфической интеграции в фаг Y2. Нативный ген dpoL1 фага L1 был модифицирован для вставки в межгенную область между orf68 и orf69 (нуклеотид 35636) генома Y2, где транскрипционный контроль обеспечивается сильным промотором перед главным капсидом ген. Поскольку деполимераза не является структурным компонентом Y2:: dpoL1-C, N-концевой домен, не необходимый для ферментативной активности (34), был исключен. Для правильной трансляции вводили искусственный сайт связывания рибосомы (RBS; GGAGGT), спейсер из 6 нуклеотидов и стартовый кодон, предшествующий dpoL1-C .Конечная последовательность в сайте интеграции рекомбинантного фага представляла собой 5′-TAAGTTGAT GGAGGT GAATCTATG-3′ (подчеркнуты стоп- и старт-кодоны orf68 и dpoL1-C соответственно; жирный шрифт, RBS). Последовательность dpoL1-C (ΔN 1–180 ) амплифицировали из L1-ДНК с использованием пары праймеров Y2-Dpo-C/D (), а выше и ниже по течению области целевого сайта вставки амплифицировали с помощью пары праймеров Y2-Dpo-A/B и Y2-Dpo-E/F с использованием Y2-ДНК в качестве матрицы.
Праймеры B/C и D/E содержали комплементарные последовательности для последующей ПЦР с перекрытием. Праймер C вводил искусственную область RBS и стартовый кодон. Праймер F вводил сайт рестрикции BamHI. Нативный сайт рестрикции EcoRI расположен на 7 нуклеотидов ниже области отжига (3′-конец) праймера А. ПЦР проводили с использованием высокоточной ДНК-полимеразы Phusion (Finnzymes Oy, Вантаа, Финляндия) в соответствии с инструкциями производителя, и фрагменты очищали гель-экстракцией (набор для гель-экстракции QIAquick; Qiagen, Hilden, Germany).Конечный продукт ПЦР был получен с помощью ПЦР с перекрыванием удлинения с использованием праймеров Y2-Dpo-A и Y2-Dpo-F и трех фрагментов (AB, CD и EF) в качестве матриц. В первых пяти циклах отжиг перекрывающихся областей обеспечивался снижением температуры отжига (начальная 64°С, конечная 60°С, по 1 циклу). Продукт ПЦР правильной длины вырезали из геля для электрофореза и очищали гель-экстракцией (набор для гель-экстракции QIAquick). Он состоял из dpoL1-C с сигналами трансляции, как описано выше (общий размер, 1947 п.
н.), и фланкирующими областями выше (304 п.н.) и ниже (278 п.н.), комплементарными геному фага Y2 (10).Последовательность и клонирующий вектор pBluescript II SK(-) (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния) готовили для лигирования рестрикционным расщеплением эндонуклеазами HF EcoRI и BamHI (New England BioLabs, Ипсвич, Массачусетс). Лигирование проводили с использованием лигазы Т4 (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany), в результате чего получали pBlue::Y2- dpoL1-C .
Таблица 1 9003
Грунтовки, используемые для строительства и подтверждения рекомбинантных фагов Y2 :: DPOL1-C и Y2 :: Luxab Имя Sequence A Y2-Dpo-A CCA GTC TGA CAT GAC CAT CCT GCA ATT CTT CAT TGC Y2-Dpo-B CAT AGA TTC ACC TCC
ATC AAC TTA G на ACC TGA GTT Gat AG
CTA AGT TGA TGG AGG TGA ATC TAT G на TGG CGG CTA CTA CTC GTT TG Y2-Dpo-D GCT TTC ACC CGC CGA CAT
TTA TCC TTG TGA AGA TAC AGA ACC ATG TCG GCG GGT Gaa AGC CCG CCT CCT Y2-DPO-F GAT CGG ATC C GG ACA TTC TTC TTA TTA TCC ATC TGG CCA GTC TGA CAT GAC CAT CCT GCA ATT CTT CAT TGC 8 Y2-LUX-B TTT CAT AGA TTC АКК ТСС
ATC AAC TGA TGA TA GAT ACC TGA GTT Gat AG AGT TGA TGAG AGG TGA ATC T AT TT TTGA AAA CTT CCT TCT CAC TTA TCA GCC ACC 9019 Y2-LUX-D TTT CAC CCG CCG ACA T TT AC G AGT GGT ATT TGA CG GTA A В GTC GGC GGG TGA AA G CCC GCC TCA G 8 GAT CGG-F GAT CGG ATC C GG ACA TTC TTC TTA TTCAT ATC TGG Y2-LUX-SEQ2 CTG GTC AAC CAA AAT GTA GAT GG TTT Gaa Cag GTT AAC CAC TTT GG Y2-CTRL-FW GTT ATC TGC CGT ACT GTT AAT GG Y2-ctrl-rev GTC ATC CAG TTC AAC AGT TGC 90 695
Схематическое изображение конструкции, полученной с помощью ПЦР с перекрытием для клонирования в pBluescript и последующей гомологичной рекомбинации с геномной ДНК Y2.
Области отжига праймеров показаны маленькими черными стрелками, а также указаны сайты рестрикции EcoRI и BamHI, а также RBS (толстая вертикальная линия). Изображение нарисовано не в масштабе.
pBlue::Y2-
luxAB для рекомбинации бактериальной люциферазы.
Области отжига праймеров показаны маленькими черными стрелками, а также указаны сайты рестрикции EcoRI и BamHI, а также RBS (толстая вертикальная линия). Изображение нарисовано не в масштабе. Бактериальная люцифераза из V. harveyi была сконструирована для интеграции в том же локусе, как описано выше для dpoL1-C . Нативный бактериальный lux оперон состоит из пяти генов ( luxCDABE ).Хотя сама люцифераза является гетеродимером, состоящим из α-субъединицы (LuxA) и β-субъединицы (LuxB), генов luxCDE кодируют редуктазы жирных кислот, необходимые для производства длинноцепочечного альдегида (45). Из-за ограниченного пространства в капсиде Y2 и необходимости сильного сигнала после заражения фагом был использован слитый ген luxAB (26). Вектор pBlue::Y2- luxAB конструировали с использованием праймеров Y2-lux, перечисленных в соответствии с протоколом, описанным выше, с модификациями ПЦР с перекрыванием удлинения.
Фрагменты АВ и CD, а также фрагменты CD и EF по отдельности соединяли друг с другом перед окончательной ПЦР с перекрытием. Из-за большого перекрытия фрагментов AD и CF не требовалось понижение температуры отжига. Конечный фрагмент AF включал ген luxAB , которому предшествовал тот же самый RBS (общий размер 2055 п.н.) и фланкировали описанные выше комплементарные области Y2 ().
Последовательность в сайте вставки рекомбинантного фага была 5′-TAAGTTGAT GGAGGT GAATCTATG-3′ (подчеркнуты стоп- и старт-кодоны orf68 и luxAB соответственно; жирный шрифт, RBS).Затем AF клонировали в pBluescript II SK(-) через сайты рестрикции BamHI и EcoRI с получением pBlue::Y2- luxAB .
Трансформация.
Electrocompetent Клетки E. amylovora 4/82 трансформировали pBlue::Y2- dpoL1-C или pBlue::Y2- luxAB путем электропорации (GenePulser [Bio-Rad, Hercules, CA]); настройки: 2,5 кВ, 25 мкФ и 200 Ом). После добавления 1 мл среды SOC и 1 ч инкубации при 30°C серию разведений высевали на чашки Луриа-Бертани (LB), содержащие ампициллин (100 мкг/мл), которые инкубировали в течение ночи при 27°C.
Клоны со вставками идентифицировали с помощью ПЦР, а конструкции секвенировали.
Гомологическая рекомбинация.
Порции (25 мл) среды LB с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) инокулировали штаммом E. amylovora 4/82, несущим конструкцию pBlue::Y2- dpoL1-C или pBlue::Y2- luxAB с последующей инкубацией при постоянном встряхивании при 30°С. При оптической плотности при 600 нм 0,1 (~1,5 × 10 8 КОЕ/мл) добавляли фаг Y2 до конечной концентрации 1.5 × 10 6 БОЕ/мл (MOI = 0,01), далее культуры инкубировали при 30°С. Через 24 часа оставшиеся бактериальные клетки и дебрис удаляли центрифугированием (10 000 × g , 10 мин) и фильтрованием (фильтр с размером пор 0,2 мкм; Sarstedt, Нюмбрехт, Германия), а лизат хранили при 4 °С.
Скрининг и идентификация рекомбинантных фагов.
Рекомбинантные фаги Y2:: dpoL1-C и Y2:: luxAB были идентифицированы с использованием функций деполимеразы или люциферазы в качестве удобных показаний в специально адаптированных анализах с наложением мягкого агара.
Фаговые лизаты (10 мкл соответствующего разведения) смешивали со 100 мкл свежей ночной культуры E. amylovora CFBP 1430 (Y2:: dpoL1-C ) или 4/82 (Y2:: luxAB ). в 4 мл расплавленного и темперированного (47,5°C) мягкого агара LB (среда LB с добавлением 10 мМ CaCl 2 и 2 мМ MgSO 4 на 0,4% агаре). Затем смесь выливали на чашки с агаром (Y2:: dpoL1-C , агар LB с 1% глюкозы; Y2:: luxAB , агар LB). После инкубации в течение ночи при 27°С бляшки (ок.300 на чашку), продуцируемые диким типом и рекомбинантным Y2:: dpoL1-C , подвергали визуальному скринингу на предмет образования окружающего гало, отличительного признака фагов, продуцирующих Dpo. Использование штамма CFBP 1430 вместо штамма 4/82 облегчило скрининг, поскольку первый продуцирует большее количество ЭПС. Затем с помощью пипетки Пастера можно было выделить четкие одиночные бляшки с ореолом и ресуспендировать в 500 мкл буфера SM (50 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 8 мМ MgSO 4 [pH 7,4]).
Эту стадию повторяли не менее двух раз для обеспечения чистоты фагового изолята.Для скрининга и выделения Y2:: luxAB порции по 5 мл буфера SM выливали на планшеты, демонстрирующие полуконфлюэнтный лизис (примерно от 500 до 1000 БОЕ/планшет) после первоначального посева фаговой смеси. Буфер СМ собирали через 2 ч, активность люциферазы выражали в RLU и измеряли сразу после введения 50 мкл альдегидного субстрата (0,25% [об./об.] ноналя в 70% этаноле) в 1 мл пробы, используя трубчатый люминометр с программируемым инжектором (Lumat LB9501; Berthold Technologies GmbH, Регенсдорф, Швейцария), как описано ранее (26).Образцы с RLU >250 считались положительными, а наличие Y2:: luxAB продемонстрировали с помощью ПЦР с использованием пары праймеров Y2-lux-seq2/3 (). Праймеры, отожженные в гене luxAB и в остове Y2, соответственно, позволяют обнаружить рекомбинантный фаг и избежать ложноположительных результатов, т. е. обнаружения фага дикого типа или рекомбинации pBlue::Y2- luxAB .
плазмида. Буфер SM из планшета с положительным результатом ПЦР использовали для дальнейших раундов обогащения и тестирования.Планшеты с меньшим количеством БОЕ получали и подвергали скринингу тем же методом. При этом соотношение между рекомбинантным фагом и фагом дикого типа постоянно увеличивалось в течение нескольких циклов посева. При соотношении >1:50 отдельные бляшки собирали, как описано выше, и тестировали с помощью ПЦР. Наконец, чистота фага гарантировалась тремя последовательными выделениями одиночных бляшек. Интеграции dpoL1-C и luxAB , соответственно, анализировали с помощью ПЦР с парой праймеров Y2-ctrl-fw/rev (), отжигая выше и ниже интегрированной ДНК ().Продукты ПЦР секвенировали для подтверждения. Наконец, фаги были размножены до высокого титра и очищены с помощью ступенчатых градиентов CsCl, а геномная ДНК фага была выделена посредством экстракции фенолом-хлороформом, как описано ранее (33). Рестрикционное расщепление проводили в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ диапазона хостов.
Диапазоны хозяев рекомбинантных фагов тестировали, как описано ранее (33), с использованием метода пятен на лужайке на чашках с агаром.
Одношаговые кривые роста.
Параметры роста фага Y2:: dpoL1-C определяли по классической одноступенчатой кривой роста. Для этого в бульон LB с добавлением CaCl 2 (10 мМ) и MgSO 4 (2 мМ) инокулировали E. amylovora CFBP 1430. Культуру выращивали при постоянном встряхивании при 27°C до оптического была достигнута плотность 0,5. 10 мл культуры переносили в предварительно подогретую (27°С) центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавляли фаг до конечной концентрации 5 х 10 5 БОЕ/мл.Пробирку оставляли на 5 мин при 27°С для адсорбции фага. После этого 1 мл культуры центрифугировали (1 мин, 7000 × г ) и удаляли супернатант, содержащий неадсорбированный фаг. Осадок ресуспендировали в 10 мл свежего подогретого (27°С) LB-бульона, содержащего CaCl 2 (10 мМ) и MgSO 4 (2 мМ), и далее культуру инкубировали при 27°С при регулярном встряхивании.
In vitro активность Y2:: dpoL1-C . (34) . Вкратце, E. amylovora CFBP 1430 (10 5 КОЕ/мл) инфицировали 10 8 БОЕ/мл и/или 5 мкг/мл фермента. Культуры инкубировали при 30°С при постоянном встряхивании и отслеживали количество клеток во времени.Каждый эксперимент состоял из трех технических повторов на обработку и независимо повторялся дважды.
Эффективность уничтожения Y2::
dpoL1-C на поверхности листьев цветков. Эксперименты на отделенных цветках были проведены для определения эффективности биоконтроля Y2:: dpoL1-C в зависимости от начального числа клеток. Недавно открытые цветки яблони сорта «Галактика» собирали и хранили в среде с 1% (вес/объем) сахарозы. Цветки инокулировали аэрозолем с различными концентрациями бактерий (10 2 , 10 4 и 10 6 КОЕ/мл соответственно, E. amylovora CFBP 1430 Nal r в PBS плюс 0,01% [об./об.] Tween 20). Через 1 час распылением наносили фаги (3,0 × 10 8 БОЕ/мл в SM плюс 0,01% [об./об.] Tween 20). Цветки инкубировали в пластиковых ящиках при 20°С. Ящики были снабжены влажными бумажными полотенцами для обеспечения постоянной высокой влажности. Через 48 ч лепестки и цветоносы удаляли, цветки помещали в 1 мл фосфатно-солевого буфера/Tween 20 для отмывки бактериальных клеток и определяли количество клеток на чашках LB, содержащих налидиксовую кислоту (50 мкг/мл). ) и циклогексимид (50 мкг/мл).Опыт проводили в группах по семь цветков в каждой и независимо повторяли дважды.
Параметры экспрессии люциферазы.
Зависимую от времени экспрессию люциферазы клетками E. amylovora , инфицированными Y2:: luxAB , исследовали при трех различных температурах (17, 22 и 27°C). штамм E. amylovora CFBP 1430 выращивали в бульоне LB или бульоне LB с добавлением DpoL1 в количестве 5 мкг/мл до концентрации приблизительно 10 8 КОЕ/мл.
Культуру инфицировали 3,0 × 10 8 БОЕ/мл Y2:: luxAB , перемешивали и сразу делили на аликвоты по 1 мл. RLU измеряли с помощью люминометра при t 0 и с 10-минутными интервалами в течение 90 мин. Два дополнительных измерения были сделаны через 120 и 150 мин. Эксперименты состояли из трех технических повторов и дважды независимо повторялись.
Предел обнаружения с использованием Y2::
luxAB репортерный фаг. Были проведены эксперименты с различными концентрациями клеток для определения чувствительности Y2:: luxAB . E. amylovora CFBP 1430 выращивали в бульоне LB или в бульоне LB с добавлением DpoL1 (5 мкг/мл) при 22°C до приблизительной концентрации 10 8 КОЕ/мл. Серию разведений 1:10 общим объемом 5 мл заражали Y2:: luxAB (3,0 × 10 8 БОЕ/мл) и далее инкубировали при 22°С. RLU аликвот по 1 мл измеряли через 50 мин после инфицирования. Фоновый уровень RLU измеряли в контролях только с фагом или бактериями и определяли КОЕ/мл неинфицированных культур.
Опыты проводили трижды в трехкратной повторности.
Обнаружение
E. amylovora в полевых изолятах.Образцы тканей с предполагаемыми симптомами бактериального ожога (некроз, ил) были взяты из швейцарского яблоневого сада. Цветы с цветоносами и мелкие плоды (образцы 1-10), листья (образцы 11-20) и веточки (образцы 21-24) разрезали на кусочки и мацерировали с 5 мл PBS на грамм растительной ткани в течение 15 мин в центрифужных пробирках. . Образцы PBS (500 мкл) смешивали с таким же объемом бульона 2× LB, содержащего 6.0 × 10 8 БОЕ/мл фага Y2:: luxAB и 10 мкг/мл DpoL1. RLU измеряли через 50 мин инкубации при 22°C. Контрольные образцы не содержали фагов. Для сравнения те же образцы PBS анализировали с помощью Ea AgriStrip (7) и путем посева серии разведений на среду King’s B (46), содержащую 100 мкг/мл циклогексимида.
БЛАГОДАРНОСТЬ
Это исследование финансировалось Швейцарским федеральным управлением сельского хозяйства (BLW Fire Blight Project – Biocontrol) и проводилось в рамках программы Европейского Союза по сотрудничеству в области науки и технологий (COST) Action 864 при поддержке швейцарской исследовательской сети ProfiCrops.
ССЫЛКИ
1. Bonn WG, van der Zwet T. 2000. Распространение и хозяйственное значение бактериального ожога, стр. 37–53. В Ваннесте Дж.Л. (ред), бактериальный ожог: болезнь и ее возбудитель, Erwinia amylovora . CAB International, Уоллингфорд, Великобритания. [Google Академия]2. Даффи Б., Шерер Х.Дж., Бюнтер М., Клэй А., Холлигер Э. 2005. Регуляторные меры против Erwinia amylovora в Швейцарии. Бык ЕОКЗР 35:239–244. doi: 10.1111/j.1365-2338.2005.00820.х. [Перекрестная ссылка] [Академия Google]3. Томсон С. 2000. Эпидемиология бактериального ожога, стр. 9–36. В Ваннесте, Дж. Л. (редактор), Бактериальный ожог: болезнь и ее возбудитель, Erwinia amylovora . CAB International, Уоллингфорд, Великобритания. [Google Академия]4. Макманус П.С., Стоквелл В.О., Сундин Г.В., Джонс А.Л. 2002. Применение антибиотиков в растениеводстве. Анну Рев Фитопатола 40:443–465. doi:10.1146/annurev.phyto.40.120301.093927. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5.
Стоквелл В.О., Даффи Б.2012.
Применение антибиотиков в растениеводстве. Rev Sci Tech
31:199–210. [PubMed] [Google Scholar]6. ЕОКЗР. 2013.
PM 7/20 (2) Erwinia amylovora . Бык ЕОКЗР
43:21–45. doi: 10.1111/epp.12019. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 7. Браун-Кьюник А., Альтенбах Д., Оберхансли Т., Биттерлин В., Даффи Б.
2011.
Быстрый иммуноанализ с боковым потоком для фитосанитарного обнаружения Erwinia amylovora и диагностики бактериального ожога на месте. J Микробиологические методы
87:1–9. doi:10.1016/j.mimet.2011.06.015. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8.Кобиан Гуэмес А.Г., Юле М., Канту В.А., Фелтс Б., Налтон Дж., Ровер Ф.
2016.
Вирусы как победители в игре жизни. Анну Рев Вирол
3:197–214. doi:10.1146/annurev-virology-100114-054952. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]9. Хагенс С., Лесснер М.Дж.
2007.
Применение бактериофагов для выявления и борьбы с пищевыми возбудителями. Appl Microbiol Биотехнология
76: 513–519. doi: 10.1007/s00253-007-1031-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10.
Баттимер С., Маколифф О., Росс Р.П., Хилл С., О’Махони Дж., Коффи А.2017.
Бактериофаги и бактериальные болезни растений. Фронт микробиол
8:34. doi:10.3389/fmicb.2017.00044. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]12. Махичи Ф., Синнотт А.Дж., Ямамичи К., Осада Т., Танджи Ю.
2009.
Сайт-специфическая рекомбинация фага Т2 с использованием генов длинных хвостовых волокон IP008 обеспечивает целенаправленный метод расширения круга хозяев при сохранении литической активности. FEMS Microbiol Lett
295: 211–217. doi:10.1111/j.1574-6968.2009.01588.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Шолль Д., Адхья С., Меррил С.2005.
Капсула Escherichia coli K1 является барьером для бактериофага Т7. Appl Environ Microbiol
71:4872–4874. doi: 10.1128/AEM.71.8.4872-4874.2005. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]14. Йоити М., Абэ М., Миянага К., Унно Х., Танджи Ю.
2005.
Изменение белка хвостового отростка gp38 позволяет фагу T2 инфицировать Escherichia coli O157:H7.
Джей Биотехнолог
115:101–107. doi: 10.1016/j.jbiotec.2004.08.003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Le S, He X, Tan Y, Huang G, Zhang L, Lux R, Shi W, Hu F.2013.
Картирование хвостового волокна как рецептор-связывающего белка, ответственного за дифференциальную специфичность хозяина Pseudomonas aeruginosa бактериофагов PaP1 и JG004. PLoS Один
8:e68562. doi:10.1371/journal.pone.0068562. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]16. Анани Х., Чоу Ю., Кучик С., Дерда Р., Эвой С., Гриффитс М.В.
2017.
От кусочков до целых фагов и наномашин: обнаружение патогенов с помощью бактериофагов. Annu Rev Food Sci Technol
8: 305–329. doi:10.1146/annurev-food-041715-033235.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Ода М., Морита М., Унно Х., Танджи Ю.
2004.
Быстрое обнаружение Escherichia coli O157:H7 с использованием бактериофага PP01, меченного зеленым флуоресцентным белком. Appl Environ Microbiol
70: 527–534. doi: 10.1128/AEM.70.1.527-534.2004. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]18.
Brigati JR, Ripp SA, Johnson CM, Iakova PA, Jegier P, Sayler GS.
2007.
Биолюминесцентный биорепортер на основе бактериофага для обнаружения Escherichia coli O157:H7.Дж Фуд Прот
70:1386–1392. doi: 10.4315/0362-028X-70.6.1386. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 19. Танджи Ю, Фурукава С, На СХ, Хидзиката Т, Миянага К, Унно Х.
2004.
Обнаружение Escherichia coli с помощью GFP-меченого инактивированного лизоцимом бактериофага T4. Джей Биотехнолог
114:11–20. doi: 10.1016/j.jbiotec.2004.05.011. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Чжан Д., Коронель-Агилера С.П., Ромеро П.Л., Перри Л., Миноча У., Розенфилд С., Геринг А.Г., Паоли Г.К., Бхуния А.К., Эпплгейт Б.
2016.
Использование нового репортерного фага на основе NanoLuc для обнаружения Escherichia coli O157:H7.научный представитель
6:33235. дои: 10.1038/srep33235. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]21. Kuhn J, Suissa M, Wyse J, Cohen I, Weiser I, Reznick S, Lubinsky-Mink S, Stewart G, Ulitzur S.
2002.
Обнаружение бактерий с использованием чужеродной ДНК: разработка реактива бактериофага Salmonella . Int J Food Microbiol
74:229–238. doi: 10.1016/S0168-1605(01)00683-3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Вольбер ПК, Грин РЛ.
1990.
Обнаружение бактерий путем трансдукции генов нуклеации льда.Тенденции Биотехнологии
8: 276–279. дои: 10.1016/0167-7799(90)-4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Шофилд Д.А., Молинью И.Дж., Вестуотер К.
2009.
Диагностический биолюминесцентный фаг для обнаружения Yersinia pestis . Джей Клин Микробиол
47:3887–3894. doi: 10.1128/JCM.01533-09. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]24. Schofield DA, Wray DJ, Molineux IJ.
2015.
Выделение и разработка биолюминесцентных репортерных фагов для бактериальной дизентерии. Eur J Clin Microbiol Infect Dis
34:395–403.doi: 10.1007/s10096-014-2246-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Хагенс С., де Воутерс Т., Волленвейдер П., Лесснер М.Дж.
2011.
Репортерный бактериофаг A511:: celB трансдуцирует гипертермостабильную гликозидазу из Pyrococcus furiosus для быстрого и простого обнаружения жизнеспособных клеток Listeria .
Бактериофаг
1: 143–151. дои: 10.4161/бакт.1.3.16710. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]26. Лесснер М.Дж., Рис CED, Стюарт GSAB, Шерер С.
1996.
Конструирование репортерного люциферазы бактериофага A511:: luxAB для быстрого и чувствительного обнаружения жизнеспособных клеток Listeria .Appl Environ Microbiol
62:1133–1140. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]27. Sharp NJ, Molineux IJ, Page MA, Schofield DA.
2016.
Быстрое обнаружение жизнеспособных спор Bacillus anthracis в образцах окружающей среды с помощью сконструированных репортерных фагов. Appl Environ Microbiol
82:2380–2387. doi: 10.1128/AEM.03772-15. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]28. Шофилд Д.А., Вестуотер К.
2009.
Фагоопосредованное биолюминесцентное обнаружение Bacillus anthracis .J Appl микробиол
107: 1468–1478. doi:10.1111/j.1365-2672.2009.04332.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Саркис Г.Дж., младший, Р.Дж.В., Хатфулл Г.
Ф. 1995.
Репортерные микобактериофаги люциферазы L5: чувствительный инструмент для обнаружения и анализа живых микобактерий. Мол Микробиол
15:1055–1067. doi:10.1111/j.1365-2958.1995.tb02281.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 30. Джейкобс В.Дж., Барлетта Р.Г., Удани Р., Чан Дж., Калкут Г., Сосне Г., Кизер Т., Саркис Г.Дж., Хатфулл Г.Ф., Блум Б.Р.
1993.
Быстрая оценка лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis с помощью репортерных фагов люциферазы.Наука
260:819–822. дои: 10.1126/наука.8484123. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Клампп Дж., Лесснер М.Дж.
2014.
Обнаружение бактерий с помощью биолюминесцентного репортерного бактериофага. Adv Biochem Eng Биотехнологии
144:155–171. [PubMed] [Google Scholar] 32. Шофилд Д.А., Булл К.Т., Рубио И., Вехтер В.П., Вестуотер С., Молинью И.Дж.
2012.
Разработка сконструированного биолюминесцентного репортерного фага для обнаружения бактериального ожога крестоцветных. Appl Environ Microbiol
78:3592–3598. doi: 10.1128/AEM.
00252-12.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]33. Борн Ю., Физелер Л., Марацци Дж., Лурц Р., Даффи Б., Лесснер М.Дж.
2011.
Новые вирулентные бактериофаги Erwinia amylovora с широким кругом хозяев обнаруживают высокую степень мозаицизма и родство с фагами Enterobacteriaceae . Appl Environ Microbiol
77: 5945–5954. doi: 10.1128/AEM.03022-10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]34. Борн Ю., Физелер Л., Клумпп Дж., Югстер М.Р., Зурфлух К., Даффи Б., Лесснер М.Дж.2014.
Связанная с хвостом деполимераза фага L1 Erwinia amylovora опосредует адсорбцию клетки-хозяина и удаление ферментативной капсулы, что может усилить заражение другим фагом. Окружающая среда микробиол
16:2168–2180. дои: 10.1111/1462-2920.12212. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Корнелиссен А., Сейссенс П.Дж., Т’Сиен Дж., Ван Прает Х., Нобен Дж.П., Шабурова О.В., Крылов В.Н., Волкерт Г., Лавин Р.
2011.
Родственный T7 фаг Pseudomonas putida ϕ15 проявляет свойства деградации биопленки, связанные с вирионами.
PLoS Один
6:e18597. doi:10.1371/journal.pone.0018597. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]36. Хьюз К.А., Сазерленд И.В., Джонс М.В.
1998.
Восприимчивость биопленки к атаке бактериофагов: роль фаговой полисахаридной деполимеразы. микробиология
144:3039–3047. дои: 10.1099/00221287-144-11-3039. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Балог Б., Джонс Д.Б., Момол М.Т., Олсон С.М., Обрадович А., Кинг П., Джексон Л.Е.
2003.
Повышена эффективность недавно разработанных бактериофагов для борьбы с бактериальной пятнистостью томатов.Завод Дис
87:949–954. doi: 10.1094/PDIS.2003.87.8.949. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 38. Ириарте Ф.Б., Балог Б., Момол М.Т., Смит Л.М., Уилсон М., Джонс Дж.Б.
2007.
Факторы, влияющие на выживаемость бактериофагов на поверхности листьев томатов. Appl Environ Microbiol
73: 1704–1711. doi: 10.1128/AEM.02118-06. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]39. Хаубен Л., Свингс Дж.
2005.
Род XIII. Эрвиния , стр. 670–679.
Роуч Д.Р., Сьяарда Д.Р., Сьяарда К.П., Айяла С.Дж., Хоукрофт Б., Касл А.Дж., Свирцев А.М.
2015.
Отсутствие лизогении в диких популяциях Erwinia amylovora и Pantoea agglomerans .Микроб Биотехнология
8: 510–518. дои: 10.1111/1751-7915.12253. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44. Лесснер М.Дж., Рудольф М., Шерер С.
1997.
Оценка репортерного люциферазы бактериофага A511:: luxAB для обнаружения Listeria monocytogenes в контаминированных пищевых продуктах. Appl Environ Microbiol
63:2961–2965. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]45. Мейген ЭА.
1993.
Бактериальная биолюминесценция: организация, регуляция и применение генов люкс .ФАСЭБ Ж
7:1016–1022. [PubMed] [Google Scholar]46. Кинг Э.О., Уорд М.К., Рэйни Д.Е.
1954.
Две простые среды для демонстрации пиоцианина и флуоресцеина. J Lab Clin Med
44:301–307. [PubMed] [Google Scholar] Янник Незе-Сеген станет музыкальным руководителем Метрополитен-опера | Классическая музыка
Метрополитен-опера в Нью-Йорке объявила, что Янник Незе-Сеген станет новым музыкальным руководителем труппы.
41-летний франко-канадский дирижер сменил Джеймса Левина, который занимал эту должность 40 лет, но уходит в отставку в конце текущего сезона.
Незе-Сеген официально не займет свою должность до сезона 2020-21 из-за существующих обязательств. В течение промежуточного периода Незе-Сеген становится музыкальным руководителем и будет дирижировать двумя операми в сезон, хотя с самого начала он будет участвовать в художественном планировании труппы. Левин станет почетным музыкальным руководителем.
Незе-Сеген дебютировал в Метрополитене в 2009 году, дирижируя оперой Бизе «Кармен» — «бодрящей, быстрой и свежей партитурой», от которой «певцы получили огромную пользу», — писал обозреватель New York Times.С тех пор Незе-Сеген дирижировал там «Дон Карлос», «Русалка» и «Травиата», а сезон 2015–2016 годов открыл «Отелло» Верди, о котором Wall Street Journal писал: , где великолепный дирижер Янник Незе-Сеген создал напряженную драматическую дугу».
Его дебют Вагнера в нью-йоркском театре состоится позже в этом же сезоне с постановкой «Летучий голландец».
Я считаю, что Метрополитен — величайшая оперная труппа в мире с лучшими ведущими певцами на планете.Янник Незе-Сеген
Несмотря на то, что он много дирижировал в Великобритании, Незе-Сеген мало оперировал в стране.Его выбор оркестрового и оперного репертуара в целом тяготеет к европейской музыке 19-го и начала 20-го века, его внимание к деталям и тонкое прикосновение привносят свежий взгляд на великие канонические произведения, такие как Малер, Мендельсон и Сен-Санс. Но «Русалка» в Ковент-Гардене весной 2012 года была встречена восторженными отзывами: «Дирижирование Незе-Сегена придает спектаклю драматическую форму: сначала размеренно, затем постепенно нарастает интенсивность, пока кульминация не станет поистине сокрушительной», — писал Эндрю Клементс в Guardian. .
Дирижер находится на полпути к записи оперы Моцарта для Deutsche Grammophon с Камерным оркестром Европы и продолжает работать по всему континенту, выступая в таких учреждениях, как Лондонский филармонический оркестр, Берлинский филармонический оркестр и Венский филармонический оркестр.
Его успешное пребывание в должности музыкального директора Роттердамского филармонического оркестра подходит к концу летом 2018 года.
В США он является музыкальным руководителем Филадельфийского оркестра с 2012 года: его контракт там недавно был продлен до 2025–2026 годов.
«Стать музыкальным руководителем Метрополитен-оперы — это исполнение моей заветной мечты, — сказал Незе-Сеген. «Я считаю [это] величайшей оперной труппой в мире с лучшими ведущими певцами на планете».
«Явным выбором был Янник, — сказал генеральный менеджер Питер Гелб. «Он тот художник, который поведет нас вперед, к новой главе в истории Метрополитена».
Джессика Филлипс, кларнетистка и председатель комитета Оркестра Метрополитена, сказала: «Оркестр Метрополитена поддерживает чрезвычайно плодотворные и позитивные отношения с маэстро Незе-Сегеном.Он олицетворяет … уважение к богатым традициям, которыми оперные низы по всему миру стали дорожить. Мы с нетерпением ждем совместной работы, чтобы сформировать эту новую эру в Метрополитене».
Незе-Сеген — всего лишь третий человек, получивший звание музыкального руководителя в истории Метрополитена. В 2020 году, когда он официально приступит к своим обязанностям, он будет проводить пять постановок за сезон, а также брать на себя художественную ответственность за оркестр, хор и музыкальный коллектив компании.
«Я сделаю своей миссией страстно сохранять самые высокие художественные стандарты, представляя себе новое светлое будущее для нашего вида искусства», — сказал Незе-Сеген в прямом эфире из Японии, где он в настоящее время находится в туре с Филадельфийским оркестром.«Я хочу, чтобы люди осознали, насколько важна опера в их жизни».
| Michael Rosean президент рынка
|
com 
com 
, Галерея Bid Project, Милан, IT 
..» Галерея Hole Of The Fox, Антверпен 
(2012) 
Лукас, Антверпен 
Оперы Орфея загромождают следующие четыре века; Великолепная версия 1647 года Луиджи Росси была выпущена в Джульярдской школе в начале этого месяца.
Избивающее беспокойство, которое вызывает в памяти Джона Адамса, разделяет рукопись с мягко поблескивающими колокольчиками; рифф на тему босса-новы в стиле лифтовой музыки с батареями хриплой перкуссии. 
Хор поет за кулисами. 
) Есть артисты с маленькими инструментами, которые тем не менее проникают в бескрайний Метрополитен; Morley’s делает это только в самых высоких нотах.
Это правда, звук сияющего голоса Орлински, создающий ореол вокруг крепких нижних строк Хопкинса, может быть довольно красивым. 
) Одно облегчение: текст проецируется во время пения на декорации Дэниела Остлинга, позволяя зрителям полностью сосредоточиться на действии. 
